Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. РОЛЬ БИОТЕХНОЛОГИИ В ПОВЫШЕНИИ ТОЛЕРАНТНОСТИ РАСТЕНИЙ К СТРЕССОВЫМ ЭДАФИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ 6
1.1. Растения в условиях стресса и механизмы адаптации 6
1.2. Влияние солевого стресса на жизнедеятельность растений 6
1.3. Воздействие кислотности почв на растения 8
1.4. Роль биотехнологии в увеличении устойчивости сельскохозяйственных культур к неблагоприятным эдафическим факторам 18
1.5. Методы оценки устойчивости растений к стрессовым факторам . 23
1.5.1. Солеустойчивость 23
1.5.2. Кислотоустойчивость 28
1.6. Проблемы и задачи создания устойчивых к стрессовым эдафическим факторам форм ячменя 31
Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 34
2.1. Объекты исследования 34
2.2. Методы исследования 39
2.2.1. Условия и методы культивирования тканей in vitro 39
2.2.2. Физиологическая оценка соле- и кислотоустойчивости 44
2.2.3. Полевая оценка кислотоустойчивости 45
2.3. Статистическая обработка данных 46
Глава 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ В ОТБОРЕ СТРЕССОУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ 47
3.1. Влияние генотипа донорных растений и условий их выращивания на каллусогенез в культуре изолированных зародышей ячменя „ 47
3.2. Сравнение устойчивости к стрессовым эдафическим факторам сортов и линий ярового ячменя разного происхождения в культуре in vitro 49
3.2.1. Сорта местной и инорайонной селекции 50
3.2.2. Образцы, отобранные по солеустойчивости 55
3.2.3. Адаптивные линии 60
3.2.4. Селекционные линии пивоваренного направления 65
3.2.5. Линии регенерантов и их родительские формы 68
3.3. Результативность получения растений-регенерантов на селективных средах 76
Глава 4. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ К СТРЕССОВЫМ ФАКТОРАМ 81
4.1. Физиологическая оценка линий-регенерантов и их родительских форм по устойчивости к стрессовым эдафическим факторам 81
4.2. Полевые испытания линий-регенерантов ячменя и их родительских форм на обедненных кислых почвах 88
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 98
ВЫВОДЫ 99
ЛИТЕРАТУРА 101
ПРИЛОЖЕНИЕ 121
- Воздействие кислотности почв на растения
- Физиологическая оценка соле- и кислотоустойчивости
- Сорта местной и инорайонной селекции
Введение к работе
Актуальность темы. Учитывая разнообразие природно-климатических условий Восточно-Сибирского региона, очевидна актуальность в создании сортов растений, обладающих высокой экологической пластичностью к эдафиче-ским факторам среды, которые зачастую носят экстремальный характер. Так, в Красноярском крае более 30% площади пахотных земель занимают кислые почвы, а в Хакасско-Минусинской котловине весомая доля принадлежит засоленным почвам.
В последнее время одним из перспективных и экологически безопасных направлений, значительно увеличивающих эффективность совершенствования сельскохозяйственных культур, является использование биотехнологических методов, и в частности клеточной селекции. Это обусловлено повышенной чувствительностью изолированных тканей к стрессовым факторам и резкому возрастанию у них уровня наследственной изменчивости, что позволяет существенно ускорить темпы селекции по созданию новых сортов, обладающих широким диапазоном экологической валентности.
Цель работы — определить эффективность отбора ярового ячменя по устойчивости к засолению и кислотности почв биотехнологическими методами.
Задачи исследований: изучить влияние генотипа донорных растений и условий их выращивания на каллусогенез в культуре изолированных зародышей ячменя; сравнить устойчивость сортов и линий ярового ячменя разного происхождения к стрессовым эдафическим факторам биотехнологическими методами; определить эффективность получения растений-регенерантов на селективных средах; оценить результативность отбора в культуре изолированных тканей на стрессовых фонах физиологическими и полевыми опытами.
Научная новизна. Впервые в условиях Красноярского края на основе комплексных исследований установлена высокая эффективность отбора ярового ячменя по устойчивости к засолению и кислотности почв биотехнологиче- скими методами, особенно среди форм местной селекции. Экспериментально подтверждено сходство протекания процессов пролиферации, органогенеза и регенерации при культивировании изолированных тканей между близкородственными генотипами и определена зависимость данных процессов от наличия или отсутствия в селективной среде конкретного стрессового фактора.
Практическая значимость. Установлены оптимальные параметры условий отбора стрессоустойчивых форм ярового ячменя в культуре изолированных тканей. Дня использования в качестве исходного и селекционного материала определены новые формы с потенциальной комплексной устойчивостью к засолению и кислотности почв - селекционные линии: Д-28-5980, Д-51-6081, У-20-706, Т-136-368, Е-30-6534, Г-84-5651, и линии регенерантов, полученные на средах с низкой рН: КР.3.2.Кедр и КР.3.7,(7)-Т-136-368; а также ряд образцов, устойчивых к одному из стрессовых факторов; получено 363 растений-регенерантов, из них 105 - со среды с высоким содержанием соли и 150 - с низким значением рН (4,0). Регенеранты с контрольных сред (как самоклональные варианты) также представляют самостоятельную селекционную ценность. Ряд регенерантов проходят предварительное сортоиспытание в Красноярском НИ-ИСХ. Материалы диссертации используются в учебном процессе на эколого-биотехнологическом и агрономическом факультетах Красноярского государственного аграрного университета.
Защищаемые положения.
Агроэкологическая обусловленность направлений селекции ярового ячменя определяет поведение генотипов в культуре in vitro.
Селективные среды в культуре изолированных тканей являются эффективным способом отбора и создания форм ячменя, устойчивых к стрессовым эдафическим факторам.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены в 9-ти публикациях, а также доложены и обсуждены на генетико-селекционных школах: «Повышение эффективности селекции и семеноводства сельскохозяйственных растений» (Новосибирск, 2001) и «Актуальные задачи селекции и семеноводст- ва сельскохозяйственных растений на современном этапе» (Новосибирск, 2004); V Международной конференции «Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана» (Абакан, 2002); Всероссийской научной конференции «Аграрная наука на современном этапе» (Пушкин, 2002); Всероссийской научно-практической конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков» (Ярославль, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Аграрная наука на рубеже веков» (Красноярск, 2003).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, двух глав экспериментальной части, практических рекомендаций, выводов и списка использованной литературы. Материал изложен на 120 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 16 рисунков и 3 фотографии. Список литературы включает 196 наименований, из которых 39 на английском языке.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю к.б.н. Н.В. Зобовой, а также академику РАСХН Н.А. Сурину за консультации и обсуждение полученных материалов.
Воздействие кислотности почв на растения
Известно, что в период роста и развития растения постоянно испытывают стрессовые воздействия факторов среды [12; 45; 154; 86].
Различают первичные изменения, обусловленные непосредственным действием стресса на растение, и вторичные, вызванные первичными нарушениями метаболических функций. К первичным изменениям относят модификацию ос-морегуляции клетки, биоэнергетических процессов, структурной целостности и состава мембран, а также изменение системной активности ядерной ДНК. Функционально наибольшее значение среди вторичных отклонений имеет торможение белкового синтеза, увеличение концентрации фитогормонов, подавляющих деление и растяжение клеток [135;136; 51; 121; 91].
По мнению Калинина (59), чтобы вызвать существенные изменения адаптационного характера в метаболизме разных сортов и видов растений, требуются различные по силе экстремальные воздействия. Одинаковые по напряженности стрессы, заметно отразившись на одних растениях, слабо влияют на метаболизм других. Это свидетельствует о разной биологической буферности растений и неодинаковом уровне их нормы реакции. Установлено, что разные по устойчивости растения однотипно реагируют на стрессовые воздействия, но скорость и амплитуда физиологических перестроек при этом у них неодинакова, что связано с различиями в экологической валентности или адаптивной пластичности видов живых организмов [69; 73].
Под адаптивной пластичностью высших растений понимается их способность к выживанию, воспроизводству и саморазвитию в постоянно изменяющихся условиях внешней среды за счет взаимосвязанного функционирования генетических программ адаптации онтогенетической и филогенетической сиетем [3; 48]. Адаптация отражает все многообразие отношений растений и фитоценоза с окружающей средой. Критерием оценки экологической валентности растений является их устойчивость к неблагоприятным условиям - засухе, заморозкам, болезням, кислым и засоленным почвам и другим факторам.
По мнению Жучен ко (48), адаптация растений к новым условиям среды достигается за счет модификационной и генотипической изменчивости, то есть путем переработки комплекса физиолого-биохимических и морфологических признаков самого растения в онтогенезе и образования новых норм реакции в филогенезе. Адаптационный процесс, условно может быть разбит на две основные стадии: стресс-реакцию и специализированную адаптацию. На первой стадии имеет место мобилизация или формирование защитных систем, обеспечивающих кратковременное выживание организма в условиях повреждающего действия стрессора. На второй стадии происходит формирование специализированных адаптационных механизмов, ответственных за протекание онтогенеза в условиях длительного действия стрессового фактора [157; 77; 174].
Увеличение числа изоферментов в условиях стресса, повышение активности одних ферментов при подавлении других, катализирующих превращение тех же субстратов, активизация пентозофосфатного пути дыхания, при ослаблении гликолитического, свидетельствуют о включении различных шунтовых механизмов при неблагоприятных для растения условиях окружающей среды [136; 48].
Отмечено, что наиболее эффективная организменная адаптация растений к длительно действующим неблагоприятным факторам осуществляется через новообразование более устойчивых к стрессу клеток и органов в процессе роста [162]. Ростовые реакции, очевидно, являются интегрирующими при определении адаптации растений к стрессовым условиям [34; 76].
Таким образом, в процессе экогенеза у растений выработался сложный механизм адаптации к определенному диапазону факторов среды. Выход значений факторов за эти пределы оказывает стрессовое воздействие, что вызывает ингибирование роста и развития растений. Среди таких условий среды, сдерживающих возделывание сельскохозяйственных культур, можно выделить климатические и эдафические факторы. В преодолении этих трудностей важное практическое значение имеет создание форм сельскохозяйственных растений, которые обладали бы широким спектром экологической адаптации и были толерантными к действию таких факторов, как низкие и высокие температуры, неблагоприятное значение рН почвенного раствора, засоление почвы.
Засоление почвы, вызывающее стресс у сельскохозяйственных растений, оказывает большое влияние на эффективность земледелия [78]. В настоящее время на планете засолению подвержены 2 млн. км2 земель, используемых для сельскохозяйственного производства, и среди них - около 30-50 % орошаемых [140].
О почвах говорят, что они засолены, если они содержат избыток растворимых солей в корнеобитаемом слое [18]. Главными катионными компонентами растворимых солей в засоленных почвах являются натрий, кальций, магний, а главными анионными компонентами - сульфаты, хлориды и карбонаты. Второстепенными компонентами могут быть калий, бикарбонаты, нитраты [121]. Чаще всего засоление представлено ионами натрия в сочетании с ионами хлора, сульфата или карбоната [80]. Почвы с карбонато-натриевым засолением практически непригодны для произрастания большинства растений [135]. В отношении же засоления сульфатом или хлоридом натрия имеется весьма широкий полиморфизм устойчивости растений на межвидовом и межсортовом уровне. Поэтому термин "солеустойчивость" обычно применяется по отношению к хлорно-сульфатно-натриевому засолению [126]. Установлено, что физиологические процессы солеустоичивости растений лежат в пределах осмотического давления 0,3-1,8 мПа, что соответствует концентрации хлорида натрия 0,42-2,52% [45]. При оценке степени солеустойчивости исследователи различают два аспекта - биологический и агрономический [134; 121]. С биологической точки зрения, под солеустойчивостью вида или сорта понимают тот предел засоления, при котором растения еще способны полностью завершить онтогенетический цикл развития и воспроизвести всхожие семена. Выше этого предела растения гибнут раньше завершения цикла онтогенеза или образуют невсхожие семена с недоразвитым зародышем [154]. При агрономическом подходе к оценке степени солеустойчивости растений, обращают внимание насколько данный сорт или вид снижает свою продуктивность в конкретных условиях засоления (при определенном его уровне) по сравнению с его урожайностью без засоления [137].
Физиологическая оценка соле- и кислотоустойчивости
Для лабораторной оценки соле- и кислотоустойчивости исследуемых генотипов ярового ячменя использовали рулонный метод проращивания зерновок. В качестве тестирующего признака наблюдали изменение накопления биомассы и величины проростков и корней, выращенных в солевом растворе и растворе с низкой рН по сравнению с этими показателями на контроле [56; 113; 25].
Отобранные семена предварительно замачивали водой в чашках Петри в течение трех суток без света в термостате при t=22C. Затем проросшие зерна переносили в рулоны из фильтровальной бумаги. Далее рулоны помещали в вегетационные сосуды, где они постоянно находились во влажном состоянии. Помещение в рулоны уже пророщенных зерен обусловлено тем, что в случае непосредственного проращивания семян в исследуемых растворах за небольшой промежуток времени (7-Ю дней) невозможно получить проростки и сравнивать по ним сорта [114].
Опытные варианты содержали: 1. раствор хлорида натрия в концентрации 1,68%; 2. закисленный раствор с рН - 4,0. В качестве контрольного варианта использовали дистиллированную воду. Выбор концентрации селектирующих агентов обусловлен тем, что при таком уровне содержания хлорида натрия и соляной кислоты начинает проявляться значимое влияние засоления и закислення на все исследуемые генотипы. Время экспозиции проростков в рулонах ограничивали семью сутками. По прошествии этого времени рулоны разворачивали и проводили необходимые измерения: линейных размеров и сырой массы побегов и корней. Объектами служили двадцать пять зерен в одном рулоне, все опыты проводили в 4-х повторностях.
Для взвешивания использовали технические весы ВЛКТ-160. Измерения проводили с точностью до сотых грамма.
Полевая оценка линий-регенерантов проходила в естественных полевых условиях АО «Зареченский» Тюхтетского района Красноярского края. Почва опытного участка дерново-подзолистая, рН почвенного раствора 4,4. Содержание гумуса невысокое - 1,53%, обеспеченность почвы фосфором низкая (Р2О5-5,7-6,6 мг/100 г почвы по Кирсанову), почти отсутствует азот. Данные почвы относятся к сильно кислым.
Линии - регенерантов и их родительские формы высевали на делянки площадью їм2. В качестве контрольных выступали сорта из коллекции ВИР -С-15 (Эквадор), отмеченный как солевыносливый и Джюгай устойчивый к почвенной кислотности.
Определение параметров структуры урожая производилось стандартным методом с использованием рекомендаций ВИР по оценке устойчивости зерновых культур к кислотности почвы [89]. Сохранность растений к уборке определяли путем их подсчета на делянке.
В лабораторных условиях проводился анализ образцов по следующим показателям: продуктивная кустистость (шт.), то есть число генеративных побегов растения, имеющих озерненные колосья; озерненность колоса (шт.); масса 1000 зерен (г); урожайность (г/м ).
Статистическую обработку проводили при помощи пакета Microsoft Excel 97 для Windows и компьютерного пакета статистических программ "Snedecor". Для всех средних величин рассчитывалась стандартная ошибка, достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Ассортимент изучаемых линий, направленность селекции и многочисленность параметров определяет необходимость дополнительного статистического анализа для определения сходства и различия изучаемых образцов, поэтому результаты исследований подвергнуты дисперсионному и кластерному анализам, а также многомерному ранжированию [79; 41].
Сорта местной и инорайонной селекции
Группу сортов местной и инорайонной селекции составили формы, которые возделываются или проходят экологическое сортоиспытание в Красноярском крае. В культуру in vitro введено 370 незрелых зародышей от сортов местной и 750 - от сортов инорайонной селекции (табл. 6). Индукция каллусогенеза составила, соответственно, 89,8 и 76,6%. В тоже время этот показатель сильно отличается у исследуемых форм, так у сортов Кедр и Андрей он достиг 100%, немного меньше у сортов Новосибирский 80 и Вулкан. У сорта Красноярский 80 индукция каллусогенеза незначительно ниже, чем средний показатель по группе. Процент индукции каллусогенеза у всех перечисленных сортов достоверно (Р 0,01) выше, чем у остальных форм. Наименьшая приживаемость отмечена у сорта Русь - 59,0%. Таким образом, как между группами образцов, так и внутри них наблюдается значимое различие форм по индукции каллусогенеза, а значит и по возможности их использования в культуре тканей.
При оценке пролиферации на селективных средах установлено, что формирование каллуса у сортов местной селекции на контрольной среде происходит приблизительно на 20,0 и 10,0% интенсивнее, чем на соленой и кислой средах, соответственно. Пролиферация у сортов инорайонной селекции в целом ниже. На контрольной и соленой среде она в среднем составляет около 50,0%», а на кислой — 35,6%. Однако между собой сорта весьма сильно отличаются по этому параметру (от 0 до 100%), У сорта Партнер пролиферации нет на всех средах, у сорта Русь - на контрольной, а у Андрея - на среде с низким значением рН (4,0), отличия от других сортов достоверны (Р 0,01). На контрольной и селективных средах наибольшая пролиферация у сортов Красноярский 80 и Одесский 115 (Р 0,05), а только на соленой среде у Адониса и Ачи (Р 0,01). У сортов Ерофей, Асем и Джин формирование каллусной массы на среде с высоким содержанием NaCl (0,42 %) достоверно (Р 0,01) ниже средних значений этого параметра сортов инорайонной селекции.
У сортов Вулкан и Асем органогенез (образование побегов) наблюдается только на кислой, а у сорта Джин - на соленой среде. У Адониса на всех каллусах на селективных средах образованы побеги. Наилучшие показатели органогенеза и регенерации на селективных средах выявлены у сортов Красноярский 80, Адонис, Русь, Кедр и Ача. По проценту регенерации лидирующие положение с высокой степенью достоверности (Р 0,05) на контрольной среде занимает Красноярский 80, на среде с рН (4,0) - Адонис.
Достаточно высокая гибель каллусов, вследствие заражения и угнетения длительностью пассажей, приводит к уменьшению выборки по отдельным генотипам на средах регенерации, не позволяет оценить значимость между средами. Критерий % свидетельствует о высокой однородности рядов, несмотря на видимые различия в процентном соотношении.
Ранжирование биотехнологических показателей, таких как пролиферация, органогенез и регенерация, на соответствующих фонах, которые определяют устойчивость сортов ярового ячменя к стрессовым эдафическим факторам (табл. 7) показало, что группу «лучших» по солеустойчивости составили: сорт местной селекции - Красноярский 80 и сорта инорайонной селекции: Адонис и Русь и районированные в Красноярском крае - Ача и Новосибирский 80. По устойчивости к низким значениям рН (4,0) в группу «лучших» вошли три сорта местной селекции (Красноярский 80, Кедр и Вулкан) и сорт Одесский 115, используемый в качестве стандарта в южных районах Красноярского края. Вероятно, эти данные свидетельствуют о том, что сорта местной селекции, отмеченные своей приспособленностью к стрессовым воздействиям (Красноярский 80 и Кедр более 16 лет районированы в крае), достаточно слабо реагируют на неблагоприятные эдафические факторы.
По суммарной оценке устойчивости сортов к низким значениям рН (4,0) и высокому содержанию соли группу «худших» составили в основном сорта инорайонной селекции, в том числе районированный в нашем крае сорт Андрей, созданный в Кировской области на почвах с низким значением рН, обусловленной ионами алюминия. Самым наихудшим по регенерационньш показателям оказался сорт Партнер, новосибирской селекции. Таким образом, в основном группы «лучших» и «худших» сортов по устойчивости к высокому содержанию соли и низким значениям рН составили разные сорта, что свидетельствует об отсутствии их комплексной устойчивости к стрессовым факторам
Ассортимент представленных сортов, направленность селекции и многочисленность изучаемых параметров определяет необходимость дополнительного статистического анализа для определения сходства и различия изучаемых образцов. Поэтому результаты исследований подвергнуты кластерному анализу, который позволяет по суммарным биотехнологическим показателям, сравнить исследуемые группы образов. По максимуму корреляций между объектами сорта разделились на три кластера (рис. 1). В первом кластере за одним исключением (Асем) находятся только сорта, районированные в Красноярском крае, во втором и в третьем, кроме Новосибирского 80, все нерайонированные. Связь двух Новосибирских сортов Партнер и Новосибирский 80 во втором кластере, довольно тесная. Третий кластер самый малочисленный, объединяет сорта Зерноградский и Ерофей. Таким образом, районированные в крае сорта имеют сходные характеристики регенерации, в том числе на стрессовых фонах.
Кластерный анализ по максимуму корреляций между признаками, такими как пролиферация, органогенез и регенерация на контрольной и селективных средах (рис. 2), также свидетельствует о большой разнородности включенных в группу сортов. Наиболее тесно коррелируют процессы регенерации на соленой и кислой среде, а также органогенез на соли.
В первом из двух кластеров отражена связь между разными процессами (от пролиферации до регенерации) и условиями (контрольные и селективные среды), во втором - обособлены пролиферация на контрольной среде и при низком значении рН, и слабо, но связанный с ними органогенез при низком значении рН. Вероятно, результаты в целом по группе свидетельствуют о том, что в ней нет преобладания сортов со специфической устойчивостью к соли или кислоте.
Похожие диссертации на Использование биотехнологических методов в повышении соле- и кислотоустойчивости ярового ячменя
