Введение к работе
Актуальность проблемы.
Исследование молекулярных механизмов канцерогенеза является одним из важнейших направлений современной клеточной биологии и молекулярной онкологии. Это связано с тем, что проблема борьбы с опухолями различного происхождения все еще далека от своего решения. Одной из причин устойчивости трансформированных клеток к различным формам противоопухолевой терапии является подавление в них генетически запрограммированной клеточной гибели - апоптоза. Нарушение работы этой программы важно как для инициации трансформации, когда клетки с повреждениями ДНК и нарушениями контроля за событиями клеточного цикла не элиминируются, так и в процессе опухолевой прогрессии, когда клетки приобретают устойчивость к облучению и цитостатикам. Подавление апоптоза может быть связано как с инактивацией сенсоров проапоптотических стимулов (таких как опухолевый супрессор р53), так и с повышенной экспрессией антиапоптотических факторов, в частности, гена bcl-2 (Evan, Vousden, 2001). Действительно, было показано, что в химиорезистентных опухолях экспрессия антиапоптотического гена bcl-2, как правило, повышена. Белковый продукт этого гена способен подавлять клеточную гибель, вызванную широким спектром повреждающих воздействий и отсутствием ростовых факторов (Cory, Adams, 2002). Основным механизмом антиапоптотического действия Bcl-2 считается инактивация его проапоптотических гомологов путем димеризации с ними и, как следствие, подавление выхода из митохондрий цитохрома с, необходимого для активации прокаспазы-9 (Kluck et al., 1997).
Однако анализ клинических данных говорит о том, что повышенная экспрессия Bcl-2 не всегда коррелирует с плохим прогнозом (Watson et al., 2005), и, более того, Bcl-2-экспрессирующие клетки часто бывают менее злокачественными. Это свидетельствует о других функциях этого онкобелка, скорее, имеющих отношение к негативной регуляции пролиферации. Действительно, было показано, что в опухолях с повышенной экспрессией Bcl-2 удлиняется фаза G1 клеточного цикла и падает скорость пролиферации (O'Reilly et al., 1997; Murthy et al., 1999). Онкобелок Bcl-2 замедляет выход покоящихся клеток в цикл после стимуляции пролиферации ростовыми факторами (Marvel ег al., 1994; O'Reilly et al., 1996), вызывая накопление ингибитора циклин-киназных комплексов p27/Kip-l и снижение экспрессии циклинов Е и A (Vairo et al., 2000). С другой стороны, повышенная экспрессия Bcl-2 приводит к ускоренному старению клеток после обработки цитостатиками, при оксидативном стрессе и способствует Ras-зависимому старению (Rincheval et al., 2002; Schmitt et al., 2002; Tombor et al., 2003). Показано также, что Bcl-2 накапливается в стареющих клетках (Jarskog, Gilmore, 2000). Таким образом, действие Bcl-2 может быть связано с индукцией клеточного старения.
В условиях in vitro
k. PUI* МАЦИ
іьісокои проапоптотическс и чу^ГёЧ'й
перенос гена bcl-2 в траисформанты El A ic-Ha-ras,
с- - „РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ.Г
С. Петербург
оэ я»/
обладающие уникально высокой проапоптотическс и чув^г^т^^остьюш не
останавливающиеся в клеточном цикле после действия повреждающих агентов, приводит, наряду с подавлением апоптотической гибели, к восстановлению блоков клеточного цикла. В частности, при действии цитостатика адриа-мицина возникает необратимый блок клеточного цикла и индуцируется программа клеточного старения. Следовательно, Вс1-2 оказывает одновременное действие на важнейшие клеточные программы - контроль за клеточным циклом и апоптотическую гибель, что предполагает как существование множественных мишеней Вс1-2 в клетке, так и общие механизмы регуляции этих программ.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в изучении способности антиапоптотического гена bcl-2 влиять на регуляцию событий клеточного цикла трансформированных клеток грызунов и выявлении клеточных мишеней, ответственных за этот процесс.
В работе были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
-
доказать способность белка Bcl-2 вызывать блоки клеточного цикла трансформантов El A+c-Ha-ras, обладающих высокой проапоптотической чувствительностью, после обработки их различными повреждающими агентами и удаления ростовых факторов;
-
проанализировать способность цитостатика адриамицина вызывать ускоренное старение трансформированных клеток грызунов с повышенной экспрессией Bcl-2;
-
идентифицировать клеточные белки, взаимодействующие с Bcl-2, среди позитивных и негативных регуляторов клеточного цикла и оценить их функциональную значимость;
-
изучить роль циклин-киназных комплексов и транскрипционного фактора E2F-1 в реализации блоков клеточного цикла в Вс1-2-экспрессирующих трансформантах после действия повреждающих агентов;
-
оценить вклад компонентов МАР-киназного сигнального каскада в анти-пролиферативное действие гена bcl-2.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Перенос гена bcl-2 в трансформанты El A+c-Ha-ras приводит не только к подавлению апоптоза, но и к восстановлению способности трансформантов блокировать прохождение клеток по циклу после повреждения ДНК и удаления ростовых факторов.
-
В Bcl-2-экспрессирующих трансформантах блок клеточного цикла после действия повреждающих агентов может осуществляться без падения активности циклин-киназных комплексов.
-
Необратимый блок клеточного цикла в Bcl-2-экспрессирующих трансформантах после обработки их адриамицином является частью программы клеточного старения, индуцируемой цитостатиком.
4. Стресс-киназа р38 является мишенью гена bcl-2 в трансформантах
El A+c-Ha-ras после действия повреждающих агентов.
Научная новизна работы.
Впервые обнаружено, что с помощью введения антиапоптотического гена bcl-2 можно возвратить клеткам El A+c-Ha-ras утраченную при трансформации способность останавливаться на границе фаз G|/S клеточного цикла после действия повреждающих агентов. Впервые продемонстрирована способность Bcl-2 вызывать старение трансформантов Е1 A+c-Ha-ras после обработки цитостатиком адриамицином. Впервые показано, что механизм антипролифе-ративного эффекта Bcl-2 после повреждения не связан с подавлением активности циклин-киназных комплексов фаз d/S и транскрипционного фактора E2F-1. Впервые показано, что стресс-киназа р38 может служить антипролифера-тивной мишенью ВсІ-2 в трансформированных клетках, подвергнутых действию повреждающих агентов.
Теоретическое и практическое значение работы.
В работе показано, что онкобелок Bcl-2 совмещает в себе две функции, одновременно являясь связующим звеном и координатором программ апопто-за и остановки в клеточном цикле после действия повреждающих агентов. Клетки с повышенной экспрессией антиапоптотического белка Bcl-2 приобретают способность останавливаться в клеточном цикле после действия повреждающих агентов разной природы. Участие антиапоптотического фактора Bcl-2 в регуляции событий клеточного цикла расширяет наши понятия о взаимосвязи процессов регуляции клеточной пролиферации и выживания. Кроме того, антипролиферативный эффект Bcl-2, проявляющийся в клетках трансформантов после повреждения, представляет собой один из примеров блоков клеточного цикла, который реализуется без вовлечения циклин-киназных комплексов. Полученные результаты закладывают основу для дальнейшего изучения молекулярных механизмов антипролиферативного действия Bcl-2 среди белков-эффекторов р38 и p21/Waf-l. Новые клеточные линии, полученные в работе, можно использовать в дальнейших исследованиях, посвященных поиску клеточных мишеней Bcl-2. Наконец, показано, что стратегия борьбы с устойчивыми клетками может быть связана с поиском агентов, способных вызывать блок пролиферации по типу старения - состояния, когда опухолевая клетка необратимо теряет способность пролиферировать.
Материалы диссертации могут быть использованы в учебных лекционных курсах по клеточной биологии.
Апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 5 статей и сделано 5 тезисных сообщений на всероссийских и международных конференциях. Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах Лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток и Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации.
