Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Морфологические особенности и молекулярно-генетическая организация моноцитов и макрофагов 11
1.2. Молекулярно - генетический механизм апоптоза 15
1.2.1 Генетические аспекты программируемой клеточной гибели 16
1.2.2. Молекулярные механизмы передачи информации в ядро клетки 20
1.3. Влияние липидов на генетические процессы 21
1.3.1 Роль липидов в рецепции и внутриклеточной сигнализации 21
1.3.2. Эффекторные пути в регуляции апоптоза. Роль липидных доменов в функционировании клеточных рецепторов 26
1.3.3. Фагоцитоз погибающих клеток 31
1.3.4. Липиды ядра клеток в норме 33
1.3.5. Липидный состав ядер раковых клеток 3 5
1.4. Рак - болезнь генома. Апоптоз и рак 38
1.4.1. Ключевые гены, мутации в которых, предрасполагают к
раку молочной железы 38
1.4.2. Апоптоз при онкологических заболеваниях 45
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1. Материалы исследования 48
2.1.1. Объект исследования 48
2.2. Методы исследования 48
2.2.1. Выделение моноцитов из гепаринизированной крови 48
2.2.1.1 .Постановка эксперимента 49
2.2.2. Определение жизнеспособности клеток 49
2.2.3. Выделение ДНК ядерных клеток крови 50
2.2.4.Электрофорез ДНК моноцитов в агарозном геле 51
2.2.5. Приготовление агарозного геля 51
2.2.4. Световая и флуоресцентная микроскопия моноцитов 52
2.2.5. Окрашивание моноцитов по Паппенгейму-Крюкову 52
2.2.6. Окрашивание моноцитов акридиновым оранжевым 53
2.2.7. Окрашивание моноцитов Hoechst 33258 53
2.2.10. Получение липосом 54
2.3.Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 54
2.3.1. Проведение ПЦР для определения мутации 5382insC в 20 экзоне гена BRCA1 54
2.3.2. Проведение ПЦР для определения мутации 185delAG во 2 экзоне гена BRCA1 55
2.3.3. Проведение ПЦР для определения мутации 4154delA вії экзоне гена BRCA1 55
2.3.4.Проведение ПЦР для определения мутации 6174delT в 11 экзоне BRCA2 56
2.3.5. Проведение ПЦР для определения мутации Arg72Pro (R72P) р53 56
2.3.6. Методика проведения электрофореза в ПААГе 57
2.3.7. Окраска геля 58
2.3.8. Молекулярное моделирование взаимодействия липидов с ДНК 58
2.3.9. Постановка обратной транскрипции 59
2.3.10. Статистическая обработка данных 60
Глава 3. Результаты исследований 61
3.1 Морфологические особенности моноцитов в норме и при раке молочной железы 61
3.2. Выявление частот мутантных аллелей генов, предрасполагающих
к раку молочной железы 65
3.3. Влияние перекиси водорода и стауроспорина на гибель моноцитов, особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы 70
3.4. Влияние липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспорином апоптоз моноцитов 75
3.5. Моделирование методом молекулярной механики взаимодействий липидов с ДНК 82
3.6. Влияние холестерола на экспрессию генов раннего ответа 88
Глава 4. Обсуждение 92
Выводы 99
Практические рекомендации 100
Список литературы 101
- Генетические аспекты программируемой клеточной гибели
- Выделение моноцитов из гепаринизированной крови
- Проведение ПЦР для определения мутации 5382insC в 20 экзоне гена BRCA1
- Влияние перекиси водорода и стауроспорина на гибель моноцитов, особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что молекулярно-генетические исследования свидетельствуют о том, что рак является болезнью генома, механизмы его возникновения и связь этих механизмов с конкретными нарушениями функционального аппарата клеток мало изучены (Баранов B.C. и др., 2000). Вместе с тем, ценность таких данных для практической онкологии более чем очевидна. Во всех опухолях выявлены те или иные нарушения в структуре генетического аппарата или в функциональной активности генов, участвующих, прежде всего в контроле клеточной пролиферации. Расшифровка структуры генома человека позволила идентифицировать многие гены, мутации в которых играют ключевую роль в превращении нормальных клеток в опухолевые. Но факторы, вызывающие такие мутации в большинстве своем не изучены.
Заболевание раком молочной железы (РМЖ) представляет собой патогенетически полиморфное заболевание. В 10% случаев генетически связано с мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 (Breast Cancer), механизмы которых недостаточно изучены (Семиглазов В.Ф. и др., 1992; Карпухин А.В. и др., 2002; Поспехова Н.И. и др., 2003; Тихомирова О.С. и др., 2005).
В различных типах опухолей причинами их образования являются мутации в «горячих точках» гена р53. Мутация или даже небольшое изменение формы гена р53 приводит к утрате супрессивных свойств и стимуляции опухолевого процесса. В целом ряде исследований было показано, что изменения в гене р53 свидетельствуют о плохом прогнозе у больных РМЖ и причина этого до конца остается не известной (Коршунов А.Г. и др., 1996; Чумаков П.М., 2000).
Образование и накопление клона злокачественных клеток связано в том числе и с блокировкой программы апоптоза, что является важным фактом, хотя и недостаточно изученным. Постоянная активация промоторов опухолевого роста приводит к фенотипическим изменениям трансформированных клеток,
которые приобретают повышенную способность к пролиферации и утрачивают способность к дифференцировке. Благодаря этим свойствам они имеют преимущества перед клетками нормальных тканей при росте и выживании в одинаковых условиях (Райхлин Н.Т., 1996; 1998; Фильченков А.А. и др., 1999).
Актуальным является, что неспособность клеток претерпеть апоптоз может быть одним из факторов, обуславливающих патогенез различных заболеваний человека, включая рак, аутоиммунные заболевания и вирусные инфекции (Currach М.Е. et al., 1997; Владимирская Е. Б., 2000; Заридзе Д.Г., 2000).
Важным, но плохо изученным является то, что в злокачественной трансформации клеток и нарушении программы апоптоза могут участвовать липиды. Нарушение сигнальной функции липидов, объединенных в фосфоинозитидный и сфингомиелиновый циклы, может рассматриваться как важнейшее событие, переводящее клетку в разряд злокачественных (Белоконева О.С., 1993; Butthe Т.М. et al., 1994; Marshall C.J., 1995; Gordon S. et al., 1995; Проказова H.B. и др., 1998; Егорова А.Б. и др., 2001; Alan W. et al., 2002). В частности, показано, что липидный состав нормальных и опухолевых клеток существенно различается (Андреева Е.В., 1987; Терентьев А.А., 1989; Хышиктуев B.C. и др., 1993; Проказова Н.В., 1998). Модификации липидов, включая перекисное окисление липидов и действие фосфолипаз, характерные для патологически измененных клеток, могут усугубить расстройство жизненно важных клеточных функций, в том числе генетических процессов и апоптоза (Boesze-Battaglia К. et al., 1994; Стручков В.А., 2000). Поэтому актуальным является изучение роли компонентов липидов в регуляции пролиферации и апоптоза при канцерогенезе, что в дальнейшем может служить основой для поиска новых препаратов, применение которых позволит существенно снизить риск развития рака и улучшить результаты химиотерапии больных данной патологией.
При онкологических заболеваниях, в частности, при раке молочной железы наблюдается моноцитоз - увеличение количества моноцитов. Моноциты или
макрофаги отвечают на воздействие разнообразных агонистов, быстро гидролизуя мембранные фосфолипиды, что приводит к генерации большого числа внутриклеточных и экстраклеточных мессенджеров, в результате чего реализуется многофункциональный потенциал этих клеток (Клебанов Г. И. и др., 1999). Однако при подходе к опухоли, моноциты или макрофаги теряют свою подвижность, а также возможность передавать информацию об обнаруженной опухоли другим иммунокомпетентным клеткам (Iin F. et al., 1996; Заридзе Д.Г., 2000). В тоже время до настоящего времени ряд вопросов, касающихся поведения моноцитов изучены недостаточно. В частности, показано, что в моноцитах усиливается липидный метаболизм, интенсифицируются процессы пероксидации липидов (Щербаков В.И., 1990; Gordon S. et al, 1995; Зубова С.Г. и др., 2001).
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния липидов на индуцированный перекисью водорода и стауроспориномапоптоз моноцитов в норме и при раке молочной железы. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
выявить генетическую предрасположенность к раку молочной железы по мутациям в генах BRCA1/2 и р53;
исследовать особенности реализации программы апоптоза в моноцитах в норме и при раке молочной железы при действии индукторов (перекиси водорода и стауроспорина);
изучить влияние липидов (фосфатидилхолина, холестерина и сфингозина) на реализацию программы апоптоза в моноцитах.
Научная новизна работы. Впервые определены мутации в ключевых генах у жителей Республики Мордовия, предрасполагающие к раку молочной железы, оценена их частота. Новыми следует признать данные о том, что в выборке больных раком молочной железы наличие мутаций в гене BRCA1 было выявлено в 76 % случаев. Безусловной новизной обладают сведения о том, что среди выявленных мутаций основную долю заняла мутация 4154delA (56 %). Впервые обнаружено, что доля мутации 185delAG составила 31 % и 5382insC -13 %, а мутация 6174delT BRCA2 в исследуемой выборке больных не выявлена.
Изучены особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы. Перекись водорода и стауроспорин индуцируют апоптоз моноцитов у здоровых людей. У больных раком молочной железы ответ моноцитов на действие индукторов проявлялся, прежде всего, через склонность к гибели путем некроза. Впервые изучено влияние липидов сфингозина, фосфатидилхолина, холестерола на индуцированную перекисью водорода и стауроспорином гибель клеток. Наибольший проапоптотический эффект был выявлен при совместном действии индукторов апоптоза и сфингозина. У здоровых людей этот эффект обнаружен при действии сфингозина (0,001 и 0,01 ммоль/л) и стауроспорина. У больных раком молочной железы высокий проапоптотический эффект моноцитов был обнаружен только при действии 0,001 ммоль/л сфингозина совместно с 10 ммоль/л перекиси водорода и/или стауроспорином.
Впервые показано, что в моноцитах холестерол стимулирует экспрессию генов раннего ответа c-fos и р53.
Положения, выносимые на защиту:
Ключевыми мутациями клеток крови, предрасполагающими к раку молочной железы у жителей Республики Мордовия, являются мутации 4154delA, 185delAG и 5382insC в гене BRCA1, встречающиеся с частотами 56 %, 31 % и 13 % соответственно; мутация Arg72Pro (R72P) в гене р53 с частотой генотипов Arg/Pro, Arg/Arg, Pro/Pro - 38,5 %, 23,1 % и 38,5 % соответственно.
Перекись водорода и стауроспорин индуцируют апоптоз моноцитов у доноров, но при раке молочной железы приводят к гибели клеток, несущих мутации в ключевых генах (BRCA1, 2 и р53), преимущественно путем некроза.
Сфингозин и липосомы, содержащие фосфатидилхолин и холестерол, изменяют ответ моноцитов на действие индукторов апоптоза по-разному в зависимости от их природы и концентрации. Ответ клеток на действие липидов и индукторов апоптоза имеет существенные различия у здоровых людей и больных раком молочной железы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данные проведенного комплексного исследования вносят вклад в решение
фундаментальной проблемы биологии клетки - проблемы молекулярных механизмов гибели клетки при раке молочной железы, расширяя представления об участии липидов в апоптозе и некрозе.
Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и
практическую значимость. Оценка фрагментации ДНК может быть использована
в качестве одного из основных критериев прогноза способности клеток к
апоптозу при РМЖ. Влияние липидов на активность генетически-
опосредованные процессы может быть связано с изменением генной экспрессии
посредством взаимодействия липидов со специфическими
последовательностями ДНК. Полученные данные по выявлению в клетках крови мутаций в ключевых генах (BRCA1/2, р53) могут быть использованы в медицине для уточнения диагноза онкозаболеваний, в частности рака молочной железы.
Апробация работы. Материалы, представленные в диссертации, были доложены на международных научных конференциях: «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии, генетики животных» (Саранск, 2005), «Диагностика, терапия, профилактика социально значимых заболеваний человека» (Турция, 2007), на ежегодных Огаревских чтениях (научных конференциях Мордовского госуниверситета) (Саранск, 2006, 2007, 2008 г.), междунар. науч. конференции (вторые Ржавитинские чтения) (Саранск, 2008), междунар. науч. конференции, посвящен. 100-летию со дня рождения профессора Е.В. Сапожниковой (Саранск, 2008), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Генетические аспекты программируемой клеточной гибели
Апоптоз представляет собой сложную генетически детерминированную программу гибели клеток и ее эффективность зависимость от многих параметров клеток. Апоптоз, как целостная реакция клетки в ответ на действие повреждающего фактора, выражается в деградации ДНК, и в отличие от некроза, не сопровождается развитием воспаления и не вызывает поражения других клеток и тканей организма (Хансон К.П., 1998; Сторожаков Г.И. и др., 2000; Манских В.Н., 2007).
Апоптоз является рецептор-зависимым процессом. Существуют рецепторы, фактора некроза опухоли (ФНО-R) и Fas-антигена (Fas/APO-1 или CD-95), способные воспринимать сигнал апоптоза, тем самым запускают программу клеточной гибели (Parmer P.M. et al., 1993; Зенков H.K. и др., 1993; Cifone M.G. et al., 1995; Currach M. E. et al, 1997; Gordon S. et al., 1997). Установлено, что липидные компоненты плазматической мембраны, на которой расположены рецепторы ФНО и Fas, играют существенную роль в передаче сигнала апоптоза с поверхности клетки в ядро (Iin F. et al., 1997; Hiki N. et al., 1998; Ulevitch R.J. et al, 1999; Петухов В.И., 2000). Фосфолипиды являются источниками вторых посредников, участвующих в регуляции активности ферментов апоптоза, к которым относятся протеинкиназы, фосфатазы и протеазы (рис. 1) (Adam-Klages S. et al., 1996; Shwartz L.M. et al., 1996; Самуилов В.Д. и др., 2000). Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо (Bursch W., 1992; Хансон К.П., 1997). На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить (Самуилов В.Д. и др., 2000).
По данным Cohen I.I., Duke R.C., существуют регуляторы, которые блокируют или напротив, усиливают разрушительное действие первого эшелона. К ним относятся белки Вс1-2 (ингибиторы апоптоза: Al, Bcl-W, Bcl-XI) (Boise L.H., 1993; Yang E. et al., 1995) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bah, Bax, Mtd) (Зенков H.K. и др., 1993; Yang E. et al., 1995).
Каспаза 8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы 3 образуется каспаза 3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым (Хансон К.П., 1997).
В цикле работ (Цыпленкова В.Г. и др., 1996; Новиков B.C. и др., 1997) установлено, что эффекторные каспазы действуют более чем на 60 различных субстратов. В результате подвергаются расщеплению антиапоптозные белки семейства Bcl-2 (Boise L.H., 1993; Wang H.-G. et al., 1994; Yang E. et al., 1995; Щербаков A.M. и др., 2006).
Происходит гидролиз белков ламинов, арминирующих ядерную мембрану, что приводит к конденсации хроматина. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК.
Разрушаются белки, участвующие в регуляции цитоскелета (актин, фодрин, кератины, гельдозин), ответственные за клеточное деление (р-21 и р-27). Инактивируются белки, участвующие в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК. Мишенью каспаз является поли (ADP-рибозо) полимераза (ПАРП) - фермент, участвующий в репарации ДНК. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза (Меньшикова Е.Б. и др., 1999).
В работах Хансона К.П., Скулачева В.П. (год) описан процесс апоптоза, связанный с нарушением целостности мембран митохондрий. Причинами такого нарушения являются ряд цитотоксичных факторов; дефицит ростовых факторов, дефицит активных форм кислорода, повреждения в структуре ДНК. В результате увеличивается проницаемость внутренней мембраны митохондрий вследствии образования гигантских пор. Следствием раскрытия пор является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема (Скулачев В.П., 1994; Хансон К.П., 1997). Среди этих белков - ряд апоптозных факторов: цитохром С, прокаспазы 2, 3 и 9, белок AIF, представляющий флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа. Флавопротеин AIF транслоцируется в ядро, где активирует нуклеазы, которые разрывают ДНК на крупные фрагменты длиной 50 т.п.н. Апоптоз, вызванный этим фактором протекает без участия каспаз (Новиков B.C. и др., 1997). Митохондриальный фактор APAF-1 вызывает активацию каспаз-3 и 9, снимая ингибирующее действие белков-регуляторов (Цыпленкова В.Г. и др., 1996; Suliman A. et al., 2001).
В некоторых случаях апоптоз реализуется в результате комбинированного действия двух путей - с участием и рецепторов плазматической мембраны, и митохондриального цитохрома С. Повреждение в структуре ДНК ведет к накоплению в клетке белкового продукта гена р53, который может останавливать деление клеток и/или индуцировать апоптоз (Козначеев К.С. и др., 2001). Белок р53 является фактором транскрипции, регулирующим активность ряда генов (рис. 2).
Предполагается, что ответная реакция на образование белка р53 зависит от степени нарушения клеточного генома. При его чрезмерном нарушении, когда ДНК уже не поддается репарации, включается рецепторный и цитохром С-зависимый апоптозные каскады активации каспаз (Зенков Н.К. и др., 1993).
Таким образом, выяснение генетической детерминированности и молекулярных механизмов апоптоза играют важную роль. Апоптоз обеспечивает программу индивидуального развития организма (онтогенеза) и дифференцировку клеток, поддерживает тканевый гомеостаз, защищает от патогенов и т.д. Срыв программы апоптоза является причиной многих тяжелых заболеваний, в частности, нейродегенеративного характера (болезнь Альцгеймера, паркинсонизм, рассеянный склероз) (Самуилов В.Д. и др., 2000).
Выделение моноцитов из гепаринизированной крови
Превращение нормальной клетки в опухолевую происходит в результате накопления в генетическом аппарате совокупности ряда мутаций, ведущих к нарушению механизмов, контролирующих размножение и рост клеток. Инактивация онкосупрессорной функции гена wt р53 - универсальный шаг в развитии опухолей у человека, различные мутации wt р53 и образование mt р53, или блокада функции wt р53 самое частое генетическое нарушение, которое находят в раковых опухолях (Dobash Y. et al., 1993; Пальцев М.А. 1996; Коршунов А.Г. и др., 1996; 1998; Пальцев М.А. и др., 2000).
Высокая экспрессия mt р53 была найдена в 44% случаев рака молочной железы, и повышение её степени хорошо коррелировало с ростом пролиферативной активности, потерей гормональной чувствительности, дифференцировки и с плохим прогнозом. Увеличение экспрессии гена р53 ассоциируется с более коротким сроком жизни при раке желудка, молочной железы, толстой кишки, а также резистентностью к химиотерапии. Мутации гена р53 найдены практически во всех типах опухолей человека. Несмотря на некоторые исключения гиперэкспрессия Р53 в опухолях, как правило, является диагностическим и неблагоприятным прогностическим маркером и может быть связана лекарственной резистентностью (Gao X. et al., 1995; Райхлин Н.Т., 2002; Лобанова Ю.С. и др., 2007).
Клетки, не подвергшиеся апоптозу после повреждения ДНК, могут быть более склонными к большему накоплению генетических изменений по сравнению с нормальными клетками. Объяснение онкогенной трансформации клеток заключается в допущении дисрегуляции генов, которые контролируют клеточное деление, например, гены, кодирующие циклины и циклин-зависимые киназы. В норме клетки «способны» регистрировать такой дисбаланс и отвечать на него апоптозом. Апоптоз, следовательно, может являться механизмом защиты организма от клеток, претерпевших генетические изменения, которые предрасполагают их к пролиферации. Например, в отсутствии других трансформирующих событий дисрегуляция тус-онкогена ведет к индукции апоптоза в фибробластах, культивируемых на обедненной среде. Однако одновременная гиперэкспрессия гена bcl-2 предотвращает апоптоз (Погорелов В.М. и др., 1995; Galazka К. et al., 1999; Lowe S.W. et al., 2000; Блохин Д.Ю., 2004).
Противоопухолевые препараты, применённые в терапевтических дозах, вызывают гибель клеток-мишеней в основном по механизму апотоза, а нарушение апоптотической программы ведёт к снижению лекарственной чувствительности опухолей. Поскольку цитостатики даже с различающимися первичными мишенями могут активировать сходные пути индукции апоптоза клеток-мишеней, повреждение «программы гибели клеток» приводит к формированию их мультирезистентного фенотипа. Например, многие ДНК-повреждающие агенты активируют белок р53 и, таким образом, утрата этого продукта вследствие инактивирующей мутации гена или появление функционально неактивных мутантных форм белка снижает чувствительность клеток к цитостатикам. Восстановление в таких опухолевых клетках синтеза нормального белка р53 «дикого типа» (например, путём трансфекции соответствующей генной конструкцией) отменяет их устойчивость к лекарственно-индуцированному апоптозу. Одновременно р53 не является единственным внутриклеточным триггером для включения программы лекарственно-индуцированного апоптоза: будучи применяемыми, в соответствующей дозе, практически все противоопухолевые агенты способны индуцировать р53-независимый апоптоз опухолевых клеток. С другой стороны белковый продукт онкогена bcl-2 может повышать лекарственную резистентность к широкому кругу противоопухолевых соединений и даже предотвращать р53-независимый апоптоз (Wada R. et al., 1993; Чумаков П.М., 2000; Соколовская А.А. и др., 2001).
Неспособность клеток претерпеть апоптоз может быть одним из факторов, обуславливающих патогенез различных заболеваний человека, включая рак, аутоиммунные заболевания и вирусные инфекции.
При онкологических заболеваниях программа апоптоза нарушается. Резко увеличивается жизнеспособность опухолевых клеток и повышается вероятность возникновения метастаз (Погорелов В.М. и др., 1995).
Управление апоптозом играет существенную роль в лечении различных болезней. В главе обзор литературы нами были рассмотрены морфологические особенности и молекулярно-генетическая организация моноцитов и макрофагов, генетические аспекты программируемой клеточной гибели. Также рассмотрены молекулярно-генетический механизм апоптоза и механизмы передачи информации в ядро клетки.
В настоящее время возрос интерес к внутриядерным липидам, которые могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии наряду с негистоновыми белками. Выявлено, что липидный состав ядер клеток в норме и при раке заметно различается.
Были рассмотрены ключевые гены (BRCA 1/2, р53), предрасполагающие к раку молочной железы и мутации в них. При онкологических заболеваниях происходят нарушения программированной гибели смерти по пути апоптоза.
Проведение ПЦР для определения мутации 5382insC в 20 экзоне гена BRCA1
После проведения ПНР генов BRCA1/2 пробы инкубировали для образования гетеродуплексов ДНК в следующем режиме: 1) 96 - 4 мин. 2) 68 - 45 мин. 3) 4 - хранение. Для определения наличия мутации проводили электрофорез в 6% полиакриламидном геле, соотношение акриламида-бисакриламид 39:1 с использованием трис-боратного буфера. Режим электрофореза для геля размером 20x20 см - 270 В, 4 часа, пробег в геле краски ксиленцианол — 10 см и более.
Для проведения электрофореза из каждой пробирки отбирали 5 мкл инкубированного ГШР-продукта и смешивали с 4 мкл краски (ксиленцианол в 60% глицерине). После проведения ПЦР и рестрикции гена р53 проводили электрофорез для определения наличия мутаций. Использовали 10%-ый полиакриламидный гель со сшивкой 39:1 с использованием трис-боратного буфера с рН 8,9. Для проведения электрофореза из каждой пробирки отбирали 10 мкл образца, предварительно смешивая с красителем (ксиленцианол в 60% глицерине). Проводили электрофорез при напряжении источника тока 280 В в течение 1 часа.
После проведения электрофореза, гель осторожно промывали 2 раза дистиллированной водой. В ванночку с гелем добавляли 10% спиртовой раствор для осаждения ДНК и держали его в растворе 5 мин. Спирт сливали, 2 раза промывали дистиллированной водой. Добавляли 1% раствор азотной кислоты - 3 мин. Несколько раз промывали дистиллированной водой. Добавляли 0,2% раствор нитрата серебра - 20 мин. Раствор необходимо постоянно помешивать для более равномерной окраски геля. Несколько раз промывали гель дистиллированной водой. Проявляли гель 3% раствором карбоната натрия и 0,05% формальдегида. Для этого в ванночку наливали небольшое количество раствора и помешивали. Когда раствор темнеет, его сливали и добавляли новую порцию, пока не появятся окрашенные полосы ДНК нужной интенсивности. Для остановки проявления в ванночку добавляли 3% раствор уксусной кислоты. Гель тщательно промывали дистиллированной водой.
Молекулярное моделирование взаимодействия липидов с ДНК
Расчеты проведены с помощью метода молекулярной механики ММ+ с применением программы HeperChem 6.1 Molecular Modeling System фирмы Hypercude США. В этом методе полная энергия, ПОЛн, молекулярной системы представляется в виде суммы вкладов от растяжения химических связей (ER) и деформации валентных углов (Eg) относительно стандартных значений RQ и Q0, энергии торсионных взаимодействий (Еторс), энергии электростатических (Ее), ван-дер-ваальсовых (Евлв) взаимодействий между валентно несвязанными атомами и энергии водородных связей (н).
Это - эмпирический метод; параметры силового поля выбирают таким образом, чтобы воспроизвести строение и свойства достаточно широкого класса органических веществ (Стручков В.А. и др., 2000).
С использованием молекулярной механики для фрагментов двойной спирали ДНК, для свободных жирных кислот, фосфолипидов а также комплексов этих молекул (комплексов ДНК-лиганд) проведена полная оптимизация геометрии и определены значения энергии связи, Есвязи, лигандов с ДНК. Для ДНК взята В-форма без молекул воды, а для выполнения условия электронейтральности системы, добавлены ионы натрия.
Энергия связи ДНК с лигандами определялась как разность полных энергий комплекса ДНК-лиганд и изолированных молекул. С учетом геометрических особенностей В-формы ДНК в рамках модели двойной спирали, молекулы лигандов были размещены в малой или большой борозде, и, соответственно, оценивались энергии связи лигандов при комплексообразовании с малой или большой бороздкой ДНК. Во всех случаях для насыщенных частей углеводородных цепей лигандов была взята полностью заторможенная (шахматная) конформация. Это позволило получить объемную картинку (рис. 27).
Постановка обратной транскрипции
Содержание специфических мРНК определяли с использованием обратной транскрипции и ПЦР с применением специфических праймеров. РНК выделяли с помощью набора GenePakTM RNA PCR test (BlOcom). Обратную транскрипцию, совмещенную с ПЦР, проводили с использованием набора ОТ-ПЦР гексонуклеотидный (rendom) (Silecs) с помощью обратной транскриптазы продукта гена рої вируса лейкоза мыши Молони (Moloney Murine Leukemia Virus, M-MLV) (Сулимова Г.Е. и др., 1999).
Влияние перекиси водорода и стауроспорина на гибель моноцитов, особенности фрагментации ДНК в норме и при раке молочной железы
Нейтральные липиды (кардиолипин, сфингомиелин, холестерол) могут участвовать в регуляции синтеза нуклеиновых кислот как на уровне модификации активности протеинкиназы С, так и в результате взаимодействия с матрицей ДНК (Стручков В.А. и др., 1993).
Показано, что липидный состав нормальных и опухолевых клеток существенно различается. В частности, ДНК нормальных клеток содержит 0,6 — 2 % липидов, опухолевая - более 3 % липидов. В ДНК опухолевой клетки нейтральные липиды доминируют над фосфолипидами, прежде всего, возрастает содержание холестерола и его эфиров, а также триацилглицеролов (Стручков В.А. и др., 1993).
Липидная компонента плазматической мембраны играет существенную роль в передаче сигнала апоптоза с поверхности клетки в ядро. Фосфолипиды являются источником вторичных посредников, участвующими в регуляции активности ферментов апоптоза (протеинкиназы, фосфатазы, протеазы) (Стручков В.А. и др., 1993).
В этой связи отметим, что роль липидов к регуляции генетических процессов, в том числе апоптоза, может рассматриваться в различных аспектах.
Таким образом, различные липиды изменяли ответ клетки на действие индукторов по-разному, в зависимости от их природы и концентрации. При этом ответ моноцитов на действие индукторов гибели клеток имеет существенные различия у здоровых доноров и больных раком молочной железы, что свидетельствует о важной роли липидов в регуляции клеточных реакций при апоптозе и их модификации при РМЖ.
В ряде теоретических исследований показано, липиды могут влиять на стабильность двойной спирали ДНК, вызывая ее локальное расплетание или возникновение суперсперализованных витков ДНК (Федоров Б.Б. и др., 1997; Zhdanov R.I., 2004).
В известных работах проведены расчеты строения и энергий образования комплексов нуклеиновых кислот с фосфолипидами, свободными жирными кислотами, выявлены зависимости внутримолекулярных взаимодействий от первичной структуры нуклеиновых кислот и наличия катионного мостика (Mg"+) (Zhdanov R.I. et al., 2003). Нами с помощью программы HeperChemTM версии 6.1 проведены расчеты энергии образования комплексов нуклеиновых кислот с некоторыми липидами, которые не приведены в известных нам исследованиях. Исследования с помощью компьютерного моделирования были проведены совместно с к.б.н. Дудко А.А.
В методе молекулярной механики в системе ММ+ полная энергия Etot молекулярной системы представляется в виде суммы вкладов от деформации химических связей, валентных и торсионных углов относительно стандартных значений, энергии электростатических и ван-дер-вальсовых взаимодействий между валентно несвязанных атомов а также энергии водородных связей.
Для расчета структурных и энергетических характеристик комплексов ДНК-липид определено энергетически выгодное расположение липида в структуре ДНК, а также энергии образования липид-нуклеиновых комплексов и олигонуклеотидами с альтернативной последовательностью пиримидиновых (А-Т)ю и пуриновых (G-C)io. Во всех случаях для нуклеиновой кислоты принята В-форма, а для углеводного остова - 2 -энЭо-конформация, для выполнения условия электронейтральности системы добавлены ионы натрия, концентрация которых в ядре может достигать высоких значений (Стручков В.А. и др., 2000; Zhdanov R.I. et al., 2003; Жданов Р.И. и др., 2003).
Нами оценена эффективность взаимодействия липидов с определенными последовательностями ДНК. В частности, фосфатидилхолин, содержащий в первом положении пальмитиновую кислоту (16:0), а во втором положении цис-г/ис-г/ис-г/ис-арахидоновуго кислоту (20:4) при расположении в малой бороздке (А-Т)ю дает выигрыш энергии, равный 65 ккал\моль"] что на 21,9 ккал\моль больше аналогичной энергии связи липида, связавшегося с большой бороздкой (А-Т)ю ДНК. При этом энергия связи фосфатидилхолина зависит от нуклеотидного состава ДНК (табл. 2).
Ebond комплекса (G-C)io с ФХ в малой бороздке на 8,5 ккал\моль" меньше, чем энергия связи комплекса (А-Т)ю. В тоже время энергия комплекса соединения ФХ с большой бороздкой (G-C)io на 18,8 ккал\моль" больше, чем энергия связи с комплексом (А-Т)ю в большой бороздке. Отметим, что фосфатидилхолин преимущественно связывается с комплексом (А-Т)ю в малой бороздке, а с комплексом (G-C)io в большой (рис. 27).
Холестерол при помещении в малую бороздку (G-C)io дает выигрыш энергии, равный 38,5 ккал\моль"1 что на 13,5 ккал\моль" больше энергии связи ХЛ с большой бороздкой (G-C)io ДНК. Энергия связи ХЛ с комплексом боЛЬШОЙ И МаЛОЙ борОЗДКИ (А-Т)ю ПОСЛеДОВатеЛЬНОСТИ ИМееТ ЭНерГИЮ Ebond равную — 30 ккал\моль-1.
Таким образом, полученные помощью компьютерного моделирования результаты свидетельствую о возможности непосредственного взаимодействия липидов, в том числе, фосфатидилхолина и холестерола с определенными последовательностями ДНК. В научной литературе имеются данные о том, что энергия взаимодействия липидов с ДНК зависит как от химических свойств липидов, так и ДНК.
