Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ГЕРБИЦИДОВ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ, И МЕТОДЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА АГРОЛАНДШАФТОВ 10
1.1 Поведение и персистентность остаточных количеств гербицидов в агроландшафтах 10
1.2 Фитотоксическое действие и последействие гербицидов на культурные растения 18
1.3 Методы, применяемые для аналитического контроля гербицидов и изучения их воздействия на растения 26
1.4 Флуоресцентные методы в экологическом мониторинге состояния растительности 32
1.4.1 Использование замедленной флуоресценции для изучения функционального состояния растительных организмов и устойчивости растения к внешним факторам 32
1.4.2 Применение замедленной флуоресценции для анализа загрязнения окружающей среды гербицидами и изучения их влияния на растения 37
1.5 Выводы по первой главе 38
ГЛАВА 2 БИОФИЗИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ РЕГИСТРАЦИИ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ГЕРБИЦИДОВ НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ РАСТЕНИЙ 40
2.1 Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата 40
2.2 Современные представления о механизме замедленной флуоресценции фотосинтезирующих организмов 45
2.3 Морфологические, физиологические и биохимические механизмы действия гербицидов 51
2.3.1 Механизм действия фосфорорганических гербицидов (на примере раундапа) 55
2.4 Выводы по второй главе 62
ГЛАВА 3 ВЫБОР И ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ УСТРОЙСТВА ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ 63
3.1 Лабораторное устройство для регистрации замедленной флуоресценции 63
3.2 Оптимизация режимов работы фотоэлектронного устройства 68
3.2.1 Оптимизация работы фотоэлектронного умножителя ФЭУ-110 68
3.2.2 Оптимизация работы электронных блоков системы «Вектор» 75
3.3 Разработка устройства-индикатора для ранней диагностики изменения состояния фотосинтетического аппарата растений под влиянием гербицидов 81
3.4 Выводы по третьей главе 86
ГЛАВА 4 УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 88
4.1 Общие положения экспериментальных исследований 88
4.2 Краткая характеристика почвенно-растительных комплексов и агроклиматических ресурсов степных ландшафтов Оренбургской области 89
4.2.1 Особенности фотосинтетического аппарата степных растений 94
4.3 Методика отбора растений для проведения исследований 95
4.4 Методика определения функциональных зависимостей показателей замедленной флуоресценции от концентрации раундапа и времени после обработки растений гербицидом 96
4.5 Применение кластерного анализа для классификации растений по ответной реакции фотосинтетического аппарата на действие гербицида раундап 98
4.6 Методика испытаний устройства-индикатора в полевых условиях 104
4.7 Выводы по четвертой главе 104
ГЛАВА 5 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 106
5.1 Выводы по пятой главе 121
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 123
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 125
ПРИЛОЖЕНИЯ 144
- Поведение и персистентность остаточных количеств гербицидов в агроландшафтах
- Современные представления о механизме замедленной флуоресценции фотосинтезирующих организмов
- Оптимизация работы электронных блоков системы «Вектор»
Введение к работе
Актуальность темы. Широкое использование гербицидов в сельском хозяйстве требует разработки высокочувствительных и экспрессных методов оценки влияния на растительные организмы токсичных веществ, а также изучения механизмов их гербицидного действия на различные виды культурных и сорных растений. Это особенно актуально в настоящее время, так как появляется все больше сведений о том, что при длительном использовании гербицидов происходят изменения в видовом составе растений, образуются биотипы сорняков, обладающих повышенной устойчивостью к химическим препаратам.
Для оценки влияния различных загрязняющих веществ, в том числе и гербицидов, на растительные организмы применяются в основном биологические, физико-химические и химико-аналитические методы.
Высокая чувствительность и возможность получения информации непосредственно от интактного объекта, как показывает ряд работ [36, 67, 99, 107, 141], делают целесообразным использование биофизического метода регистрации замедленной флуоресценции, основанного на регистрации начальных нарушений клеточного метаболизма, для экологического мониторинга состояния растительности в условиях техногенного загрязнения агроландшафтов токсичными химическими веществами. К настоящему времени метод регистрации замедленной флуоресценции был использован для изучения влияния на растения гербицидов, ингибирующих различные этапы процесса фотосинтеза [24, 37, 38, 106, 120], однако недостаточно исследованы гербициды, косвенно влияющие на данный процесс.
Целью диссертационной работы являлось обоснование и разработка биофизического метода экологического мониторинга агроландшафтов, основанного на регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла, а также технических устройств, связанных с реализацией указанного метода, для
экологической оценки влияния фосфорорганических гербицидов на культурные и сорные растения.
Достижение указанной цели предполагало решение следующих задач:
провести анализ существующих методов и средств, используемых для экологического мониторинга агроландшафтов и контроля воздействия гербицидов на растительные организмы;
создать экспериментальное устройство для регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла в лабораторных условиях и оптимизировать режимы измерения послесвечения;
разработать методику экологической оценки влияния гербицидов на растения агроландшафтов;
исследовать динамику замедленной флуоресценции и определить ее количественные характеристики в зависимости от продолжительности действия гербицида на растение и его концентрации;
разработать устройство-индикатор, которое может быть включено в систему экологического мониторинга для ранней диагностики изменения состояния фотосинтетического аппарата растений агроландшафтов под влиянием гербицидов.
Объектом исследования является система «растение-агроландшафт».
Предметом исследования является разработка биофизического метода мониторинга системы «растение-агроландшафт» на основе экологической оценки воздействия фосфорорганического гербицида раундап на фотосинтетический аппарат растений.
Научная новизна работы состоит в следующем:
разработано оригинальное устройство для регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла;
предложена и экспериментально проверена методика экологической оценки влияния фосфорорганических гербицидов на растения агроландшафтов;
получены математические зависимости интенсивности замедленной флуоресценции от продолжительности действия гербицида на растения и его концентрации;
предложена классификация видов и сортов растений агроландшафтов по ответной реакции фотосинтетического аппарата на воздействие фосфорорганических гербицидов.
Практическая значимость работы. Применение устройства, разработанного для регистрации замедленной флуоресценции, позволит проводить раннюю диагностику изменений состояния фитоценозов в результате воздействия техногенного загрязнения агроландшафтов. На разработанное устройство получен патент RU № 2220413 (Приложение А). Предложена методика экологической оценки влияния гербицидов на фотосинтетический аппарат растений, которая может быть включена в общую схему экологического мониторинга. Разработаны принципы классификации видов и сортов растений по ответной реакции фотосинтетического аппарата на фитотоксические вещества.
Достоверность результатов работы обеспечивается использованием современных методов экспериментальных и теоретических исследований, хорошей сходимостью расчетных и экспериментальных данных.
Реализация результатов исследований осуществляется путем использования разработанного устройства для регистрации замедленной флуоресценции, методики экологической оценки влияния гербицидов на растительные организмы для получения информации о механизмах действия новых препаратов, внедряемых в практику сельского хозяйства, а также для тестирования на сохранение действующего вещества при длительном хранении гербицидов Государственным центром агрохимической службы «Оренбургский» (Приложение Б).
Результаты исследований используются в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет» при чтении лекций и
проведении практических занятий для студентов специальности 330100 -«Безопасность жизнедеятельности в техносфере» в учебном курсе «Системы защиты среды обитания» (Приложение В), а также по специальным дисциплинам «Физиология растений» и «Мониторинг среды обитания» для студентов специальности 011600 - «Биология» (Приложение Г).
Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на конференциях различных уровней:
Международной научной конференции «Молодая наука - XXI веку» (Иваново, 2000 г.);
Международной научно-практической конференции «Состояние биосферы и здоровье людей» (Пенза, 2002 г.);
Российской научно-технической конференции «Обеспечение продовольственной и экологической безопасности человечества — важнейшая задача XXI века» (Оренбург, 2000 г.);
Пятой Международной научно-технической конференции «Новое в охране труда, окружающей среды и в защите от чрезвычайных ситуаций» (Алматы, 2002 г.);
Первой Всероссийской научно-практической конференции «Здоровьесберегающие технологии в образовании» (Оренбург, 2003 г.) (Приложение Д);
ежегодных региональных научно-практических конференциях молодых ученых и специалистов Оренбуржья (Оренбург, 2001-2004 г.г.), а также на научных семинарах кафедры экологии и природопользования Оренбургского государственного университета (Оренбург, 2001 - 2004 г.г.).
Материалы исследований представлялись и поощрялись на областном конкурсе научных работ молодых ученых и специалистов Оренбуржья (Оренбург, 2003 г.) (Приложение Е) и региональных выставках «НТТМ — 2001», «НТТМ - 2002» (Оренбург, 2001-2002 г.г.) (Приложения Ж, 3).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ. Получен патент RU № 2220413.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, списка использованных источников из 205 наименований и 8 приложений. Общий объем диссертации составляет 144 страницы машинописного текста, включает 34 рисунка, 4 таблицы.
Поведение и персистентность остаточных количеств гербицидов в агроландшафтах
Гербициды, применяемые на сельхозугодьях, лишь частично расходуются на уничтожение сорняков: по разным оценкам от 5 до 40 % примененного количества препарата. Остальная часть поступает в агроценозы как загрязнитель [3, 19, 97].
Гербициды, поступившие в агроценозы, накапливаются в отдельных объектах и средах и включаются в различные миграционные цепи (рис. 1.1). Это особенно характерно для устойчивых гербицидов, способных сохраняться в окружающей среде длительное время.
Опасность гербицидов для окружающей среды состоит, прежде всего, в том, что подавляющее большинство из них является синтетическими химическими веществами, не встречающимися в природе. При возрастающих объемах применения гербицидов их остатки или продукты метаболизма могут накапливаться в объектах окружающей среды, мигрировать по цепям питания и вызывать нежелательные эффекты, губительно действуя на полезную флору и фауну, загрязняя продукты питания, корма и питьевую воду.
Остаточные количества гербицидов в агроэкосистемах подвергаются сложным физико-химическим и биологическим превращениям [40, 44, 126, 129]. Поведение и уровни накопления остатков в природных объектах и средах зависят от характера и интенсивности процессов миграции и детоксикации гербицидов. Для пестицидов в целом в агроценозах характерны следующие миграционные процессы [203]:
- снос с потоками воздуха при применении;
- испарение в атмосферу;
- поступление в атмосферу с частицами почвенной пыли; смыв на соседние участки и поступление в открытые водоемы;
- поступление за счет промывания и «провалов» через трещины и пустоты в глубокие слои почвы и грунтовые воды;
- транслокация в растения и вынос с урожаем.
В работе T.E.Waddell и B.T.Bower [203] приведен общий расчет баланса остаточных количеств пестицидов в агрофитоценозах. Согласно этим расчетам, от 20 до 65 % примененного количества пестицидов сохраняется и затем разлагается непосредственно в местах применения, 1...10 % аккумулируется в поверхностном слое почвы, от 30 до 55 % поступает в атмосферу, от 4 до 20 % подвергается транслокации в растения, 1...5 % поступает в поверхностные воды, менее 5 % мигрирует в глубь почвы и попадает в водоносные горизонты.
На поведение и состояние гербицидов в почве и растениях влияет значительное число. Комплекс факторов и их взаимосвязь в системе «гербицид-растение»
Разработаны многочисленные классификации, позволяющие оценить экологическую и токсиколого-гигиеническую опасность остаточных количеств препаратов. Одна из них основана на экологических и токсикологических характеристиках пестицидов, среди которых учитываются персистентность в почве, растениях и воде, коэффициенты миграции и накопления, действие на почвенный биоценоз и фитотоксическое действие, токсичность для полезных насекомых и рыб, образование стойких и токсичных продуктов разложения. Гербициды по этой классификации отнесены в основном к 3 и 4 классам, т.е. к малоопасным веществам [149]. Другая классификация, учитывающая персистентность гербицидов в конкретных почвенных условиях, позволяет ранжировать препараты по степени их экотоксикологической опасности как в абсолютном, так и в относительном выражении [97].
Пространственное распределение гербицидов по обработанным площадям, как правило, неравномерное, что обусловлено характером производственного внесения препаратов. Так, для ленацила на следующий день после применения коэффициент вариации локального распределения в пахотном слое достигал 166 %, через год после применения - 224 % [96]. В связи с неравномерностью распределения гербицидов необходим репрезентативный отбор проб почвы для анализа на содержание остаточных количеств, который позволил бы конкретно оценить уровни загрязнения сельхозугодий и фитотоксичность почв перед посевом чувствительных культур.
Значительная неравномерность распределения гербицидов на обрабатываемых участках отмечена и при их внесении с поливной водой, то есть в результате гербирригации. При использовании этой технологии существует также вероятность проникновения гербицидов в почву на большую глубину, что не только снижает их эффективность, но и создает опасность загрязнения грунтовых вод остаточными количествами [27, 138].
Серьезной экологической проблемой при использовании гербицидов является их смыв с сельскохозяйственных полей. Смытый гербицид может попасть в водоемы с последующим включением во всевозможные миграционные цепи [80].
Исследования, проведенные с сим-триазиновыми гербицидами, показали, что несмотря на малую растворимость, препараты этого класса могут интенсивно передвигаться вниз по склону, накапливаться у подножия и попадать в водоемы. Смыв триазинов с верхней части склона зависит от крутизны склона, количества и характера выпадения осадков, кратности и нормы внесения препарата. Важнейшим фактором, определяющим интенсивность смыва, является крутизна склона [40]. На поверхности почвы все гербициды под действием ультрафиолетовых лучей со временем распадаются в результате разрыва связей углерод - углерод, углерод - водород, водород - кислород и кислород - кислород. Фотолиз существенно снижает накопление гербицидов, оказавшихся на поверхности почвы. В почве инактивация гербицидов происходит в основном за счет деятельности микроорганизмов и почвенных ферментов [126].
Почва, содержащая остатки гербицидов, как правило, служит источником их поступления в смежные природные среды, а также через возделываемые культуры - в трофические цепи [145].
Поведение и персистентность гербицидов в почве в значительной мере зависят от их состояния, которое определяется преимущественно сорбционными процессами. Так, результаты исследования показали, что в серой лесной почве можно выделить пять форм остаточных количеств линурона: свободную, обменно-сорбированную, связанную с органическим веществом, связанную с гидроокислами, связанную с минеральными остатками [150].
Скорость их разложения существенно различается, поэтому со временем относительное содержание форм в почве изменяется. За 1,5 месяца экспонирования доля свободной и обменно-сорбированной форм снижается соответственно от 40 до 20 и от 12 до 5 %. Через 2 месяца эти формы гербицида не идентифицировались, оставшийся в почве препарат переходил в прочносвязанную форму, перераспределяясь между органическим веществом, гидроокислами и минеральным остатком почвы. За 5 месяцев доля препарата, связанная с органическим веществом, возрастала с 26 до 45...48 %, с гидроокислами - с 10 до 20 %, с минеральным остатком почвы — с 10 до 30...33%.
Хлорсульфурон умеренно сорбируется почвами, при этом величина сорбции возрастает при уменьшении рН и увеличении содержания органического вещества почвы. Скорость деградации гербицида не зависит от исходной нормы, режим влажности почвы практически не влияет на этот процесс, тогда как температурное воздействие четко проявляется и количественно описывается уравнением Аррениуса [77].
Изучение влияния типа почвы и ее агрохимических свойств на скорость детоксикации гербицидов показало, что во многих случаях фактором, определяющим этот процесс, является реакция среды почвы. Подобная закономерность, в частности, отмечена для хлорсульфурона [77] и 2,4-Д [25].
Изменение среды почвы может существенно влиять на состояние находящихся в ней остаточных количеств гербицидов и, следовательно, их персистентность и способность к миграции. В этом плане активную роль играют средства химизации (удобрения, мелиоранты и др.), влияющие на кислотность почвы. Так, при исследовании поведения хлорсульфурона в дерново-подзолистой почве и черноземе установлено, что применение минеральных удобрений, навоза и извести приводит к изменению рН почвы в пределах 2 единиц и соответствующему изменению в 1,5...2 раза сорбируемости и миграционной способности гербицида: пониженной кислотности соответствует пониженная сорбируемость и более высокая миграционная способность [161].
Выявлено отрицательное влияние аммонийных и фосфорных удобрений на самоочищающую способность почв от остаточных количеств 2,4-Д. Их воздействие происходит опосредованно, через подкисление почв и связанное с ним снижение биомассы микроорганизмов, а также через изменение сорбции молекул гербицида. Известкование снимает отрицательное воздействие удобрений [25].
Для отдельных гербицидов характерно образование в результате превращений в почве и растениях устойчивых метаболитов. Например, достаточно большой «шлейф» метаболитов (до 28 наименований) образуется при деградации трефлана, при этом часть из них обладает более высокой персистентностью, чем сам гербицид. На характер превращений трефлана существенно влияют температурный фактор и влажность почвы и практически не влияет тип почвы [26].
Современные представления о механизме замедленной флуоресценции фотосинтезирующих организмов
Замедленная флуоресценция (замедленная люминесценция, длительное послесвечение, фотореэмиссия), обнаруженная в 1951 году Арнольдом и Стрелером, состоит в том, что после светового возбуждения в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабое, длительно затухающее свечение, испускаемое хлорофиллом [178, 179, 201]. Отличие ЗФ от собственной флуоресценции хлорофилла а состоит в способе возбуждения молекулы пигмента. При флуоресценции синглетный уровень молекулы заполняется при прямом поглощении квантов света или миграции энергии от соседних молекул, поглотивших квант, а в случае ЗФ - за счет энергии, выделяемой в темновых химических реакциях. По современным представлениям [12, 42, 72, 76, 109, 154, 159] аккумуляция поглощенной фотосинтетическим аппаратом световой энергии в ФС II начинается с образования заряженной пары молекул порфиринов в реакционных центрах (РЦ): хлорофилла а с максимумом абсорбции при 680 нм (Р+б8о) и феофитина (Фф"). Дальнейшая стабилизация энергии фотосинтетической электронтранспортной цепи (ЭТЦ) осуществляется за счет последовательного переноса отрицательных зарядов (электронов) от РЦ ко вторичным хинонным акцепторам (QA И QB), а положительных зарядов - от РЦ в систему, где происходит разложение воды. Последняя донирует электроны, образующиеся при окислении воды, в РЦ. Эти этапы стабилизации энергии частично обратимы. При обратном переносе зарядов в РЦ они рекомбинируют с регенерацией возбужденного состояния хлорофилла (Р 6во)- Энергия возбуждения может быть излучена либо пигментом самого РЦ, либо молекулами хлорофилла из ближайшего окружения РЦ, т.е. ЗФ представляет собой типичную хемилюминесцентную реакцию, которая включает две стадии:
1) химическую - рекомбинация ион-радикальной пары Р+б8о, Фф") с образованием возбужденной молекулы (Р 68о);
2) физическую, на которой энергия возбужденной молекулы может либо рассеиваться в тепло, либо излучиться, а также мигрировать на соседнюю молекулу активатора или тушителя свечения.
Интенсивность свечения в такой реакции должна определяться скоростью рекомбинации зарядов в реакционных центрах, которая пропорциональна константе рекомбинации и числу реакционных центров в состоянии с разделенным зарядом. Кроме того, выход излучения зависит от вероятности образования возбужденных молекул пигмента в реакции рекомбинации и вероятности излучения возбужденной молекулой кванта света [184]. Этот тип преобразования химической энергии в световую с точки зрения механизма реакции считают наиболее простым, поскольку этап возбуждения молекулы пигмента не включает разрыва химических связей и образования новых. Для возбуждения молекулы достаточен перенос одного электрона на потенциальный эмиттер (молекулу пигмента).
Спектры возбуждения ЗФ совпадают со спектром действия фотосинтеза [192, 193]. Спектр излучения ЗФ аналогичен спектру флуоресценции хлорофилла a in vivo. Спектр излучения имеет два максимума при 685 и 735...740 нм, причем первый приблизительно в 5 раз больше, чем второй.
В настоящее время ЗФ регистрируют в широкой временной области от микросекунд до нескольких минут (и даже часов) с момента прекращения облучения. Сложную кинетику спада ЗФ рассматривают как сумму отдельных компонент, отличающихся по скорости затухания. Чтобы понять причину существования отдельных компонент ЗФ, рассмотрим последовательность перемещения зарядов в ФС II. Она может быть представлена в виде «пирамиды» состояний РЦ, отличающихся по степени стабилизации энергии в ЭТЦ (рис. 2.3).
Аккумуляция уловленной хлорофиллом и дополнительными пигментами световой энергии начинается с почти мгновенного разделения зарядов в РЦ проходящего за 1 пс (10" с). Появляются катион-радикал хлорофилла и анион-радикал феофитина (состояние 1):
Следующим этапом стабилизации энергии является перенос электрона от Фф" на хинонный акцептор QA (состояние 2). От момента поглощения кванта света до восстановления QA проходит 100...400 пс. Состояние 2 в 3-Ю6 раз стабильнее состояния 1, а обратный перенос с Q A на Фф может произойти за 200 мкс (2-Ю-4 с).
Однако когда первичный стабильный акцептор QA уже восстановлен (Q л ) то передача электрона от Фф на него возможна. Это приводит к резкому возрастанию вероятности обратного процесса рекомбинации зарядов Р 68оФф". Процесс совершается в течение 2...3 не, в результате регенерируется возбужденное состояние Р 680 и появляется излучение со временем жизни почти таким же, как и флуоресценция. Поэтому излучение, возникающее при забрасывании электрона от Фф" на возбужденный уровень Peso , называется радикалрекомбинационной флуоресценцией. По-видимому, этот механизм ответственен за так называемую переменную флуоресценцию. Ее увеличение в начале освещения фотосинтетически активного объекта вызвано возрастанием восстановленности QA
За этапом переноса электрона от Фф" на QA следует восстановление Р+б8о от вторичного донора Z (это равнозначно миграции положительного заряда от Р+680 на Z) (состояние 3). Процесс начинается через 20 не после поглощения кванта света и может продолжаться в течение нескольких миллисекунд в зависимости от состояния кислородвыделяющей системы. Восстановление Р+680 от Z происходит значительно быстрее, чем возвращение электрона от Q A на Р+б80 Этим самым предотвращается рекомбинация зарядов в РЦ в состоянии 2.
В дальнейшем почти одновременно происходят перенос положительных зарядов от Z+ в кислородвыделяющую систему (увеличение ее окисляющей силы S0— Sj— S2— S3— S4 (состояние 4) и перенос электрона от Q"A на Q B (состояние 5). В конечном счете из состояний 4 и 5 образуется состояние 6. Состояния 4, 5 и 6 обратимы. Прямые и обратные процессы переноса зарядов между этими состояниями могут осуществляться в миллисекундном временном интервале.
В работающем фотосинтетическом аппарате сразу после выключения освещения (что необходимо для регистрации ЗФ) имеется весь набор состояний РЦ по степени разделения зарядов. Кинетика затухания свечения в темноте зависит как от прямых реакций использования разделенных зарядов в фотосинтетическом процессе (переход к более стабильным состояниям), так и от обратных переносов зарядов, приводящих к появлению в РЦ заряженной пары Р+680Фф".
Сначала превалируют прямые процессы, а рекомбинирующие заряды составляют малую долю от тех, которые используются в прямых реакциях. В этот момент кинетика затухания ЗФ, естественно, определяется скоростью прямого переноса заряда (временем перехода РЦ из данного состояния в последующее). Свечение в этом случае называют свечением типа «утечки». Такой механизм приемлем для описания кинетики затухания свечения в микросекундной области регистрации. Однако современные экспериментальные данные пока не позволяют четко соотнести переходы между разными состояниями РЦ с наблюдаемыми кинетическими кривыми в этой временной области.
Оптимизация работы электронных блоков системы «Вектор»
Эффективное использование фотоумножителя для регистрации сверхслабых свечений растений зависит не только от правильного выбора типа ФЭУ, но и от условий получения оптимальных параметров его работы (режим питания, способ измерения сигнала на выходе ФЭУ, устранения влияния различных посторонних факторов, нарушающих работу ФЭУ).
Схема включения фотоумножителя для регистрации замедленной флуоресценции в режиме счета импульсов: Фк - фотокатод, А - анод, R„ - сопротивление нагрузки, Кл сопротивление делителя, С - конденсатор.
Распределение потенциалов между электродами ФЭУ осуществляется при помощи состоящего из цепочки последовательно соединенных сопротивлений делителя напряжения, который подключен к источнику высокого напряжения. Величина отдельных сопротивлений в делителе составляет несколько сотен килоом. Если сопротивления делителя будут меньше, то большой ток делителя может привести к нагреванию как делителя, так и колбы фотоумножителя, а следовательно, и увеличению темнового тока.
Выходной сигнал ФЭУ чувствителен к изменению напряжения источника питания, поэтому в качестве последнего используется высокостабильный источник напряжения с минимальным уровнем пульсаций БНВ-49, который представляет собой высоковольтный стабилизированный выпрямитель и по принципу действия относится к стабилизаторам компенсационного типа с отрицательной обратной связью со стороны высокого выходного напряжения. Минимальное выходное напряжение составляет не более 800 В, максимальное -не менее 1600 В.
Для выбора оптимального режима работы ФЭУ снимали зависимость отношения сигнал - шум от напряжения питания ФЭУ. Для этого сравнивали значение фототока при освещении фотокатода источником очень слабого света и темнового тока.
Фотоэлектронный умножитель в устройстве для регистрации замедленной флуоресценции может эксплуатироваться в двух режимах: токовом и квантовометрическом. В разработанном устройстве ФЭУ эксплуатируется в режиме счета импульсов, что улучшает порог чувствительности по сравнению с режимом измерения среднего анодного тока. При используемом режиме одиночный электрон, покинувший фотокатод и умноженный на динодах, дает на аноде импульс, длительность которого определяется временем пролета лавины электронов с последнего динода на анод и приблизительно равна 10" ...10" с. Чтобы зарегистрировать этот импульс при помощи стандартной аппаратуры, срабатывающей от импульсов длительностью не менее 10"6 с, его надо затянуть. Для этого подобрано соответствующее нагрузочное сопротивление и переходная емкость в анодной цепи.
Поскольку порог срабатывания стандартных пересчетных приборов равен нескольким вольтам, то такой импульс должен быть усилен. Для этой цели используется импульсный усилитель - блок усиления спектрометрический БУС 2-95. Питание блока производится от источника постоянного напряжения 12 В с нестабильностью не более ±0,5 % и пульсациями не более 5 мВ. Максимальный коэффициент усиления по напряжению равен 512 и изменяется грубо семью ступенями по 2 и плавно от 0,5 до 1 в пределах каждой ступени, минимальный коэффициент усиления равен 8, а с учетом плавной регулировки 4. Блок-схема БУС 2-95 приведена на рис. При подготовке ФЭУ для измерения сверхслабых свечений он в течение нескольких часов выдерживается в темноте под напряжением. Для настройки и контроля работы устройства используется электронный осциллограф.
К ФЭУ как детектору сверхслабых свечений, работающему в режиме счета квантов, предъявляются следующие основные требования: высокий квантовый выход фотокатода, малый термоток с фотокатода и первых динодов, высокий коэффициент вторичной эмиссии динодов. Кроме того, для обеспечения высокой пороговой чувствительности ФЭУ очень важно, чтобы среди выходных импульсов фотоумножителя преобладали одноэлектронные импульсы, то есть импульсы, создаваемые единичными электронами с фотокатода. Возможность выделения одноэлектронной составляющей в шумовом спектре ФЭУ определяется его конструкцией и техническими особенностями, а также режимом работы. Импульсы тока, вызываемые одиночными электронами с фотокатода, флуктуируют во времени и по амплитуде из-за статистического характера процессов возникновения термотока, фототока и вторичной электронной эмиссии. Распределение одноэлектронных импульсов должно подчиняться закону Пуассона, однако оно нарушается из-за явления термоэмиссии динодов, ионной и оптической обратных связей в ФЭУ.
Для оценки качества ФЭУ проводили амплитудный анализ импульсов на выходе ФЭУ, а также снимали его счетную характеристику, то есть зависимость числа импульсов на выходе ФЭУ от напряжения питания. На рис. 3.9 показана счетная характеристика ФЭУ-110.
На рис. 3.9 обозначены три зоны: А, В и С. Зона А соответствует тем напряжениям на ФЭУ, при которых его усиление недостаточно, чтобы регистрировать все одиночные электроны, попадающие на первый динод с фотокатода; зона В представляет плато счетной характеристики, то есть в этом интервале напряжений питания регистрируется каждый электрон, вылетающий с катода; зона С соответствует быстрому росту количества импульсов вследствие развития в ФЭУ побочных явлений.
Для выявления одноэлектронной составляющей шумов снимали счетную характеристику, используя слабую подсветку фотокатода, что увеличивало поток одиночных фотоэлектронов с катода. При этом в качестве источника света был выбран светодиод, так как спектр и интенсивность его излучения близки к биологическому источнику сверхслабого свечения. Величина светового потока от светодиода зависит от тока, проходящего через него, и может меняться в широких пределах (начиная от 102 квант/с). Спектр испускания светодиода представляет область шириной 100 нм с максимумом, который зависит от природы материала полупроводника.
