Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .10
Глава 2. Материалы и методы .32
Глава 3. Результаты экспериментов по оптимизации методики лабораторных исследований 64
Глава 4. Влияние температуры на темпы развития и смертность 91
Глава 5. Влияние плотности и структуры кладки на темпы развития и смертность .97
Глава 6. Влияние условий эмбрионального периода на развитии головастиков до начала метаморфоза 137
Глава 7. Разработка методики проведения лабораторных экспериментов 158
Глава 8. Эксперименты по влиянию концентрации кислорода на темпы развития и смертность эмбрионов на основе разработанной методики 166
Глава 9. Обсуждение результатов 203
Выводы .222
Список литературы
- Результаты экспериментов по оптимизации методики лабораторных исследований
- Влияние температуры на темпы развития и смертность
- Влияние плотности и структуры кладки на темпы развития и смертность
- Влияние условий эмбрионального периода на развитии головастиков до начала метаморфоза
Введение к работе
Актуальность темы.
Амфибии издавна являются объектами как научной, так и практической деятельности человека. Практический интерес к земноводным как к перспективному объекту зоокультуры возник относительно недавно. Разработка методик культивирования амфибий требует выявления условий, позволяющих максимально эффективно использовать данный объект. Для этого необходимы масштабные экспериментальные лабораторные исследования по изучению экологических особенностей данной группы животных. Амфибии являются важным компонентом, как естественных экосистем, так и объектом хозяйственной деятельности человека. Во многих странах земноводные являются объектами промышленного разведения. Их дешевизна и широта спектра использования делают амфибий важнейшими лабораторными животными, обычными объектами практических занятий в школе, в медицинских и биологических вузах. Однако в нашей стране промышленное разведение амфибий еще не освоено.
Амфибии все чаще используются в качестве биоиндикаторов для оценки состояния антропогенно-нарушенных экосистем, что определяется их широким распространением, а также способностью заселять нарушенные местообитания (Лебединский, 1984; Вершинин, 1985, 1997; Пескова, 2002, 2004). Амфибии также широко используются как объект биотестирования. Разработаны методики по биотестированию с использованием эмбриональных и личиночных стадий развития амфибий: FETAX, AMPHITOX. Амфибии в сильной степени зависят от внешних условий и поэтому являются хорошими индикаторами состояния окружающей среды, в том числе качества воды (Северцов, 1999).
Одним из важных и перспективных направлений является использование амфибий в качестве модельных, экспериментальных или учебных объектов в биологии и медицине. Для исследований в лабораторных условиях воздействий различных факторов используют как эмбриональные (Бадтиев и др., 2008; Мытыева и др., 2007; Herkovits et al., 1997; Merila et al., 2000; Rohr et al. 2006), так и личиночные (Северцова, 2009; Ferrari et al., 2005; Little et al., 2003; Coady et al. 2004; Cauble, Wagner 2005; Teplitsky et al., 2005; Mandrillon, Saglio, 2007) стадии развития амфибий.
Эмбриональные и личиночные стадии развитие любого животного - один из самых критических периодов онтогенеза в отношении влияния среды на организм. Развивающийся и растущий организм наиболее всего подвержен влиянию внешних условий. Взрослые особи менее чувствительны к различным возмущающим факторам, чем особи в период эмбрионального и личиночного развития (Айверсон, 1979). На стадиях от икры до завершения метаморфоза наблюдается наиболее значительная смертность особей. Влияние среды, положительное или негативное проявляется в этот период в наибольшей степени, что позволяет с максимальной достоверностью регистрировать эффект от такого влияния. Это является важной теоретической предпосылкой для выбора этих этапов онтогенеза в качестве предмета исследования. С практической точки зрения (в условиях зоокультуры), необходимо добиваться оптимальных темпов роста и развития при минимальной смертности именно на этапах получении икры и разведении личинок, так как организм в эти периоды сильнее всего подвержен воздействию внешних факторов. Таких результатов можно добиться лишь в случае оптимизации условий культивирования.
Таким образом, для использования в лабораторных условиях эмбриональных и личиночных стадий развития целесообразно оптимизировать методику их содержания с учетом особенностей биологии вида (такие как структура кладки, оптимальная температура развития и др.). Для проведения лабораторных экспериментов по влиянию различных факторов на развитие амфибий сначала требуется установить, какие особенности биологии вида влияют на результаты проводимых экспериментов и каким образом можно минимизировать неоднородность этих воздействий в процессе проведения экспериментов.
В качестве объекта исследований использовалась серая жаба (Bufo bufo). Данный вид обладает удобными для исследования признаками, широко распространен, его состояние характеризует структурную трансформацию батрахокомплексов в условиях урбанизации (Вершинин, 2008). Эмбриональные и личиночные стадии развития серой жабы легко наблюдать как в природных, так и в лабораторных условиях.
Исходя из вышеизложенного, целью работы является экспериментальное исследование влияния ряда факторов на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы (Bufo bufo) для разработки методики проведения лабораторных экспериментов и оптимизации условий культивирования при разведении серой жабы в лабораторных условиях.
Задачи исследования.
-
Исследовать в лабораторных условиях влияние ряда факторов (температуры, плотности и структуры кладки) на эмбриональное и личиночное развитие серой жабы.
-
На основе полученных результатов разработать методику проведения лабораторных экспериментов на эмбриональных и личиночных стадиях развития, а также повышающую эффективность выведения молоди серой жабы для хозяйственных нужд.
-
Исследовать влияние концентрации растворенного кислорода на эмбриональное развитие серой жабы с использованием разработанной методики.
Научная новизна работы.
Разработана новая методика по выявлению влияния ряда факторов среды на эмбриональные и личиночные стадии развития серой жабы
Впервые с помощью разработанной методики выявлены различные типы плотности развивающейся икры: «поверхностная», «объемная», «линейная» и плотность, заданная укладкой икряного шнура. Показано, что «поверхностная» и «линейная» плотности оказывают существенное влияние на темпы развития и смертность эмбрионов, в отличие от «объемной» плотности. Также впервые показано, что в эмбриогенезе серой жабы существует два типа реакций на повышение поверхностной плотности: монотонное и немонотонное изменение смертности.
Установлено, что при одиночном развитии икринок недостаток кислорода не ведет к увеличению смертности в эмбриогенезе серой жабы, а лишь сдвигает смертность на более ранние стадии развития. При большой «поверхностной» плотности икры в условиях недостатка кислорода смертность к моменту выклева личинок существенно возрастает.
Установлено, что условия среды в период эмбрионального развития оказывают влияние на формирование ряда морфометрических признаков головастиков серой жабы.
Практическое значение.
Практическое значение работы связано с возможностью использования эмбрионов серой жабы в качестве модельного объекта для лабораторного тестирования при изучении влияния различных антропогенных воздействий. Разработанная методика может быть использована для тестирования в лабораторных условиях различных факторов, влияющих на темпы роста и развития, а также на смертность эмбриональных и личиночных стадий развития серой жабы.
Кроме того, использование разработанной методики может быть рекомендовано для практического применения в области культивирования земноводных, в частности для содержания икры серой жабы в лабораторных условиях: использование предложенной методики способно заметно снизить смертность в эмбриональный период, поэтому результаты данного исследования могут быть полезны при организации зоокультуры амфибий.
Материалы работы могут быть использованы при составлении лекционных курсов по экологии на естественнонаучных факультетах МГУ им. М.В. Ломоносова и других вузов, поддерживающих данное научное направление.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Существенное влияние на темпы развития и смертность эмбрионов серой жабы оказывает плотность икры, обусловленная ее структурой кладки.
-
Условия эмбрионального развития оказывают влияние на формирование морфометрических признаков головастиков серой жабы.
-
Недостаток растворенного в воде кислорода оказывает существенное влияние на смертность и темпы развития эмбрионов лишь при высокой «поверхностной» плотности развивающейся икры.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены II съезде Герпетологического общества им. А.М. Никольского (Санкт-Петербург, 2003); на 10-м конгрессе европейского общества эволюционной биологии (Краков, Польша, 2005), на 1-й (Прага, Чехия, 2006), 2-й (Гент, Бельгия, 2008) и 4-й (Лиссабон, Португалия, 2012) международной конференциях европейского общества эволюционной биологии развития; на 12-м (Санкт-Петербург, 2003), 14-м (Порто, Португалия, 2007) и 15-м (Кушадасы, Турция, 2009) конгрессах Европейского герпетологического общества.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 246 страницах машинописного текста, состоит из введения, 9 глав, выводов. Работа иллюстрирована 66 таблицами и 50 рисунками. Список литературы включает 214 источников, в том числе 107 на иностранных языках.
Результаты экспериментов по оптимизации методики лабораторных исследований
Как уже говорилось выше, для оптимизации методики проведения лабораторных исследований с эмбрионами серой жабы был поставлен ряд экспериментов. Задачей этих экспериментов являлось выяснение лабораторных факторов, которые оказывают влияние на результаты проводимых опытов с целью минимизации влияния этих факторов в дальнейших экспериментах.
Как известно, проведение измерений через равные промежутки времени, существенно снижает объем выборки, необходимый для достижения нужного уровня точности проводимых исследований. Для определения оптимального интервала времени проведения измерений, через который целесообразно проводить измерения в экспериментах, были проведены измерения при одинаковых плотностях развития через разные промежутки времени. При температуре 17,6C время развития от момента завершения икрометания, который принимался за 0, до момента вылупления составило примерно 120 часов. В первом эксперименте интервалы времени проведения измерений составили 24, 12 и 8 часов. По результатам подсчета умерших эмбрионов были построенные графики (рис. 3.1.).
Как видно из графиков динамики смертности интервал проведения экспериментов 24 часа является недостаточным для проведения эксперимента. Детализация динамики смертности от стадии формирования нервной пластины II(9) до стадии вылупления III(2) (Cambar, Gipouloux, 1956), когда на смертность и развитие эмбрионов начинает оказывать влияния средовая компонента, явно недостаточна. Несколько лучше обстоит дело при интервалах времени 12 часов, динамика просматривается лучше, точнее отображается реальная картина смертности. Наиболее точная картина видна при интервалах измерений – 8 часов. Таким образом, в данном эксперименте оптимальное время проведения измерений – 8 часов.
Аналогичная картина наблюдается при изучении динамики развития эмбрионов серой жабы (рис. 3.2.). При интервале проведения измерений 24 часа мы явно пропускаем ключевые стадии развития, на которых на смертность и темпы развитие эмбрионов все большее влияния оказывает средовая компонента. Т.е. с момента образования нервной трубки до момента вылупления мы пропускаем несколько ключевых стадий. Как видно из рисунка 3.2. при интервале измерений 24 часа пропущена также сама стадия вылупления, так как проведение последнего измерения происходит примерно через 140 часов с момента начала эксперимента. Как уже говорилось выше, при температуре 17,6 C нормальное развитие серой жабы от момента оплодотворения до вылупления длится примерно 120, поэтому детализация проведения измерений 1 раз в 24 часа является явно недостаточной.
При интервале проведения измерений 12 часов картина выглядит лучше (рис. 3.2.). Однако на последних стадиях развития, непосредственно перед вылупление и в процессе детализация проведения измерений опять же явно недостаточна. Лучше всего динамика развития отражается на графике с интервалом 8 часов. На этапе развития от стадии формирования нервной пластины II(9) до стадии вылупления III(2) (Cambar, Gipouloux, 1956) хорошо различимы «на глаз», без использования увеличительных проборов, стадии развития II(10)-II(11), II(12), II(13), III(1), III(2), III(3) (Cambar, Gipouloux, 1956). Таким образом, для более тщательного исследования динамики развития эмбрионов серой жабы целесообразно проводить измерения проводить измерения через 8 часов.
В следующем эксперименте по детализации времени проведения измерений использовались интервалы времени 6, 8 и 10 часов. В данном эксперименте было использовано 2 кладки серой жабы. Как видно из графиков динамики смертности эмбрионов серой жабы (рис. 3.3.) при подобных интервалах проведения измерений детализация эксперимента существенно не изменяется, т.е. наблюдаемая картина динамики смертность существенно не улучшается. Однако при 8-часовом интервале проведения измерений лучше планируется динамика проведения измерений, тогда как при 10-часов интервале время проведения измерений в течение суток все время будет смещаться в течение эксперимента.
Изменение интервала времени проведения измерений от 6-ти до 10 часов не приводит к получению новых данных в процессе проведения измерений индекса уровня развития эмбрионов серой жабы, т.е. детализация эксперимента не изменяется. Таким образом, проводить измерения по подсчету количества умерших эмбрионов и индексу уровня развития удобнее либо через 8, либо через 6 часов. Тогда можно спланировать время проведения измерений в течение суток, что существенно облегчает работу. Однако, эксперимент с более подробной детализацией (интервал проведения измерений через каждые 6 часов) показал, что увеличение детализации процесса не ведет к увеличению точности проводимых измерений. Однако это существенно затрудняет работу, так как эксперимент длится в течение нескольких суток (5-10 суток). При этом увеличивается утомляемость экспериментатора, что может привезти к снижению точности проводимых измерений. При 10-ти часовом интервале время проведения измерений будет сдвигаться по времени в течение суток, что существенно затрудняет планирование эксперимента. В результате проведенных экспериментов можно сделать вывод, что оптимальным интервалом проведения измерений будет 8 часов.
Влияние температуры на темпы развития и смертность
Серая жаба по разным данным откладывает от 1200 до 7200 икринок (Кузьмин, 2012), икрометание осуществляется как в постоянные, так и во временные водоемы. Кладка серой жабы представляет собой тяжи длиной до 10 м (Дунаев, 1999), различным образом распределенные в водоеме. Икра откладывается в виде шнуров, которые оплетают подводные предметы или лежат на дне. Икринки уложены в шнуре по спирали (рис. 5.1.).
Чаще всего, в процессе икрометания самка жабы натягивает икряной шнур между стеблями водной растительности или различными подводными предметами (Глава 2, рис. 2.5). В небольших прудах количество подходящих мест для откладки икры ограничено, поэтому шнуры икры переплетаются, наматываются поверх других, образуя плотные скопления. Таким образом, плотность, при которой происходит эмбриональное развитие, в разных частях кладки неравномерна: часть кладки представляет собой плотные клубки из намотанных друг на друга шнуров, а часть свободно лежит на дне или натянута между стеблями водной растительности. Кроме того, отдельные икринки могут выпадать из икряного шнура при его разрыве или во время откладки икры. Таким образом, условия развития эмбрионов в разных условиях плотности, обусловленной структурой кладки и особенностями икрометания серой жабы, могут влиять на их смертность и темпы развития. Эксперименты по изучению влияния одиночного развития эмбрионов на их смертность и темпы развития показали следующее. При одиночном выращивании отдельных икринок наблюдается высокая синхронность развития эмбрионов, индекс уровня развития для всех эмбрионов составляет максимально возможный 7,0 (табл. 5.1.). Вылупление во всех аквариумах с одиночно развивающимися икринками наступало одновременно (например, в 2002-м году - через 95 часов после посадки) (Dmitrieva, 2005а). Таким образом, при одиночном выращивании эмбрионов серой жабы наблюдаются одинаковые темпы развития для всех развивающихся эмбрионов и высокая выживаемость. Смертность отдельно развивающихся эмбрионов очень низкая, выживаемость составляет от 96,67 до 100 % (табл. 5.1.). Следовательно, данные условия развития являются практически идеальными для эмбрионов серой жабы. Результаты экспериментов показали, что с увеличением поверхностной плотности икринок выше 120 на 0.13 л смертность эмбрионов всегда монотонно возрастает, при плотности посадки 480 икринок на аквариум выживаемость эмбрионов составляет всего 1,7%, а при 960 вообще равна нулю (табл. 5.2., рис.5.2.). Наибольший процент выживших эмбрионов наблюдается при плотности посадки 30 и 120 икринок на аквариум, что составляет 66,7% и 63,3% соответственно. При плотности же 60 икринок на аквариум смертность резко возрастает, выживаемость к моменту вылупления составляет всего 27,5% . Индекс уровня развития во всех кладках имеет монотонную зависимость от поверхностной плотности (рис. 5.3., табл. 5.3.) – чем выше плотность, тем больше отстающих по развитию эмбрионов, тем ниже индекс уровня развития или различия по этому показателю недостоверны (р 0.05). Как видно из графика (рис 5.3.), темпы развития с увеличением «поверхностной» плотности несколько снижаются. Индекс уровня развития во всех кладках имеет монотонную зависимость от плотности посадки – чем выше плотность, тем больше отстающих по развитию эмбрионов. Таким образом, с увеличением плотности увеличивается количество отстающих в развитии эмбрионов, что соответственно отражается на показателе «индекс уровня развития». Условия развития при плотности 960 икринок на 0.13 л оказались наиболее критичными для развития и выживания эмбрионов серой жабы: начиная с 60-го часа развитие практически остановилось на стадии гаструлы (рис. 5.3.), а затем началась массовая, практически одномоментная, гибель эмбрионов. В этом эксперименте были созданы заведомо невыгодные условия развития, чтобы установить пределы реагирования эмбрионов серой жабы на повышенную плотность. В условиях высокой плотности 480 икринок на 0.13 л также наблюдалась задержка развития (рис. 5.3., табл. 5.3.), однако некоторый процент эмбрионов (1,7%) все-таки развился до стадии вылупления (рис.5.2., табл. 5.2.). Таким образом, при большой начальной плотности посадки икринок наблюдается замедление темпов развития, и массовая гибель икринок наступает на более ранних стадиях эмбрионального развития, чем при низкой начальной плотности посадки. При меньшей плотности икринок наибольшая смертность икринок наблюдается непосредственно перед вылуплением (рис. 5.3.).
При большой начальной поверхностной плотности посадки икринок наблюдается замедление темпов развития, и массовая гибель икринок наступает раньше по времени, чем при низкой поверхностной плотности посадки (рис. 5.4.), т.е. на более ранних стадиях эмбрионального развития. Как уже говорилось выше, данный эксперимент позволил выявить критические значения плотности развития для дальнейшей постановки аналогичных экспериментов. В 2003 и 2004 г. диапазон изучаемых значений плотности был расширен в сторону уменьшения, и плотность посадки составила в 2003 г.: 4, 8, 15, 30, 60, 120 и 240 эмбрионов на аквариум, а в 2004 г.: 8, 15, 30, 60, 120 эмбрионов на аквариум соответственно. Результаты этого эксперимента подтвердили выводы, полученные в 2002 г. (табл. 5.4.). В диапазоне значений плотности 4–15 икринок на аквариум наблюдается некоторая немонотонная зависимость выживаемости от начальной плотности и относительно большая дисперсия по смертности при малых плотностях (табл. 5.4). Таким образом, различия по выживаемости при различных плотностях являются недостоверными при p 0,05. Как было показано в экспериментах по влияния воздействий экспериментатора на результаты проводимых экспериментов, максимальная выживаемость эмбрионов наблюдается в условиях, когда они развиваются без любого дополнительного воздействия. В экспериментах с малой плотностью икры слишком сильно сказывается эффект воздействия экспериментатора на эмбрионы при отделении их от основной кладки. Поэтому при малых плотностях наблюдается высокая вариабельность по смертности, и соответственно возрастает дисперсия по данному признаку. Индекс уровня развития во всех исследованных кладках так же, как и в кладке 2002 года, имеет монотонную зависимость от поверхностной плотности (табл. 5.5.). Поскольку при плотности посадки от 30 до 120 икринок на аквариум (рис.5.2.) наблюдается немонотонная зависимость выживаемости эмбрионов серой жабы от плотности, в 2003-2004 годах исследования проводились в первую очередь в этом диапазоне. Как видно из этих данных (табл. 5.4.), у большей части кладок наблюдается монотонная зависимость выживаемости от начальной плотности посадки: чем больше начальная плотность, тем ниже выживаемость. Однако ряд кладок (например, кладка №1 2004 года) выбивается из этой картины. Как видно из таблицы 5.4. смертность в этих кладках несколько выше, чем во всех остальных кладках, и зависимость смертности от плотности имеет немонотонный характер. Так, в кладке №1 2004 года выживаемость икринок при плотности 60 икринок на 0.133 л составляет 32.08±5,93% от начального количества и достоверно меньше (р 0,05), чем при плотности 30 и 120 икринок на аквариум (42.92±4,24% и 59.58±16,08% соответственно). Таким образом, в диапазоне значений плотности от 30 до 120 икринок на 0.13 л в кладке №1 2004 года наблюдается нелинейная зависимость выживаемости от начальной плотности, то есть в этой кладке наблюдается такой же тип зависимости от плотности, как и в первом эксперименте.
В первом эксперименте наибольший процент выживших эмбрионов наблюдается при плотности посадки 30 и 120 икринок на 0.133 л, что составляет 66,7% и 63,3% соответственно, а при плотности 60 икринок на 0.133 л смертность возрастает, и процент выживших эмбрионов составляет всего 27,5% (табл. 5.2.). Данные регрессионного анализа также показывают нелинейную зависимость выживаемость от начальной плотности в диапазоне от 30 до 120 икринок на 0.133 л (табл. 5.6., 5.7., рис. 5.5. а).
Результаты линейной регрессии (Linear Regression) показывают, что зависимость выживаемости от начальной плотности посадки в четырех из шести кладок (обе кладки 2003 и кладки №2, 3 2004 гг.) линейная (табл. 5.6.). В диапазоне значений от 30 до 120 икринок на 0.133 л зависимость выживаемости от плотности линейна (рис. 5.5 б, в, д, е). Напротив, зависимость в кладке №1 2004 г. и кладке 2002 г. отличается от линейной (табл. 5.6.), и лучше описывается нелинейными функциями, например, квадратичной (табл. 5.7.), а в диапазоне значений от 30 до 120 икринок на аквариум имеют точку перегиба (рис. 5.5. а, г).
Влияние плотности и структуры кладки на темпы развития и смертность
В кладке №5 зависимость выживаемости от начальной плотности посадки одинаково плохо описывается и линейной, и квадратичной функцией из-за большой дисперсии. Однако, как видно из рисунка 8, по средним значениям эта кладка ближе к немонотонной зависимости. Таким образом, в экспериментах, полученных от производителей из Шараповского болота, примерно от 17 до 33% случаев наблюдается немонотонная зависимость выживаемости эмбрионов к моменту вылупления от начальной плотности посадки икры (рис. 5.11.).
Итак, в результате экспериментов, проведенных на икре, полученной от производителей из 3-х различных водоемов, наблюдается два вида зависимости выживаемости эмбрионов серой жабы от поверхностной плотности. В первом случае такая зависимость является монотонной, то есть с увеличением плотности увеличивается и эмбриональная смертность. Во втором случае зависимость выживаемости от плотности имеет выраженный немонотонный характер, возникает второй максимум выживаемости эмбрионов при повышенной (120 икринок на аквариум) плотности. Данные регрессионного анализа подтверждают это. В первой группе с повышением плотности икры средние темпы развития снижаются, а смертность эмбрионов возрастает. Во второй группе зависимость выживаемости от плотности имеет выраженный немонотонный характер, в диапазоне значений от 30 до 120 икринок на аквариум возникает второй максимум выживаемости. Второй вид зависимости наблюдается в кладках, в которых смертность эмбрионов достаточно высока, т.е. общая жизнеспособность кладки ниже, чем в кладках с монотонной зависимостью смертности от плотности. Однако вторая группа кладок получает преимущество при повышенной плотности. Первый вид зависимости – монотонная – наблюдается в 70% исследованных кладок, а вторая – немонотонная – в 30% кладок. Таким образом, мы выявили две стратегии выживания для кладок серой жабы, различающиеся по жизнеспособности, которая не обусловлена влиянием условий внешней среды, а только особенностями самих кладок. Ранее подобное явление не было описано ни у одного вида амфибий.
Выявленные два типа реакции на повышение плотности не обнаружены у кладок, полученных от производителей, отловленных на озере Глубокое, в отличие от 2-х других водоемов. Следует отметить, что во всех исследованных кладках из озера Глубокое выживаемость была достаточно высока (выше 90%). Таким образом, при постановке экспериментов необходимо учитывать локальные приспособления, которые могут возникать в популяциях, из которых берется материал для исследований.
В процессе откладки икры серая жаба старается растянуть икряные шнуры между различными подводными предметами (Глава 2, рис. 2.4., 2.5.). Т.е., помимо того, что самка в процессе откладки старается распрямить икряные шнуры, она старается их максимально натянуть. Следовательно, условия развития в натянутом икряном шнуре должны быть оптимальными для развития эмбрионов серой жабы. Такую картину мы можем наглядно наблюдать в эксперименте по исследованию натяжения икряного шнура или «линейной плотности» (рис. 5.12).
По результатам экспериментов 2002 года смертность в натянутых икряных шнурах составила 89.34±1.84, а в ненатянутых 66.7±6.67, а индекс уровня развития 6.00±0.00 и 5.98±0.04 соответственно. При развитии эмбрионов в натянутом икряном шнуре наблюдаются высокая выживаемость и высокая синхронность развития отдельных эмбрионов (табл. 5.15., 5.16.). Темпы развития в натянутых икряных шнурах достоверно выше, чем в ненатянутых (табл. 5.16.). В условиях натянутого икряного шнура индекс уровня развития практически такой же, как для отдельно развивающихся икринок (табл.5.1). Таким образом, в натянутых икряных шнурах в условиях низкой линейной плотности условия развития отдельных эмбрионов близки к идеальным, когда смертность минимальна, а индекс уровня развития максимален. Данные 2-факторного дисперсионного анализа показывают, что натяжение икряного шнура оказывает существенно влияние на индекс уровня развития эмбрионов серой жабы (табл. 5.17). Фактор же кладки не оказывает существенного влияния на это параметр. Таким образом, натяжение икряного шнура оказывает существенное влияние на темпы развития эмбрионов и это влияние не зависит от кладки, из которой эти эмбрионы получены Как уже говорилось выше, кладка серой жабы представляет собой икряной шнур длиной до 10 м, диаметром до набухания 5-7 мм (Флякс, 1981), икринки сближены между собой, уложены по спирали в икряном шнуре (рис. 5.1.). «Плотность», обусловленная самой структурой кладки серой жабы, при которой происходит эмбриональное развитие, в разных частях кладки неравномерна: часть кладки представляет собой плотные клубки из намотанных друг на друга шнуров, а часть свободно лежит на дне или натянута между стеблями водной растительности (Глава 2, рис. 2.4., 2.5.). Таким образом, на развитие и смертность эмбрионов в кладке серой жабы в процессе развития определяется также «укладкой» икряного шнура, его распределением в определенном объеме воды (рис. 5.14.). В результате проведенных экспериментов по исследованию влияния «укладки» икряного шнура на смертность и темпы развития удалось показать следующее. По данным статистического анализа (тест Манна-Уитни) в 6 кладках из 9 исследованных смертность в прямых и свернутых шнурах достоверно не различается, а в трех кладках смертность зависят от укладки икряного шнура (табл. 5.18). В кладках №4 в 2005-м году, кладках №3 и №5 2010 года в распрямленных икряных шнурах смертность достоверно (р 0,05) ниже, чем в свернутых. В остальных же кладках различия по смертности между распрямленными и свернутыми шнурами недостоверными. В этих кладках в распрямленных икряных шнурах смертность достоверно (р 0.05) ниже, чем в свернутых. Результаты анализа показывают, что смертность к моменту вылупления достоверно зависит от укладки шнура и не зависит от объема воды, в котором они развиваются. И прямые, и свернутые икряные шнуры, полученные из кладки 4, развивающиеся в разном объеме воды, достоверно не различаются (табл. 5.19). Таким образом, смертность более зависит от укладки икряного шнура, чем от объема воды, в котором они развиваются. Динамика смертности в прямых и свернутых шнурах достоверно не различается (рис. 5.15). Динамика смертности больше обусловлена особенностями отдельных кладок, чем различиями между прямыми и свернутыми икряными шнурами. При сравнении влияния на темпы развития и смертность икры из разных кладок по сравнению с аналогичным влиянием из одной кладки, не выявлено достоверных различий. Динамика смертности, темпы развития и результирующая смертность не зависит от того, из одной или разных кладок сближены икряные шнуры (табл. 5.18., рис. 5.15.). При сравнении сближенных шнуров из кладок 2 и 3 с распрямленными шнурами из соответствующих кладок достоверно не отличается от свернутых шнуров из кладок 2 и 3 (табл. 5.18.). При сравнении этих шнуров с распрямленными икряными шнурами из кладок 2 и 3 сохраняется та же картина, что и при сравнении свернутых и распрямленных шнуров внутри одной кладки (табл. 5.18.). Динамика смертности, темпы развития и результирующая смертность не зависит от того, из одной или разных кладок сближены икряные шнуры (рис. 5.15. л). Таким образом, в данном эксперименте мы наблюдаем 2 вида зависимости по реакции на «плотность», заданную укладкой икряного шнура. Одна треть из исследованных кладок реагируют на «уплотнение» икряных шнуров, т.е. результирующая смертность достоверно выше в свернутых икряных шнурах, по сравнению с распрямленными. Две трети исследованных кладок достоверно не реагируют на «плотность», заданную укладкой икряного шнура.
Влияние условий эмбрионального периода на развитии головастиков до начала метаморфоза
При плотности посадки 120 икринок на 0.532 л объем воды в пересчете на один эмбрион составляет примерно 4 мл, а при плотности 30 икринок на 0.532 л – примерно 17.7 мл. Соотношение объема воды в пересчете на одну икринку при разной высоте столба воды между плотностью посадки 120 и 30 икринок остается постоянным, однако общий объем воды на одну икринку увеличивается. Так, при объеме воды 0.13 л он составляет при плотности посадки 120 икринок – примерно 1 мл на икринку, а при плотности 30 икринок – примерно 4 мл.
Таким образом, собственно «объемная плотность» (число икринок в единице объема воды) не оказывает существенного влияния на смертность и темпы развития икринок серой жабы. То есть, при оценке влияния плотности посадки на смертность и темпы развития эмбрионов серой жабы имеет смысл учитывать либо поверхностную, либо линейную плотность, так как объемная плотность не оказывает существенного влияния на рассматриваемые показатели.
По результатам проведенных экспериментов можно сделать вывод, что идеальными условиями для развития икринок серой жабы является одиночное развитие. При этом не имеет большого значения, в каком объеме воды происходит развитие эмбрионов, если не допускать полного пересыхания. Однако в природных популяциях такие условия развития трудно себе представить, за исключением случаев выпадения отдельных икринок из икряного шнура. Наиболее близки к идеальным условия в икряном шнуре, натянутом между стеблями водной растительности. Тогда отдельные эмбрионы располагаются относительно удаленно друг от друга. В лабораторных экспериментах самые лучшие условия развития наблюдались у эмбрионов серой жабы, которые располагаются в натянутом икряном шнуре. В таком состоянии смертность отдельных эмбрионов минимальна, а индекс уровня развития достаточно высок, и наблюдается высокая синхронность развития отдельных эмбрионов (табл. 5.2.). Т.е. в натянутом икряном шнуре отдельные эмбрионы развиваются практически как одиночно развивающиеся икринки.
Для того чтобы определить, как сказываются эмбриональные стадии развития на личиночных, была поставлена следующая серия экспериментов. Для опытов на развивающихся головастиках серой жабы были использованы личинки, вылупившиеся в лабораторных условиях при проведении экспериментов по исследованию разных аспектов влияния плотности и структуры кладки. В качестве показателей влияния условий эмбрионального периода на личиночное развитие использовались смертность и морфометрические признаки головастиков.
Головастики для эксперимента были получены от одной кладки производителей. Для экспериментов на развивающихся головастиках серой жабы были использованы личинки, полученные в лабораторных условиях из ранее проведенных экспериментов по исследованию разных аспектов плотности и структуры кладки: 1. Эксперименты с разной поверхностной плотностью эмбрионов (30, 60 и 120 икринок на аквариум); 2. Эксперименты с разной линейной плотностью (по 30 икринок в икряном шнуре, развивающиеся в натянутом и ненатянутом состоянии) 3. Эксперименты с одиночно развивающимися эмбрионами. Опыт – раз в сутки проводилась замена половины воды в аквариуме на аналогичный объем, взятый из аквариума с эмбрионами, развивающимися при повышенной плотности посадки. Контроль – замены или перемешивания воды не проводилось. Вылупившиеся головастики были разбиты на 2 группы с плотностью посадки по 2 и 5 особей на 0.27 л (см. Материалы и методы) для того, чтобы создать разные условия для оценки влияния эмбриональных стадий развития на личиночные. Развивающиеся головастики выделяют в воду различные продукты метаболизма, которые тормозят их рост и развитие, т.о. повышение плотности должно приводить к ингибированию роста и развития. По окончании эксперимента все головастики одномоментно были зафиксированы в 4% формалине для последующих измерений. Основная масса головастиков (более 90%) находилась на стадии формирования задней конечности IV(4) (Cambar, Gipouloux, 1956). Результаты проведенных измерений приведены в таблице 6.1. Головастики, развивающиеся при плотности 2 особи на аквариум, во всех экспериментах крупнее головастиков, развивающихся при плотности 5 особей на аквариум (табл. 6.2., 6.3., 6.4.). В экспериментах на головастиках, полученных из экспериментов с разной поверхностной и линейной плотностью эмбрионов, головастики при плотности 2 особи на аквариум по всем измеряемым признакам достоверно крупнее головастиков при плотности 5 особей на аквариум (табл. 6.2., 6.3.). Головастики, развивавшиеся на эмбриональных стадиях развития в условиях разной поверхностной и линейной плотности, достоверно различаются по всем исследованным признакам в условиях разной плотности посадки (2 и 5 головастиков на аквариум). Головастики, полученные из экспериментов на одиночно развивающихся эмбрионах серой жабы, при разной плотности достоверно различаются лишь по признаку Lh (табл. 6.4.). Различия по L недостоверны, очевидно, из-за малой выборки, так как корреляция между этими признаками очень высока (r =0,99; p 0,05). По La различия недостоверны.
