Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МИКРОБНОЙ ОЧИСТКИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ 7
1.1. Некоторые проблемы накопления шламов на объектах нефтегазовой отрасли 7
1.2. Приемы восстановления нефтезагрязненных природных объектов , 11
1.3. Особенности биорекультивации нефтезагрязненных почвенных экосистем 14
1.4. Микроорганизмы-деструкторы нефти и нефтепродуктов 17
-. 1.5. Перспективы использования в биотрансформации нефти и нефтепродуктов альго-бактериальных сообществ 23
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 30
2.1. Объекты исследований 30
2.2. Методы исследований 30
ГЛАВА 3. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМОЙ ТЕХНОГЕННОЙ ЭКОСИСТЕМЫ 36
3.1. Краткая характеристика района исследований 36
3.2. Экологическая характеристика исследуемых объектов 38
3.2.1. Химические показатели почвы и шламов 38
3.2.2. Микробиологические показатели почвы и шламов 49
3.2.2.1. Численность и биомасса микроорганизмов почвы и шламов по результатам люминисцентной микроскопии 49
3.2.2.2. Численность некоторых физиологических групп микроорганизмов почвы и шламов 51
3.2.2.3. Видовой состав углеводородокисляющих микроорганизмов шламов 52
3.3. Определение класса опасности шламов 55
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ ШЛАМОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ 63
4.1. Характеристика циано-бактериального сообщества, используемого в эксперименте 64
4.2. Химические показатели экспериментальных экосистем ., 68
4.3. Микробиологические показатели экспериментальных экосистем 77
4.3.1. Оценка биомассы микроорганизмов экспериментальных экосистем методом люминисцентной микрокопии 77
4.3.2. Оценка численности некоторых физиологических групп микроорганизмов экспериментальных экосистем 79
4.3.3. Оценка биологического разнообразия микроскопических грибов исследуемых объектов 81
4.3.4. Оценка активности микробиоценозов исследуемых экосистем по дыханию и биомассе микроорганизмов 83
4.4. Биотестирование экспериментальных экосистем 86
ГЛАВА 5. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЭКОСИСТЕМ МЕТОДОМ МУЛЬТИСУБСТРАТНОГО ТЕСТИРОВАНИЯ (МСТ) 94
ВЫВОДЫ 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
ПРИЛОЖЕНИЯ 128
- Некоторые проблемы накопления шламов на объектах нефтегазовой отрасли
- Краткая характеристика района исследований
- Характеристика циано-бактериального сообщества, используемого в эксперименте
Введение к работе
Актуальность проблемы. Актуальной проблемой современной
экологии является восстановление нефтезагрязненных почвенных и водных
экосистем. Применение механических или химических методов, как правило,
не дают желаемых результатов, позволяющих использовать данные объекты
в хозяйственной деятельности. В настоящее время наиболее перспективными
и эффективными методами очистки почв и водоемов от широкого круга
загрязняющих веществ являются приемы биоремедиации, основанные на
биостимуляции in situ или in vitro и биоаугментации ("биоулучшении")
(Бельков, 1995; Коронелли, 1996). Традиционно разрабатываемые и
применяемые технологии, базируются на использовании моно- или
поликультур бактерий, грибов и дрожжей. Однако, селектированные
культуры гетеротрофных микроорганизмов, традиционно используемые в
биотехнологической практике, часто обладают относительно узким спектром
биогеохимических функций. Природные сообщества, осуществляющие
круговорот биогенных элементов и трансформацию органических веществ,
характеризуются значительно более широким набором этих функций, так как
включают в себя представителей нескольких трофических уровней, в том
числе и фотосинтетиков: эукариотических водорослей, цианобактерий.
Особую группу в отношении устойчивости к различного рода загрязняющим
веществам, в том числе и нефтяным углеводородам, представляют собой
цианобактерий. К настоящему времени исследованы многие аспекты
физиологии и экологии цианобактерий (Горюнова и др., 1969; Пахомова,
1969; Штина, Голлербах, 1976; Зенова, Штина, 1990); некоторые механизмы
их адаптации к нефти и нефтепродуктам (Миронов, 1980; Тапочка, 1981);
возможность перехода к фотогетеротрофному образу жизни (Кабиров, 1982);
динамика популяционной плотности углеводородокисляющих
микроорганизмов в ассоциациях с цианобактериями (Гусев и др., 1982а,
5 W
19826; Линькова, 1982). Полученные сведения позволяют предположите, что использование потенциальных возможностей не только микробных, но и циано-бактериальных сообществ является перспективным направлением в совершенствовании технологий очистки, восстановления техногенных и природных водных и почвенных экосистем (Дзержинская, 1993; Сопрунова, 1997; Янкевич, 2002).
В настоящее время на очистных сооружениях
*' нефтеперерабатывающего комплекса России и стран СНГ накоплено более 7
млн. тонн нефтешламов (Окунев и др., 2000). На многих заводах проблема ликвидации этих отходов не решена, количество их постоянно растет, что приводит к увеличению антропогенной нагрузки на прилегающие территории и загрязнению земельных площадей. Вследствие этого встает необходимость поиска новых методов обезвреживания нефтесодержащих отходов.
у Целью работы являлось изучение процессов самоочищения
нефтесодержащих шламов и возможности активизации биодеструкции нефтяных углеводородов, входящих в состав шламов, интродуцируемым циано-бактериальным сообществом.
В соответствии с целью исследований были поставлены следующие задачи:
1. дать эколого-химическую характеристику шламов Астраханского газохимического комплекса (АГХК);
\$ 2. изучить микробиологический состав шламов;
выделить и изучить состав углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в состав шламов;
определить состав микроорганизмов циано-бактериального сообщества, выделенного из очистных сооружений АГХК;
5. исследовать роль углеводородокисляющих микроорганизмов щламов и интродуцируемых циано-бактериальных сообществ в ходе биодеструкции нефтяных углеводородов.
Научная новизна. Впервые проведены эколого-химические исследования и получена накопительная культура углеводородокисляющих микроорганизмов нефтесодержащих шламов АГХК; определен ее состав на основе данных хромато-масс-спектрометрии. Определен состав циано-бактериального сообщества, выделенного из очистных сооружений АГХК и используемого в эксперименте, методом хромато-масс-спектрометрии. Впервые циано-бактериальное сообщество использовано в виде сухой биомассы для экспериментального изучения активизации процесса биодеструкции нефтяных углеводородов, входящих в состав шламов.
Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные служат основой для разработки принципиально новых методов биоремедиации нефтезагрязненных объектов. Положительные результаты подтверждены актом лабораторных испытаний циано-бактериального сообщества в форме биопрепарата для деструкции нефтяных углеводородов шламов. Материалы исследований используются в учебном процессе института биологии и природопользования АГТУ и являются частью фундаментальной исследовательской темы «Исследование возможности восстановления техногенных экосистем для использования в народном хозяйстве».
Некоторые проблемы накопления шламов на объектах нефтегазовой отрасли
Нефтегазовая промышленность по уровню отрицательного воздействия % на окружающую среду занимает одно из первых мест среди ведущих добывающих и перерабатывающих отраслей. Все компоненты биосферы в районах нефте- и газодобычи испытывают интенсивную техногенную нагрузку, приводящую к нарушению равновесия в экосистемах. Для всех предприятий нефтегазодобывающей отрасли характерно образование нефтесодержащих жидких и твердых отходов - сточных вод и шламов. Шламы образуются при строительстве нефтяных и газовых скважин, при промысловой эксплуатации месторождений, переработке нефти, очистке сточных вод, содержащих нефть, а также при чистке резервуаров и другого оборудования. Иногда к шламам относят даже тяжелые жидкости и немаслянистые отходы, а также шламы от переработки и подпитывающих вод. Нефтяные шламы по составу чрезвычайно разнообразны и представляют собой сложные системы, состоящие из нефтепродуктов, воды и минеральной части (глина, песок, ил и т.д.), соотношение которых наблюдается в очень », широких пределах. Состав шламов может существенно различаться, т.к. IP зависит от типа и глубины перерабатываемого сырья (нефти), схем переработки, оборудования, типа коагулянта и др. (Мазлова, Мещеряков, 2001). Ф. Берне и Ж. Кордонье (Бродский, 1980) предложили следующую классификацию шламов нефтепереработки: 1) «плавающие» маслянистые шламы после переработки жидких отходов (шламы гравитационных сепараторов; флотационные шламы; излишки биологического ила, если они составляют небольшую фракцию этой категории и содержат немного масел); 2) тяжелые маслянистые шламы, часто содержащие песок (со дна емкостей и резервуаров; со дна водосборных колодцев и сепараторов; осадочные отложения обессоливающих установок); 3) немаслянистые шламы: образовавшиеся при декарбонизации под действием извести или при осветлении подпитывающей воды; остатки алкилирования; отработанные катализаторы; обесцвечивающая глина; излишки активного ила в том случае, когда его производство преобладает.
В основном шламы представляют собой тяжелые нефтяные остатки, содержащие в среднем по массе 10-56% нефтепродуктов, 30-85% воды и 1,3-46% твердых примесей (Мазлова, Мещеряков, 2001).
Из веществ, входящих в состав шламов, наибольшую опасность для почвы представляют минеральные соли, нефть и нефтепродукты. Как известно (Андреева и др., 1990), при нефтяном загрязнении тесно взаимодействуют три группы факторов: 1) сложность состава нефти, находящегося в процессе постоянного изменения; 2) сложность, гетерогенность состава и структуры любой экосистемы, находящихся в процессе постоянного развития и изменения; 3) многообразие и изменчивость внешних факторов, влияющих на экосистему (температуры, влажности, давления и т.д.).
Основным фактором, определяющим загрязняющие свойства шлама, является его состав и физико-химические свойства. Известно, что при загрязнении вод нефтью и нефтепродуктами в водную фазу переходят, прежде всего, ароматические и полициклические ароматические углеводороды (как правило, двух-четырехядерные) (Мясников и др., 1988). Учитывая это, ущерб от загрязнения нефтью и нефтепродуктами следует считать не по интегральному показателю, которым является содержание нефтепродуктов, а по отдельным компонентам (ароматическим и полиароматическим), обнаруженным в результате исследования (Мазлова, Мещеряков, 2001). Установлено, что основную роль в канцерогенном эффекте продуктов пирогенной переработки углеводородного сырья играет фракция 4-7 ядерных ПАУ. ПАУ, состоящие из двух и более ароматических колец, содержатся в нефти в количестве от 1 до 4% (Нефти СССР: Справочник., 1975).
Канцерогенными и опасными для человека и животных являются не только компоненты самой нефти (например, бензол и бенз(а)пирен), но и многочисленные продукты нефтехимии (винилхлорид, пестициды, ПХБ, галогенуглеводороды, нитрилы, гидразины и др.) Многие соединения, названных классов, а также представители полиароматических углеводородов включены в список загрязнителей приоритетных для Европейского Сообщества (Ревелль и др., 1995).
Попадание нефти и ее компонентов в окружающую среду (воздух, вода и почва) вызывает изменение физических, химических и биологических свойств и характеристик природной среды обитания, нарушаег ход естественных биохимических процессов. В ходе трансформации углеводородов нефти могут образовываться еще более токсичные соединения, чем исходные, обладающие канцерогенными и мутагенными свойствами и стойкие к микробиологическому разрушению (Ревелль и др., 1995; Корте и др., 1997). Токсичные химические вещества становятся крайне опасными, если они из сточных вод или промышленных отходов на химических свалках просачиваются в грунтовые воды и попадают в источники питьевой воды. Неглубоко залегающие грунтовые воды довольно чисты, так как почва и почвенные микроорганизмы отфильтровывают или разрушают многие примеси (Ревелль и др., 1995; Корте и др., 1997). Тем не менее, в ходе этих процессов не удаляется большая часть синтетических органических соединений (продуктов нефтехимического производства), а также многие нефтепродукты. Органические вещества часто бывают летучими и в принципе могли бы испаряться с поверхностных вод, однако в грунтовых водах они оказываются в ловушке. Кроме того, после фильтрования в верхних слоях грунтовые воды проникают в более глубокие слои, где очистки от загрязнений больше не происходит. Будучи однажды загрязнены, водоносные горизонты могут оставаться в таком состоянии сотнями или даже тысячами лет (Ревелль и др., 1995). Главным источником попадания органических соединений нефтяного происхождения в грунтовые воды служат твердые производственные отходы. Учитывая возможные последствия сброса таких отходов, следует признать их особенно опасными для загрязнения грунтовых вод.
Краткая характеристика района исследований
Одной из актуальных экологических проблем Нижнего Поволжья является влияние АГХК на экосистемы прилегающих территорий, выражающееся в воздействии выбросов загрязняющих веществ в атмосферу, водные объекты, а также в изменении прилегающих к местам эксплуатации газового месторождения почвенных территорий.
Исследование почв Северного Прикаспия проводились, начиная с 1949 года (Якубов, 1949). Почвенный покров территории, на которой располагается Астраханское газоконденсатное месторождение, представлен карбонатными песками, бурыми полупустынными почвами с пятнами солонцов, характерными для пустынь и полупустынь (Добровольский и др., 1998). Почвообразующими породами являются лессовидные суглинки (шоколадные глины), разнообразные по литологическому составу и засолению аллювиально-озерные осадки, песчаные и песчано-глинистые отложения древнеаллювиального происхождения.
Характерной чертой растительного покрова (Добровольский и др., 1998) является обедненность его видового состава, изреженность, комплексность и широкое участие эфемерных и эфемероидных видов растений. Преобладающая растительность составлена немногочисленными видами, среди которых полынь белая, полынь черная, мятлик луковичный, прутняк, песчаный овес, кумарчик (Почвенное районирование.., 1977). На поверхности почвы часто встречаются лишайники и цианобактерии, поверхность засоленых почв занята различными видами солянок.
Основные особенности бурых полупустынных почв - слабая гумусированность и малая мощность гумусового горизонта связана с засушливостью климата и малой биологической продуктивностью растительности. Быстрое разложение растительного опада и его интенсивная минерализация приводит к накоплению зольных элементов, среди которых преобладают соли щелочных металлов, чем и обусловлена солонцеватость бурых полупустынных почв (Добровольский и др., 1998).
Среди бурых полупустынных почв наряду с суглинистыми разновидностями широко распространены супесчаные и песчаные. Все названные почвы характеризуются неблагоприятными физическими свойствами - бесструктурностью, высокой плотностью иллювиальных горизонтов и их низкой водопроницаемостью, а . также обладают ничтожными запасами влаги и отличаются небольшой глубиной промачивания.
По результатам исследований лаборатории экологии и природопользования «АНИПИГаз» (Отчет о НИР АНИПИГаз, 1992) пески занимают большую часть территории Астраханского газоконденсатного месторождения. Они характеризуются низким содержанием гумуса и питательных веществ: в слое до 10 см процентное содержание гумуса определяется в интервале 0,14-0,22%, уменьшаясь в нижних слоях до 0,01-0,07%. Подвижные формы фосфора составляют 0,1-1,8 мг на 100 г почвы, а калия - 10,56-15,27 мг на 100г почвы. Реакция почвенного покрова нейтральная, слабоосновная, рН водной вытяжки на разных участках составляет 6,00-8,50.
Содержание гумуса в бурых почвах в горизонте А колеблется от 0,32 до 0,54%, в горизонте В - от 0,18 до 0,19%, подвижных форм фосфора - 1,72 -3,43-мг на 100 г в горизонте А и 0,14-0,15 мг - в горизонте В. Обменного калия содержится от 25,21 мг в горизонте А до 12,73 мг на 100 г почвы в горизонте В, т.е. степень обеспеченности калием высокая и средняя соответственно. Засоление почв преимущественно сульфатно-хлоридное, сульфатное, хлоридно-сульфатное. Повсеместно пески и бурые почвы подстилаются глинами, в том числе шоколадными и тяжелыми суглинками. Залегают они на глубине от 2 и более метров. В микропонижениях они находятся на меньшей глубине, и сами являются почвообразующими породами, такие участки почвы чаще всего засолены (Лапаева, 2002).
На глубине 0,5-11 см в этих почвах под экранирующей защитой тонкой пустынной корки обнаруживаются ПАУ, достигая 120-170 нг/г вблизи АГКМ и 30 нг/г на относительном удалении от комбината (Геннадиев и др., 1990). При этом, установлено, что, несмотря на достаточное удаление от комбината, интенсивность накопления ПАУ в почвах подчиненных ландшафтов высока и сопоставима с таковой в автономных почвах, находящихся на более близком расстоянии от источника загрязнения.
Характеристика циано-бактериального сообщества, используемого в эксперименте
В ходе экспериментальных работ использовали ЦБС, выделенное из очистных сооружений КОС-2 АГХК (Сопрунова, 1997). Ранее установлено, что основой его структуры, как в морфологическом, так и в физиологическом аспекте являются цианобактерии Oscillatoria sp. Они формируют как в условиях очистных сооружений, так и в накопительной культуре в лабораторных условиях, тяжи из плотных кожисто-слизистых дерновок в виде хлопьев, образованных переплетением их трихомов. На поверхности и в прослойках тяжей дисперсно располагаются трихомы, нити, слизистые колонии и единичные клетки других ассоциантов, среди которых обнаруживаются цианобактерии, диатомовые, эвгленовые, зеленые микроводоросли, бактерии, микромицеты, простейшие и ракообразные (Сопрунова, 1997). Среди физиологических групп микроорганизмов, входящих в состав сообщества, ранее определены гетеротрофные сапрофитные бактерии, олиготрофные, хемотрофные, углеводлитические (амило- и сахаролитические), углеводородокисляющие бактерии.
В лабораторных условиях выделенное из очистных сооружений сообщество культивируется на модифицированной искусственной жидкой минеральной среде BG-11 с нейтральным значением рН (7,0-7,1).
В ходе экспериментальных работ сообщество использовалось в виде биомассы, высушенной в естественных условиях при комнатной температуре. Численность микроорганизмов, входящих в состав сообщества, определялась высевом на твердые питательные среды методом предельных разведений и представлена в таблице 10. Для определения численности некоторых физиологических групп микроорганизмов, входящих в состав циано-бактериального сообщества, отбирали 1 г сформировавшегося на лабораторной среде BG-11 тяжа и помещали в небольшое количество физиологического раствора; стерильной препаровальной иглой разделяли на нити, затем, постепенно доливая до 10 мл, встряхивали вручную и на качалке до однородной суспензии (Дзержинская, 1993; Сопрунова, 1997), которую использовали в дальнейшем для приготовления соответствующих разведений и посева на твердые и жидкие питательные среды. Посеянные чашки Петри помещали в термостат, после чего по мере роста подсчитывали количество проросших на чашках колоний и определяли численность в пересчете на абсолютно сухое вещество (асв).
В ходе исследований установлено, что в состав сообщества входят в значительном количестве сапрофитные (1-Ю-1,8-10 КОЕ/г асв) и олиготрофные (1,7-106-2,6-107 КОЕ/г асв) микроорганизмы. В несколько меньшем количестве присутствуют амило- и сахаролитические бактерии (4,7-105-2,5-106 и 7,2-105-3,6-106 КОЕ/г асв соответственно). Минимальное количество отмечено для хемотрофных (до 6,2-10 КОЕ/г асв) и углеводородокисляющих (1,4-10 -6,7-10 КОЕ/г асв) бактерий.
Как в культурах, так и в природных условиях цианобактерии обычно развиваются в сложном сообществе с бактериями, грибами, микроводорослями. Между ассоциантами сообщества складываются взаимоотношения, обусловленные, как правило, экологическими условиями. Для изучения бактериальных ассоциантов, входящих в состав сообщества, использовали общепринятые в практике микробиологических исследований методы. Однако, сложность и гетерогенный состав ЦБС предопределяет трудность выбора сред, необходимых для выделения определенных групп микроорганизмов. Кроме того, условия существования циано-бактериальных сообществ в экстремальных экологических нишах, не всегда позволяют точно воспроизвести многие составляющие этих экосистем. Поэтому, для определения состава спутников циано-бактериальных сообществ наиболее информативными методами могут быть методы, основанные на изучении состава сообщества без выделения микроорганизмов на питательных средах. Одним из возможных методов изучения подобного рода сообществ может быть метод липидных маркеров.
Полученные при хемодифференциации данные по составу липидных компонентов ЦБС позволили отнести микроорганизмы, входящие в его состав, к определенным таксономическим группам, родам, а иногда и видам (рисунок 3).
Выделенное сообщество представлено 26-ю видами бактерий, относящимся к 21 роду. В целом, состав изучаемого сообщества представлен хемоорганотрофными бактериями, относящимися к родам Acetobacter, Actinomyces, Aquaspirillum, Bacillus, Bacteroides, Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Nocardia, Nocardiopsis, Pseudomonas, Streptomyces, Xanthomonas.
