Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ ПЫЛЬЦЕВОЙ ОБНОЖКИ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ 9
1.1. Эпифитная микрофлора цветковых растений 9
1.2. Факторы, определяющие формирование эпифитной микрофлоры 13
1.3. Роль эпифитной микрофлоры в формировании безопасности продуктов пчеловодства 21
1.4. Грибы в составе микробных ценозов пыльцевой обножки 22
1.5. Санитарно-микробиологическая оценка пыльцевой обножки 26
Выводы 28
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 30
2.1. Палинологическое исследование пыльцевой обножки 32
2.2. Методика приготовления суспензии и её разведений 34
2.3. Определение КМАФАнМ 34
2.4. Определение плесневых грибов и дрожжей 34
2.5. Определение БГКП 35
2.6. Выявление бактерий рода Salmonella 35
2.7. Выявление бактерий Staphylococcus aureus 36
2.8. Выявление бактерий Bacillus cereus 37
2.9. Выделение микромицетов с пыльцевой обножки 38
2.10. Изучение чистых культур микромицетов 38
2.11. Микросъёмка 39
2.12. Определение токсичности выделенных штаммов грибов 40
2.13. Методы обработки первичных данных 41
Глава 3. МИКОБИОТА ПЫЛЬЦЕВОЙ ОБНОЖКИ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ И ФАКТОРЫ ЕЁ ФОРМИРОВАНИЯ 44
3.1. Оценка пыльцевой обножки по показателям микробиологической безопасности 44
3.2. Структура микоценозов пыльцевой обножки медоносных пчел .52
3.2.1. Родовое представительство микоценозов пыльцевой обноки 52
3.2.2. Видовое разнообразие микромицетов, выделенных с пыльцевой обножки 56
3.2.3. Характеристика видов, идентифицированных в микобиоте пыльцевой обножки 68
3.3. Роль пыльценосов в формировании микобиоты пыльцевой обножки 102
3.4. Влияние района сбора на формирование микоценоза пыльцевой обножки 111
3.5. Влияние года сбора на формирование микоценоза пыльцевой обножки 131
3.6. Санитарно-гигиеническая оценка микромицетов, выделенных с пыльцевой обножки пчел 134
3.6.1. Токсигенные и болезнетворные свойства микобионтов пыльцевой обножки 134
3.6.2 Первичное определение токсичности микромицетов пыльцевой обножки медоносных пчел 147
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 149
ВЫВОДЫ 155
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 156
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 158
ПРИЛОЖЕНИЯ 174
- Эпифитная микрофлора цветковых растений
- Палинологическое исследование пыльцевой обножки
- Оценка пыльцевой обножки по показателям микробиологической безопасности
Введение к работе
Актуальность проблемы. В поисках пищевых продуктов и терапевтических средств, необходимых для человека, в настоящее время все большее внимание уделяется натуральным продуктам, которые использовались на протяжении многих тысяч лет, к которым человек привык и хорошо переносит.
Многочисленные исследования свидетельствуют о нарушениях экологического равновесия, которые могут привести к серьезным последствиям для человека [94, 95, 98, 99]. Использование медоносных пчел и продуктов пчеловодства для изучения окружающей среды интересовало многих исследователей [54, 78, 100, 101, 109]. В продукты пчеловодства токсичные вещества (микотоксины токсинообразующих плесневых грибов) попадают через растения из воздуха, воды и почвы. Пыльцевая обножка является биологически активным продуктом пчеловодства (БАПП) и применяется в качестве ингредиента биологически активной добавки (БАД), поэтому требования к ее экологической чистоте должны быть высокими, отвечающими международным стандартам, что является актуальным на сегодняшний день для всей отрасли пчеловодства Российской Федерации.
Цветочная пыльца (обножка), собранная пчелами, представляет собой совокупность питательных и биологически активных компонентов растительного и животного (пчелиного) происхождения, формируемая пчелами из пыльцевых зерен растений путем добавления нектара и секрета их слюнных желез [2, 55, 142, 145]. Высокая биологическая ценность пыльцы, обеспечивающая восстановление состава необходимых метаболитов организма и нормализацию деятельности физиологических систем, достаточно выраженное лечебное действие на организм человека являются определяющими факторами высокого спроса на этот продукт [3, 15, 16, 38, 52, 53, 56, 57, 58, 122, 146, 148, 150]. В настоящее время в России заготавливают около 40 т пыльцевой обножки, причем этот продукт пчеловодства высоко ценится на международном рынке - 1 кг стоит несколько десятков долларов [68].
Но употребление пыльцевой обножки в качестве биологически активной добавки (БАД) может послужить причиной серьезных пищевых отравлений и даже заболеваний [137, 145, 148]. Свежесобранная обножка содержит значительное количество воды и легкоусвояемых углеводов, что служит благоприятной средой для роста и развития плесеней, дрожжей и гнилостных микроорганизмов. При повышении влажности более 10% в цветочной пыльце (обножке) происходят плесневение (развитие микроскопических грибов), гниение (развитие гнилостных бактерий), брожение (развитие дрожжей) [67, 124, 140]. Оценка микробиологической безопасности пыльцевой обножки разных регионов, в том числе и Сибири (Западная Сибирь), проведенная с 2000 по 2004 гг. исследователями лаборатории экологического мониторинга пчелиных показала, что половина из испытанных образцов не соответствовала требованиям стандарта по бактериальной обсемененности и по уровню контаминирования плесневыми грибами и дрожжами [141]. Основной ущерб наносят «плесени хранения» грибы родов Penicillium, Aspergillus, Mucor [8, 9, 47, 50, 59, 80, 93, 108, 118, 121, 152]. При неправильном хранении (повышенная влажность) плесневые грибы используют для своего развития почти все соединения пчелиной обножки. Разрушая органические вещества, плесени образуют продукты распада, придающие неприятный запах, изменяют цвет и структуру пыльцевой обножки. Опасность для здоровья человека заключается в способности обычных плесеней хранения образовывать токсичные вещества - микотоксины [7-Ю, 60, 61, 66, 86, 92, 125, 126, 130, 138, 139].
В.И. Полтев в 1967 г. из меда и цветочной пыльцы (пыльцевой обножки) выделил грибы, отнесенные им к 45 видам и разновидностям, из которых 11 энтомонопатогенных, 5 опасных для человека и животных [85]. В исследованных им образцах пыльцевой обножки обнаружено содержание спор грибов, которые при помощи насекомых (пчел) попадают в мед и пергу. Были выделены культуры Aspergillus niger, A. flavus, A. fumigatus, синтезирующие афлатоксины, обладающие гепатотоксическим, гепатоканцерогенным, мутагенным, тератогенным и иммунодепресивным свойствами, 12 видов токсинообразующих грибов рода Penicillium, 3 вида условно-патогенных культур рода Rhizopus, 5 видов дрожжевых грибов рода Candida и 1 вид рода Trichosporon. В 1997 г. Е.В. Руденко и И.Г. Маслий также выделили споры грибов из 50 исследованных ими образцов пыльцевой обножки медоносных пчел [127].
Вопрос о допустимом уровне загрязнения пыльцевой обножки вышеперечисленными биологическими поллютантами непростой и не может быть решен без изучения естественной микрофлоры этой БАД.
Известно, что состав микобиоты растений определяется совокупностью средообразующих факторов — видом, возрастом, органом растения, а так же условиями место произрастания [102, 154]. До настоящего времени исследователи не уделяли должного внимания изучению микрофлоры пыльцы, представляющей собой совокупность пыльцевых зерен, образующихся из спорогенных клеток в гнездах пыльника. Рабочие пчелы, добавляя к собранной, пыльце нектар растений и секрет гипофарингеальных желез, формируют пыльцевую обножку, обогащая микробиоту пыльцы собственной микрофлорой и дополнительным пищевым субстратом. При переносе пчелами комочков пыльцевой обножки на задних конечностях в гнездо происходит ее загрязнение микрофлорой атмосферного воздуха. Таким образом, можно предполагать наличие множественности детерминирующих факторов и их тесную сопряженность при формировании сообществ микобионтов пыльцевой обножки.
В настоящее время существующие и разрабатываемые методы тестирования и сертификации пчелиной обножки отличаются сложностью, значительной трудоемкостью и требуют дорогостоящих приборов и оборудования. Поэтому поиск новых решений санитарно-микробиологической безопасности пыльцевой обножки остается актуальным.
В связи с вышеизложенным можно сформулировать следующие цель и задачи работы.
Целью работы является установление роли экологических факторов в формировании микобиоты пыльцевой обножки медоносных пчел и показателей ее микробиологической безопасности.
Основные задачи:
1. Оценка микробиологической безопасности пыльцевой обножки медоносных пчел с пасек юга Западной Сибири.
Изучение видового разнообразия микобионтов пыльцевой обножки.
Установление влияния района и года сбора на количественные и качественные характеристики эпифитной микрофлоры пыльцевой обножки.
Определение роли ботанического происхождения пыльцевой обножки в формировании сообществ микромицетов.
5. Санитарно-гигиеническая оценка микроскопических грибов, выделенных с пыльцевой обножки.
Научная новизна работы. При изучении микромицетов пыльцевой обножки пасек юга Западной Сибири выделено и идентифицировано 53 вида микромицетов, в том числе 48 - впервые. Микобиота обножки представлена видами почвенной (рода Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Absidia, Mucor, Rhizopus, Cladosporium) и эпифитной (рода Alternaria, Trichosporon, Candida, Sporotrichum, Rhodotorula) экологических групп, в том числе токсиногенных {Aspergillus flavus, Penicillium viridicatum). Доля влияния района сбора на показатели микробиологической безопасности пыльцевой обножки составила 88%. Год, природно-климатические условия района сбора и ботаническое происхождение определяют формирование количественных и качественных характеристик микобиоты пыльцевой обножки.
Объект исследования. Микобиота пыльцевой обножки медоносных пчел. Предмет исследования. Факторы, влияющие на формирование микобиоты пыльцевой обножки медоносных пчел. Защищаемы положения:
Особенности состава микобиоты пыльцевой обножки, собранной в различных природно-климатических зонах юга Западной Сибири, и соответствие её показателей санитарно-гигиеническим нормативам.
Видовое разнообразие микобиоты пыльцевой обножки.
Природно-климатическая зона района, год сбора и ботаническое происхождение определяют формирование микоценозов пыльцевой обножки медоносных пчел.
Роль микобиоты в формировании микробиологической безопасности пыльцевой обножки медоносных пчел.
Практическая значимость работы.
Полученные данные могут служить основой для разработки нормативных документов по санитарно-гигиенической оценке БАД с использованием пыльцевой обножки и для пересмотра с учётом естественного уровня микробиоты обножки регламентации по контаминации плесневыми грибами и дрожжами с обязательным нормированием содержания микотоксинов.
Определены районы сбора обножки обеспечивающие её безопасность по микробиологическим и токсикологическим показателям.
Эпифитная микрофлора цветковых растений
Эпифитными называются микроорганизмы, которые живут, питаются и размножаются на поверхности надземных органов растений.
Микробная флора, ассоциированная с надземными органами растений разнообразна по составу и объединяет представителей различных систематических групп микроорганизмов. В состав филлосферного комплекса входят бактерии, дрожжевые и мицелиальные грибы [17, 21, 22, 24, 25, 39, 63, 65, 74, 75, 80, 96, 97, 118, 151, 152].
При прорастании растение выносит на своей поверхности из почвы типичные почвенные микроорганизмы [21, 22]. Со временем под влиянием окружающих условий качественный состав микробного сообщества на надземных органах растения меняется. Пространственная приуроченность микроорганизмов к определенным органам растения родо- и видоспецифична [154].
Устьица, имеющиеся на листьях, и цветы растений служат главными местами газообмена (СОг и Ог) растений с окружающей средой и одновременно местами выделений летучих веществ (эфирные масла, высшие спирты), которые в свою очередь служат субстратом для микроорганизмов [129, 143].
На разных видах растений формируемый микробный состав характеризуется количественной (численностью выделенных штаммов с единицы поверхности) и качественной (соотношением отдельных групп и видов микроорганизмов) оценкой микроценоза. Количественный и качественный состав микроорганизмов на органах цветковых растений изменяется на протяжении всего периода вегетации [5, 24, 25, 63, 65, 72, 80, 97, 106,118].
На поверхности растений описано до 50 видов разных бактерий [31]. Количественное соотношение отдельных представителей эпифитной бактериальной флоры от общего числа: Bad. herbicolla — ЗО — 60%, Bad. fluorescens и близкие формы - 40%; группа E.coli — aerogenes — 2%; остальные, в том числе молочнокислые - около 10%. Спорообразующих аэробов и анаэробов в эпифитной микрофлоре содержится мало [22, 64, 72].
Кроме бактериальной флоры, в группе эпифитов цветковых растений присутствуют дрожжи, особенно пигментные и слизеобразующие, родов Sporobolomyces, Rhodotorula, Torulopsis, Hanseniaspora, Candida, Cryptococcus, Pullularia, Trichosporon, Oospora и значительная часть токсинообразующих микроскопических грибов [5, 22, 24, 63, 75, 152]. Типичные представители эпифитной микрофлоры - микроскопические грибы - повреждают растения и сырье из них не во время вегетации, а в период уборки и особенно хранения при повышенной влажности. К ним относятся виды родов Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Alternaria [8, 9, 21, 48, 51, 81, 121, 139].
Большую часть бактериальной флоры цветковых растений составляют неспороносные палочки из рода Pseudomonas, активно размножающиеся на поверхности растений. Особенно часто встречается Ps. herbicola и Ps. fluorescens [22, 72, 80]. Бактерии Ps. fluorescens встречаются на разных органах растений — листьях, цветках и корнях, они способны использовать органические и минеральные формы азота, что является одной из причин их широкого распространения. Кроме этого, Ps. fluorescens обладает антибиотическими свойствами в отношении ряда бактерий, устойчив к антибиотикам и фитонцидам [64].
Количество бактерий группы кишечной палочки на растениях в зависимости от места их произрастания различно. Так, из всех культур, выделенных с листьев деревьев и кустарников, доля Е. coli составляла лишь 3,5%, с садовых растений — 32%. Предполагается, что бактерии этой группы заносят на растения насекомые при опылении цветков [64, 97]. Очевидно, и другие микроорганизмы кишечного тракта животных и насекомых могут приспосабливаться к эпифитному существованию. Обильное появление микроорганизмов родов Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Lactobacterium на растениях гороха, вики, овса и пшеницы в период массового цветения объясняется частым посещением растений насекомыми, которые являются распространителями микрофлоры окружающей среды [64,85,151].
Количественный и качественный состав группы молочнокислых бактерий на органах растений варьирует в зависимости от вида растения, фазы его развития и места произрастания, а также от сезона и количества выпавших осадков [64, 65, 96]. Эти бактерии обнаружены на листьях, цветках и семенах. Наибольшее количество микроорганизмов находится на растениях в периоды, близкие к цветению: у одних растений - в период бутонизации (янтак), других - во время цветения (люцерна) и начальной фазы созревания (кукуруза). Молочнокислые бактерии в относительно больших количествах, содержатся в филлосфере культурных растений. Дикорастущие растения вдали от населенных пунктов бедны ими. Количество бактерий возрастает на большинстве культурных и дикорастущих растений к моменту цветения или образования на них репродуктивных органов. Повсеместно молочнокислые бактерии в большом количестве обнаруживают в эпифитной микрофлоре в сезоны, характеризующиеся влажной теплой погодой. На растениях обнаружены следующие виды Str. faecalis, Leuc. mesenteroides, Leuc. dextranicum, L. plantarum, L. brevis, L. casei, L. buchneri, L. fermenti. Молочнокислые бактерии, выделенные из эпифитной микрофлоры, варьируют по своей биохимической активности. Наряду со слабыми кислотообразователями выделяют штаммы с высокой способностью накопления кислот [65, 96].
Палинологическое исследование пыльцевой обножки
Посев разведения проводили глубинным методом в плотную питательную среду МПА (мясо-пептонный агар) (ООО «БиоКомпас-С», г.Углич).
Разведения 1:1000, 1: 10000 вносили в две чашки Петри по 1 мл стерильной пипеткой и заливали расплавленной и охлажденной до температуры 45+1 С питательной средой, слоем 4-5 мм. Среду немедленно равномерно перемешивали с посевным материалом круговыми движениями чашки. После застывания среды чашки переворачивали и помещали в термостат. Инкубирование проводили в течение 72 ч, при температуре 30С. По истечении срока инкубации проводили подсчет выросших колоний [32]. 2.4. Определение плесневых грибов и дрожжей Согласно ГОСТу 10444.12-88, определение дрожжей и плесневых грибов проводили глубинным посевом 1 мл суспензии разведений 1:10 и 1:100 параллельно в две чашки Петри. Посевы заливали расплавленным и охлажденным до температуры 45±ГС питательным агаром Сабуро с 0,2% левомицетина (НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Среду равномерно перемешивали с посевным материалом и после застывания среды чашки переворачивали и помещали в термостат. Посевы инкубировали при температуре 24+ГС в течение 5 сут [29].
Через 3 сут термостатирования проводили предварительный, а через 5 сут окончательный учет результатов. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяли по морфологии колоний и микроморфологии культур. Количественный учет дрожжей и плесневых грибов проводили согласно ГОСТу Р 51446-99.
Разведения суспензии 1:10 и 1:100 (1 мл) приливали к 9 см3 жидкой селективной среды Кесслера (ООО «БиоКомпас-С», г.Углич). Инкубировали при температуре 36±ГС в течение 24—48 ч. Посевы просматривали через 24±2 часа. Рост микроорганизмов фиксировали при помутнении среды, образовании газа, подкислении среды (изменение цвета среды).
Для подтверждения принадлежности микроорганизмов, выросших на среде Кесслера к E.coli, проводили пересев на поверхность агаризованной среды Эндо) (ООО «БиоКомпас-С», г. Углич). Посевы инкубировали при температуре 36±ГС в течение 24±2 час. После инкубирования посевы просматривали и отмечали характерные колонии бледно-розового или темно-красного цвета с металлическим блеском. Для подтверждения принадлежности выросших колоний к Е. coli отбирали по 3 колонии каждого типа и готовили мазки для микроскопирования, которые окрашивали по Граму (ГОСТ 30425) [34].
С целью неселективного предварительного обогащения вносили 10 г пыльцевой обножки в 90 мл забуференной пептонной воды. Инкубировали при температуре 36±ГС в течение 18-20 часов.
Для селективного обогащения стерильной пипеткой по 10 см3 культуры переносили в 100 см3 магниевой и тетратионатной среды. Посевы инкубировали в течение 24 18 ч при (36±1)С на магниевой и при 43±ГС на тетратионатной среде.
После инкубирования на среде обогащения проводили выделение и идентификацию бактерий на агаризованных дифференциально-диагностических средах: висмут-сульфит агар (НПО «Питательные среды», г.Махачкала) и среда Эндо (ООО «БиоКомпас-С», г.Углич). Посевы инкубировали при 36±ГС в течение 24-48 ч.
После инкубирования посевов отмечали рост колоний, характерных для бактерий рода Salmonella: на висмут-сульфит агаре - черные с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком, на среде Эндо - колонии круглые, бесцветные или слегка розоватые, прозрачные.
Полученные колонии через 48 ч пересевали штрихом на косяк среды Клиглера (ООО «БиоКомпас-С», г. Углич) и инкубировали при 37±ГС. Затем по биохимическим характеристикам: ферментация лактозы (среда желтеет на скошенной части агара), глюкозы (среда желтеет в столбике), газообразование (появление пузырьков воздуха или разрыв среды в столбике), выделение сероводорода ( почернение среды на границе столбика и скошенной части среды) определяли принадлежность выделенных культур к роду Salmonella. При отрицательной реакции среда оставалась красной [35].
Оценка пыльцевой обножки по показателям микробиологической безопасности
Контроль качества полифлерной пыльцы регламентирован ГОСТом 28887-90 «Пыльца цветочная (обножка) сухая» и СанПиНом 2.3.2. 1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» [23, 33]. Микробную безопасность пчелиной обножки определяют многие факторы. Состав эпифитной микрофлоры влияет на качество пчелиной обножки, и зависит от времени, места и условий сбора, заготовки и хранения, что характерно для продуктов растительного происхождения [102, 103, 104, 106]. Нами изучена эпифитная микрофлора образцов пыльцевой обножки, собранной на пасеках юга Западной Сибири в разные годы.
В результате проведенных исследований установлено соответствие нормативным требованиям всех образцов пыльцевой обножки, собранных в 2002 и 2003 г., по общей микробной обсемененности и только 16,7% образцов соответствовало по показателю загрязненности плесневыми грибами. Большинство образцов обножки характеризовали превышением норматива (не более 100 КОЕ/г) в 1,4-3,3 раза. Показатель КМАФАнМ изменялся по районам сбора от (8,1±2,8) 102 до (1,1±0,6)хЮ2КОЕ/г, что на 1- 2 порядка ниже установленного стандартом уровня (1x104 КОЕ/г).
Недопустимый уровень загрязнения бактериями группы кишечной палочки установлен в образцах из Черепановского района Новосибирской области и Баевского района Алтайского края, собранных в 2003 г., т.е. в 28% обследованных образцов.
Условно-патогенные микроорганизмы Staphylococcus aureus и патогенные бактерии рода Salmonella не были выявлены ни в одном из исследованных образцов пыльцевой обножки.
Достоверное влияние района сбора (F FT) на микробную обсеменен-ность обножки выявлено в 2003 г., когда изменения этого показателя на 88% определялись местом сбора образцов. Год сбора оказывал незначительное влияние как на общую микробную обсемененность, так и на грибную микрофлору обножки (табл.2).
Слабая корреляция количественных показателей эпифитной микрофлоры обножки с её полифлерностью (г = 0,31) не позволяет судить о существенной роли ботанического происхождения в её формировании. Прослеживалась тенденция к снижению количества микромицетов с возрастанием видового разнообразия обножек в образце (г = - 0,29).
Санитарно-гигиеническая оценка обножки показывает, что в образцах, собранных в 2004 г. показатель КМАФАнМ изменялся по районам сбора от (5,7±2,5)х10 до (2,7±0,7)х10 КОЕ/г, что на 1-2 порядка ниже установленного стандартом уровня (табл. 3). Количество спор Bacillus cereus в микрофлоре обножки превышало регламентированный уровень во всех образцах, за исключением обножки, собранной на пасеке с. Мундыбаш Кемеровской области, что составило 12,5% всех исследованных образцов по этому показателю. В 37,5% образцов пыльцевой обножки обнаружен недопустимый уровень загрязнения бактериями группы кишечной палочки (БГКП) в образцах июньского и июльского сборов Залесовского района Алтайского края и Новосибирского района Новосибирской области. Условно патогенные бактерии Staphylococcus aureus и патогенные бактерии рода Salmonella так же, как и в образцах, собранных в 2002 и 2003 гг. не обнаружены.
Эпифитная микофлора пыльцевой обножки, собранной в 2004 г., ни по количественному, ни по качественному составу не зависела от района сбора. При анализе средних показателей количества микромицетов, выделенных с обножки 2004 г., установлено достоверное увеличение в образце из Новосибирского района Новосибирской области по сравнению с образцами, собранными в Мошковском районе Новосибирской области, Залесовском районе Алтайского края и пасеки с. Мундыбаш Кемеровской области (р = 0,01), а также в Коченевском районе Новосибирской области (р = 0,05)..
Установлено, что район сбора обножки не играет существенной роли (F FT) в уровне контаминирования грибной микрофлорой, определяя 20% вариации количества микромицетов в эпифитной микрофлоре образцов
