Содержание к диссертации
Введение
1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ПРОБЛЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 11
1.1. Характеристика условий экосистемы Азовского бассейна как среды обитания тарани 11
1.2. Биологические и экологические особенности азовской тарани Rutіlus rutilus heckeli (Nordman) 22
1.3. Современные представления о подразделенности популяций разных видов рыб и экологические предпосылки их образования 31
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 57
2.1. Структура исследования и материалы 57
2.2. Электрофорез белковых ферментативных и неферментативных систем 60
2.2.1. Подготовка образцов для электрофореза 61
2.2.2. Электрофорез образцов 61
2.3. Методы гистохимического окрашивания образцов 65
2.4. Методы популяционно-генетических исследований 66
2.5. Изучение метрических признаков тарани 69
2.6. Методы исследования физиологического состояния рыб 71
2.7. Дискриминантный анализ 72
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 74
3.1. Биохимический полиморфизм белковых систем азовской тарани 74
3.2. Анализ популяционной структуры азовской тарани 83
3.3. Влияние экологических и антропогенных изменений в бассейне Азовского моря на межгодовые колебания частот аллелей и фенотипов 98
3.4.Оценка физиологического состояния популяции азовской тарани 105
3.5. Дискриминантный анализ данных по физиологическому состоянию популяции тарани 116
3.6. Изменчивость популяции азовской тарани по комплексу фенотипических признаков 121
3.7. Влияние экологических факторов на подразделенность популяции азовской тарани 127
ВЫВОДЫ 138
ЛИТЕРАТУРА 139
- Характеристика условий экосистемы Азовского бассейна как среды обитания тарани
- Структура исследования и материалы
- Биохимический полиморфизм белковых систем азовской тарани
Введение к работе
Актуальность исследования. По современным представлениям популяция — это структурная часть биоценозов, составляющих биосферу, и одновременно — единица эволюционного процесса. Она же и объект хозяйственной деятельности человека.
Стратегия рыбного хозяйства основывается на эксплуатации больших скоплений рыб, которые экономически выгодно облавливать. Тем самым нарушается научная основа промысла, так как облов ведется без учета популяционной структуры вида. В этом случае происходит разрушение популяционной системы по частям за счет перелова одних и недолова других субпопуляций, нарушается адаптивная генетическая структура вида (Алтухов, 1983; Поддубный, Малинин, 1983).
Пространственно-временная разобщенность разнокачественных внутрипопуляционных группировок особей выступает важным фактором повышенной устойчивости локальных стад и требует особого внимания к сохранению оптимальной в данных условиях структуры местных популяций (Поддубный, Халько, 1990). Подразделенность многих природных популяций рыб на элементарные единицы очевидна уже из геногеографиче-ских наблюдений. С помощью метода электрофореза белков, позволяющего изучать отдельные генные локусы, исследования морфо-биологических характеристик, изучения физиолого-биохимических особенностей организмов, использования массового мечения и других методов показано наличие подразделенности популяций многих промысловых видов рыб (Алтухов, 1995; Алтухов, Бланк, 1999; Глубоковский, Животовский, 1986; 1989; Иванков, 1993; Касьянов, 1985; Кузьмина, 1990; Кузьмина, Голованова, 1990; Лукьяненко, 1990; Поддубный, 1980; Поддубный, Малинин, 1988; Поддубный, Халько, 1990; Салменкова, Малинина, 1976; Салменко-ва, Омельченко, Алтухов, 1992; Сергеева, Борякина 1996; Дехта, Сергеева,
1998; Савваитова, Кузищин, Максимов, 1997; Ashbaush et. al., 1994; Beacham, 1985; Grant et. al., 1987; Misra, Carscadden, 1987; Torrisen, 1987).
Ареал обитания азовской тарани обширен: она встречается в прибрежной зоне восточной и северо-восточной частей Азовского моря, основная часть скоплений в настоящее время распределяется в Таганрогском заливе, включая Ейский лиман и дельту реки Дон, в Ахтарском морском районе с Бейсугским и Ахтарским лиманами, в Ачуевском и Темрюкском морских районах (Воловик, 1998; Агапов, 1998).
Популяция азовской тарани уже несколько десятилетий находится в угнетенном состоянии (Цуникова и др., 1996; 1997). Влияние экологических изменений, связанных с гидростроительством и антропогенным загрязнением, интенсивный перелов старшевозрастных групп, как официальным ловом, так и браконьерским, в несколько раз превышающим первый, снижение масштабов воспроизводства приводят к резким колебаниям эффективной численности популяции, что неизбежно сказывается на ее системной организации.
В ситуации затянувшейся депрессии и нестабильности численности популяции принципиально ставится вопрос о нарушении сложной популя-ционной структуры азовской тарани. Ее промысел ведется в основном на местах массовых скоплений, без учета подразделенности вида на репро-дуктивно-изолированные субпопуляции.
Очевидно, что изучение структуры азовской тарани с применением различных методологических подходов и определение условий и мест ее воспроизводства будет способствовать углублению знаний о состоянии природных популяций, их ответа на изменения экологической обстановки, но оно также важно и с прикладных позиций. Ранее комплексное изучение этого вида в Азовском бассейне не проводилось. Особенности географии ареала, экологии района и практика рыболовства предопределили деление азовской популяции на две большие группировки: кубанскую и донскую. Однако для сохранения численности относительно небольших локальных групп и способности их к воспроизводству необходимо знать реальную структуру популяции, физиологические особенности группировок, обитающих в разных экологических условиях.
Цель и задачи исследования. Основная цель нашей работы состояла в изучении структурной организации и физиологических особенностей обмена веществ популяции азовской тарани Rulihis ruiilus heckeli (Nordman) в связи с изменением условий обитания в разных регионах Азовского бассейна.
При этом необходимо было решить следующие задачи: изучить белковый полиморфизм ферментативных и неферментативных белков тарани; определить уровень генетической изменчивости по частотам аллелей и фенотипов исследованных белковых систем тарани из разных мест обитания; оценить физиологическое состояние производителей на основании фи-зиолого-биохимических показателей и связь их с экологическими факторами; определить степень популяционной изменчивости по комплексу физио-лого-биохимических показателей; провести изучение фенотипической изменчивости по комплексу мор-фометрических показателей, выяснить картину изменчивости по попу-ляционно-морфологическим данным; дать рекомендации по использованию данных о структуре популяции азовской тарани в практике рыболовства.
Научная новизна и теоретическая значимость. Исследование подразделенное азовской тарани на локальные стада, приуроченные к разным местам нереста, и ее пространственно-временной динамики позволило впервые получить данные о состоянии популяции в изменяющихся условиях Азовского бассейна. Новизной отличается применение комплексного методологического подхода к изучению данной проблемы с использованием современных разноплановых генетических, физиологических и статистических методов.
Впервые получены достоверные различия по частотам аллелей и фенотипов, уровню гетерозиготносте, а также по физиолого-биохимическим и морфологическим параметрам между четырьмя выборками тарани.
С использованием индексов генетического подобия и построения на их основе дендрограмм получены новые данные по пространственному распределению изучаемых выборок тарани, совпадающие с их географическим расположением.
Дискриминантный анализ выборок по морфометрическим признакам позволил получить картину, совпадающую с характером различий по генетическим маркерам для рыб из разных районов обитания.
С помощью дискриминантного анализа выяснено, что физиолого-биохимические показатели обладают не только индивидуальной, но и по-пуляционной спецификой, позволяющей выделить несколько экологически обусловленных группировок тарани.
Показано влияние факторов, связанных с резкими изменениями экологической ситуации, четко прослеживающееся по отсутствию устойчивого равновесия частот аллелей исследуемых локусов в разные годы. Такие серьезные тенденции сдвига генных частот определяются, по всей вероятности, резкими колебаниями численности и изменениями условий на нерестилищах.
Практическая значимость. Важнейшим практическим итогом проведенной работы является выявление генетической структуры популяции и, следовательно, определение реальной подразделенности вида на дискретные единицы воспроизводства, что, в свою очередь, позволяет разделить общую величину сырьевых запасов вида на запасы, приуроченные к отдельным участкам ареала, равномерно распределить промысловые нагрузки на локальные стада, не нарушая их экологии, способности этих стад к восстановлению.
Физиологическое состояние нерестовой части популяции на разных этапах жизненного цикла учитывается при составлении ихтиологических прогнозов, а также при оценке эффективности воспроизводства тарани в районах Азовского бассейна с разными экологическими условиями.
Положения, выносимые на защиту. 1. Исследуемые выборки тарани отличаются между собой по частотам аллелей и фенотипов пяти белковых локусов. С использованием индексов генетического подобия, рассчитанных по частотам аллелей, и построения на их основе дендрограмм получены данные по пространственному распределению этих выборок, совпадающие с их географическим расположением.
Отсутствие устойчивого равновесия частот аллелей исследуемых белковых локусов во временном аспекте определяется резкими колебаниями эффективной численности популяции и изменениями экологической ситуации в бассейне.
Физиолого-биохимические показатели обладают не только индивидуальной, но и популяционной спецификой, позволяющей выделить четыре экологически обусловленные группы тарани.
Дискриминантный анализ выборок тарани их четырех локальных стад по морфометрическим показателям позволил получить картину про-
Дискриминантный анализ выборок тарани их четырех локальных стад по морфометрическим показателям позволил получить картину пространственного распределения, совпадающую с характером различий по генетическим маркерам.
Азовская тарань имеет сложную популяционную организацию, ее структурные элементы различаются не только по экологии мест обитания, но и по функциональному состоянию, экстерьерным показателям и уровню пространственной и временной изменчивости аллельных частот. В результате пространственной изоляции в связи с осолонением моря в семидесятые годы усилилась степень дивергенции между локальными стадами тарани.
Апробация работы. Основные материалы и положения работы докладывались на Всесоюзной конференции «Современное состояние и перспективы рационального использования и охраны рыбного хозяйства в бассейне Азовского моря» (Ростов-на-Дону, 1987); на X Всесоюзном совещании по эволюционной физиологии памяти Л.А.Орбели ( Ленинград, 1990); на Всесоюзной научной конференции молодых ученых и специалистов (Ростов-на-Дону, 1990); на Втором симпозиуме по экологической биохимии рыб (Ростов Великий, 1990); на Всероссийской конференции по промысловой океанологии (Калининград, 1999); на II съезде Вавилов-ского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, одна работа в печати. . Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 стр., состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, результаты исследований и их обсуждение, и выводов, содержит 19 рисунков, 24 таблицы, список литературы из 202 ссылок на отечественные и зарубежные источники.
Работа выполнялась в Азовском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства, в отделе генетико-биохимического мониторинга в рамках тематического плана АзНИИРХ в соответствии с программами Госкомрыболовства РФ «Провести комплексные исследования биоресурсов Азово-Черноморского бассейна с целью их рациональной эксплуатации, сохранения и разработки долгосрочных перспектив развития рыболовства (Проект «Биоресурсы»)».
Автор выражает глубокую признательность руководителю д.б.н. Корниенко Галине Гавриловне; к.б.н., доценту Чихачеву Алексею Сергеевичу; особую благодарность за оказанную помощь и научную консультацию к.б.н. Дехта В.А.; к.б.н. Дудкину СИ., Агапову С.А. и сотрудникам института за помощь в обработке материала.
Характеристика условий экосистемы Азовского бассейна как среды обитания тарани
Современное состояние и потенциальные возможности рыбного хозяйства в Азовском бассейне в значительной степени определяются экологической ситуацией. Последняя, в свою очередь, обусловлена довольно сложным комплексом природных и антропогенных факторов, как типичных для многих рыбохозяйственных водоемов, так и специфических, в большей степени характерных для Азовского моря.
Весьма высокая удельная рыбопродуктивность Азовского моря, характерная для периода, предшествовавшего началу массированного антропогенного воздействия, была обязана комплексу условий, благоприятных для интенсивного протекания биопродукционных процессов.
К ним относятся:
- мелководность, обеспечивающая хорошую прогреваемость всей водной толщи, и интенсивное ветровое перемешивание не только всей водной массы, но и верхнего слоя донных отложений;
- сток пресных вод, составлявший в среднем около 42 км\ то есть 1/8 часть объема моря, и достигавший в многоводные годы 60-70 км3, или 1/5 его часть, создававший обширные районы с соленостью, благоприятной для нагула ряда ценных видов рыб; внутригодовое распределение речного стока в общем гармонировало с важнейшими периодами жизненных циклов проходных и полупроходных рыб; ежегодно с водами рек Дона и Кубани в море поступало в среднем 60 тыс. т соединений азота, около 17 тыс. т фосфора, свыше 170 тыс. т кремния; - незарегулированные реки Азовского бассейна располагали множеством участков, удобных для нереста промысловых рыб;
- ограниченная связь с Черным морем и вследствие этого относительно слабый водообмен с ним (в обе стороны около 1/3 части объема Азовского моря);
- хозяйственная деятельность в море и на водосборной площади еще не достигла экологически опасных уровней (Макаров, Семенов, 1996).
Первые серьезные воздействия на экосистему моря начались в довоенное время в результате гидростроительства на Маныче, подорвавшего естественное воспроизводство судака и тарани. Намного более тяжелые последствия для режима Азовского моря повлекли сооружение Цимлянского гидроузла, зарегулирование стока р. Дон. Заполнению Цимлянского водохранилища в 1952-1953 годах предшествовали маловодные 1949-1951 годы, когда море недополучило 30 км3 донской воды. Последовавшие вслед за форсированным заполнением водохранилища и резкими изменениями внутригодового перераспределения донского стока аномалии состояния экосистемы моря (небывало высокая прозрачность вплоть до дна вследствие исключительно слабого развития фитопланктона) подтверждали самые худшие прогнозы.
Только в 1956 году море вновь стало приобретать свойственный ему химико-биологический облик. Сложившаяся в этот период ситуация могла послужить реальным примером опасности для экосистемы моря и его биоресурсов отбора больших объемов речных вод.
Бассейн Азовского моря расположен в зоне недостаточного увлажнения, что в значительной мере.усугубило негативные последствия антропогенной утилизации речного стока, который является одной из основных составляющих водного баланса этого водоема. В многолетних колебаниях суммарного годового стока рек, впадающих в Азовское море, прослеживается пять многоводных (1915-1920, 1926-1932, 1940-1942, 1963- 1964, 1978-1981) и четыре маловодных (1921-1925, 1933-1939, 1949-1962, 1965-1977) периода различной продолжительности (Проект «Моря России», 1991). Самым маловодным для всего ряда наблюдений (1911-1998) был период с 1969 по 1976 год, когда суммарный приток донских и кубанских вод составил 22-27 км . В целом для многолетних колебаний годового суммарного стока p.p. Дон и Кубань характерна тенденция сокращения, связанная с ухудшением климатических условий его формирования и увеличения безвозвратного водопотребления до 11-12 км3 в 1976-1980 годах (Проект «Моря России», 1991).
В последнее десятилетие речной сток изменялся в пределах 43,2-30,9 км3 в год, что соответствует 40-70% обеспеченности.
Согласно критериям управления водным стоком (Гаргопа, Катунин, Чебанов, 1997; Гаргопа, 1998), его объем в современный период соответствует нижнему пределу экологически допустимого уровня поступления речных вод в море. Такой объем стока обеспечивает так называемое переходное состояние экосистемы когда отмечаются весьма ощутимые, но обратимые изменения ее основных функциональных характеристик.
Одним из наиболее очевидных последствий антропогенной утилизации стока рек является изменение поступления речных вод в море, особенно это относится к водным ресурсам р. Дон. Характер внутригодового распределения стока Кубани после зарегулирования практически сохранился, так как естественная сезонная водность ее близка к графику хозяйственного водопотребления (Бронфман, Дубинина, Макарова, 1979; Бронфман, Хлебников, 1985).
Структура исследования и материалы
Наряду с генетическими исследованиями популяций очень актуально и показательно изучение физиолого-биохимических особенностей составляющих их индивидов, которые обусловлены различными эндо- и экзогенными факторами. Как подчеркивал А.В.Яблоков (1987), «гены являются лишь «медиаторами» фенотипа, и именно фенотипы (а не гены и их аллели) составляют любую природную популяцию». При этом существует несколько аспектов изучения фенотипической изменчивости физиолого-биохимических показателей. С одной стороны, это изучение признаков, характеризующих необратимые перестройки, связанные с генетическими изменениями популяций, с другой стороны — обратимые. Последние изначально лабильны, поскольку обусловлены широкой нормой реакции. Первые обычно описываются как адаптация и анализируются в комплексе микроэволюции, вторые — как акклиматизация.
В работах В.В.Кузьминой и И.Л.Головановой (1990) показаны значительные различия ряда морфологических и физиолого-биохимических характеристик (15 показателей) речной и устьевой группировок леща. Степень наблюдаемых различий непостоянна. Последнее свидетельствует как о значительной зависимости морфологических и функциональных показателей различных преднерестовых группировок леща от экологической ситуации водоема, так, видимо, и о феномене непостоянства характеристик, а также, возможно, состава нерестовых скоплений. Не исключено, что в условиях небольших водоемов, находящихся под прессом антропогенного воздействия, возможно изменение путем миграции части особей из отдельных локальных стад, способствующее уменьшению фенотипических различий их преднерестовых группировок.
Отмечены различия по физиологическим показателям для пресноводных рыб. Доказано существование пяти локальных стад окуня (Регса fluviatilis L.) в отдельных участках Куйбышевского водохранилища и нижнем бьефе плотины. Незначительная внутрипопуляционная изменчивость двадцати одного физиологического признака (гематологические показатели, параметры углеводного обмена и ионного состава плазмы крови) обнаружена у окуня в озерах Швеции (Наух et al., 1987). На основании различий физиологических показателей, характеризующих уровень обмена веществ, признано существование локальных стад донского и кубанского судака (Голованенко, Шуватова, 1975).
В последние годы предпринимались попытки подойти к решению вопроса о воздействии пищи на естественные популяции путем изучения внутри- и межпопуляционной изменчивости активности некоторых пищеварительных ферментов у атлантических лососей и некоторых пресноводных рыб (Torrissen, 1994; Torrissen et al., 1997). У леща (Abramis brama L.) из разных районов Рыбинского водохранилища исследовались начальные этапы становления гидролитических функций пищеварительной системы. Установлено, что эффективность функционирования пищеварительной системы в значительной мере определяется условиями питания. При этом существуют глубокие и разнообразные зависимости между кормовой базой и структурой популяции рыб, в том числе, и структурой их локальных стад (Кузьмина, 1990).
Показана дифференциация самцов леща в Рыбинском водохранилище в нерестовой части локального стада на две группы, отличающиеся местом размножения в свойственном всему стаду нерестовом притоке, размерно-массовыми показателями, физиолого-биохимическими признаками, напоминающие по своим общебиологическим характеристикам озимую и яровую формы. С помощью многофакторного анализа удалось вскрыть существенные отличия этих внутристадных группировок друг от друга по совокупности показателей как общелипидного, так и фосфолипидного состава органов и тканей (Халько, 1990), что свидетельствует о принципиальной возможности идентификации мигрирующих на нерест в реку производителей рыб по их биохимическим признакам.
Е.М.Крепс (1981) показал, что сдвиги в жирнокислотном составе липидов имеют огромное значение в изменчивости и наследственности животных. Изменения состава жирных кислот и количества липидов иногда резко меняют функции липопротеидов клеточных мембран и приводят к перестройкам нуклеиновых кислот клеточных ядер (Калабухов, 1972). Поэтому изучение внутрипопуляционной изменчивости структурных и запасных липидов может внести много нового в представления о степени физиологической однородности особей в субпопуляциях, их физиолого-биохимическом облике в разных локальных стадах, объяснить в какой-то мере причины разновременности нереста и начала миграционных перемещений рыб различных внутрипопуляционных группировок и оценить степень функциональных и генетических различий особей в этих обособлениях, поскольку композиционный состав структурных липидов, как и белковых систем биомембран, обладает высокой степенью наследуемости (Крепе, 1981; Сидоров, 1983).
Биохимический полиморфизм белковых систем азовской тарани
В качестве генетических маркеров мы использовали электрофорети-ческие варианты белков, выявленных методами биохимической генетики. Остановимся на принципах расшифровки различных вариантов белковых систем.
Генетический полиморфизм белков, растворимых в воде или водно-солевых растворах с низкой ионной силой, лучше всего улавливаются методом зонального диск-электрофореза, а наследственная природа полиморфизма легко расшифровывается на основе принципов этого метода. Индивидуальные вариации обнаруживаются в подвижности и числе фракций на электрофореграмме, что обусловлено существованием аллелей генетических локусов, кодирующих отдельные полипептидные цепи белковой молекулы. Контроль одной и той же биохимической функции приводит к соответствующей множественности белковых зон на электрофоре-грамме (Алтухов, 1975).
Большинство ферментов в организме представлено несколькими формами, получившими название изозимов или изоферментов (Markert, МЄ1ІЄГ, 1959).
Сейчас изозимами называют генетические варианты ферментов (Ко-рочкин и др., 1977) в отличие от ненаследуемых изменений в структуре белков — конформаций. Широко используется также термин «аллофор-мы», которым обозначают продукты разных аллелей одного и того же гена.
Многие из белков, не обладающих ферментативной активностью (например, гемоглобины, трансферрины, альбумины и др.) также представлены в организме несколькими формами — изоформами, или алло-формами.
В случае белков-мономеров, не имеющих четвертичной структуры, у каждой из гомозигот после специфического окрашивания геля обнаруживается один диск — полоска, соответствующий месту концентрации белка в геле в конце электрофореза. Две гомозиготы, при различии в зарядах двух аллозимов (аллоформ) различаются по расположению такого диска. У гетерозигот образуются оба продукта («кодоминантность») и соответственно можно найти в геле два диска (две полоски), каждый при этом окрашивается менее интенсивно, чем диск гомозигот.
При димерной структуре белка — наличии двух полипептидных цепей в белковой глобуле — у гетерозигот обычно выявляются три диска. Два из них соответствуют «чистым» белковым продуктам, как у гомозигот, третий является «гибридным» и состоит их двух разных полипептидов, кодируемых разными аллелями.
При наличии двух гомологичных локусов, возникших в результате дупликации одного гена и кодирующих изозимы-димеры с одинаковой электрофоретической подвижностью, полиморфизм по сходным аллелям обоих локусов приводит к ПОЯВЛЄНИЕО пяти хорошо различимых вариантов.
Многие тетрамерные белки кодируются у одной особи двумя или большим числом генов. Продукты двух основных генов, как и в случае ал-лельных продуктов, сочетаются, дают пять изозимов (реже у рыб образуется только три) (Кирпичников, 1987). Если один из генов находится в гетерозиготном состоянии, образуется пятнадцать изозимов вместо пяти. Фактически, при электрофорезе их насчитывается меньше вследствие совпадения электрических зарядов у некоторых из них.
Биохимический полиморфизм тарани изучен в локусах сывороточных белков, миогенов, лактатдегидрогеназы, супероксиддисмутазы и эсте-раз мышц.
1) сывороточные белки
Сывороточные белки тарани представлены 13-14 компонентами. На основании их элетрофоретической подвижности (ЭФП) сывороточные белки разделяются на несколько фракций: преальбумины с ЭФП 0,9-0,8; альбумины с ЭФП 0,7-0,6; альфа-1-глобулины с ЭФП 0,55-0,53; бета-альфа-1-глобулины ЭФП 0,52-0,45; альфа-2-глобулины с ЭФП 0,35-0,1 и гамма-глобулины с ЭФП 0,08-0,1 (рис. 4).
Полиморфизм отмечен в зоне трансферринов (Tf). Среди бетта-глобулинов сыворотки крови трансферрины играют важную роль, они переносят железо, необходимое для построения молекул гемоглобина. У большинства видов рыб локус Tf изменчив, число аллелей варьирует от двух до тринадцати (чаще три — четыре).
