Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные гистологические сведения о строении суставного хряща. Суставной хрящ в норме и в условиях действия механических факторов. Изменения суставного хряща при чрескостном дистракционном остеосинтезе (обзор литературы)
1.1. Современные гистологические сведения о строении суставного хряща. Рост, физиологическая регенерация, инволютивные изменения 13
1.2. Роль механических факторов в патогенезе остеоартроза 29
1.3. Репаративная регенерация суставного хряща 33
1.4. Методы количественной оценки изменений суставного хряща у животных и человека 39
1.5. Изменения суставного хряща при чрескостном дистракционном остеосинтезе 42
Глава 2. Материал, методика эксперимента, методы исследования
2.1. Материал исследования, методика эксперимента 48
2.2. Методы исследования 52
Результаты собственных исследований
Глава 3. Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща интактных собак в разные возрастные периоды 65
Глава 4. Структурная реорганизация суставного хряща при моделировании остеоартроза в эксперименте 90
Глава 5. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при удлинении конечности
5.1. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при диафизарном удлинении конечности в ручном режиме с темпом дистракции 1 мм за 4 приема 114
5.2. Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при диафизарном удлинении голени автодистракторм с темпом 1 мм за 60 приемов, осуществляемом в ночное время 139
5.3. Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при диафизарном удлинении голени автодистрактором с темпом 3 мм за 120 и 180 приемов 157
5.4. Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при метадиафизарном удлинении голени в ручном режиме с темпом дистракции 1 мм за 4 приема 180
Глава 6. Гистоморфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных и экспериментальных собак 189
Глава 7. Сопоставительный анализ морфофункционального состояния суставного хряща при возрастных изменениях, при ортопедическом удлинении голени и моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением (обсуждение результатов собственных исследований и заключение) 214
Выводы 242
Список литературы 245
- Роль механических факторов в патогенезе остеоартроза
- Методы исследования
- Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при диафизарном удлинении голени автодистракторм с темпом 1 мм за 60 приемов, осуществляемом в ночное время
- Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при метадиафизарном удлинении голени в ручном режиме с темпом дистракции 1 мм за 4 приема
Введение к работе
Актуальность темы
Удлинение нижних конечностей является одним из важных разделов хирургического лечения ортопедических заболеваний [Шевцов В.И. с соавт., 2004; Каплунов О.А. с соавт., 2010]. Эта операция применяется при врождённых и приобретённых укорочениях и деформациях, нарушениях роста при системных заболеваниях скелета либо при «субъективно низком» росте. Из всех существующих на сегодняшний день методов ортопедического удлинения именно метод Г.А. Илизарова получил международное признание и широкое внедрение в практику, однако вплоть до настоящего времени при его применении остаётся нерешённой проблема функциональной реабилитации пациентов - в частности, восстановление объёма движений в суставах [Аранович A.M. c соавт., 2005; Попков А.В., Попков Д.А., 2008].
В настоящее время достижения в области морфологических и биохимических исследований [Зайдман А.М. с соавт., 2004; Волошин Н.А., Григорьева Е.А., 2010; Павлова В.Н. с соавт., 2011] позволили приблизиться к пониманию особенностей морфофункциональных характеристик хряща, определяющих нормальное функционирование суставов.
Морфологические изменения суставного хряща в зависимости от условий удлинения конечности изучены крайне недостаточно. Известны лишь единичные работы, освещающие отдельные аспекты этой проблемы [Старцева И.А., Никитенко Е.Т., 1973; Stanitski D.F., 1994; Stanitski D.F. et al., 1996; Fink B. et al., 2001]. Исследование коленного сустава в эксперименте при удлинении большеберцовой кости с суточным темпом 1 мм за 1 прием на 20 от исходной длины выявило дегенеративные изменения в суставном хряще, которые подвергались обратному развитию по мере нормализации функции конечности [Старцева И.А., Никитенко Е.Т., 1973].
С целью уменьшения травматизации тканей при дистракционном остеосинтезе академик Г.А. Илизаров предложил разделить суточное удлинение (1 мм) на несколько или несколько десятков приёмов (разовых удлинений) - принцип дробной и высокодробной дистракции [Илизаров Г.А. с соавт., 1982]. В условиях дозированной низкодробной дистракции, в частности – разделении суточного удлинения в 1 мм на 2 приёма (разовое удлинение 0,5 мм) зарубежными исследователями [Stanitski D.F., 1994; Stanitski D.F. et al., 1996; Fink B. et al., 2001] были отмечены истончение, разволокнение суставного хряща, в части наблюдений выявлены некротические изменения. Если же при темпе дистракции 1 мм в сутки применяются специальные автоматические устройства, позволяющие увеличить дробность дистракции до 120 (разовое удлинение 1/120 мм), повреждения суставного хряща существенно уменьшаются по сравнению с ручным режимом дистракции - 1 мм в день за один приём [Nakamura E. et al., 1993, 1995].
Одной из актуальных задач при удлинении конечности, требующих теоретического обоснования и практического решения, является выбор оптимального режима дистракции c целью улучшения функциональных результатов и сокращения сроков лечения, поэтому разработка, экспериментальная апробация и морфологическое обоснование новых технологий дистракционного остеосинтеза продолжаются.
Представления об источниках и механизмах структурного самоподдержания и самовосстановления суставного хряща противоречивы. Недостаточно выяснены вопросы о возможности, месте и типе пролиферации хондроцитов. Учитывая зональную неоднородность суставного хряща, исследователи высказывали различные мнения о наличии какой-то определенной зоны, имеющей наибольшее значение для его роста и восстановления [Модяев В.П., 1983; Мажуга П.М., 1999; Павлова В.Н. с соавт., 2011; Mohr W., 1986; Wezeman F.H., 1998].
При изучении влияния различных факторов на состояние суставного хряща существует необходимость разработки способов объективной комплексной количественной морфологической оценки его деструктивно-репаративных и адаптационно-пластических изменений [Миронов С.П. с соавт., 2006]. Отсутствие стандартных методик (алгоритма количественного анализа) не позволяют однозначно судить о степени реактивно-деструктивных, регенеративных и адаптационно-пластических изменений гиалинового хряща суставов в разных экспериментальных условиях и в различные периоды постнатального онтогенеза.
В частности, несмотря на значительные успехи в распознавании патогенеза дегенеративно-дистрофических процессов в суставе, нет единого мнения о пусковых механизмах и степени структурных перестроек его компонентов при инволютивных изменениях и на ранних стадиях остеоартроза [Денисов-Никольский Ю.И. с соавт., 2005; Martin J.A., Duckwalter J.A., 2003; Yamamoto K. et al., 2005; Mrosek E.H. et al., 2006].
Проведенный анализ литературных данных свидетельствует об актуальности проблемы и необходимости проведения данного исследования.
Цель исследования
Выявить закономерности структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща коленного сустава при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения голени.
Задачи исследования
-
Изучить основные гистоморфометрические и метаболические характеристики суставного хряща интактных животных (собак) в различные периоды онтогенеза, уделяя особое внимание периодам интенсивного роста.
-
Определить основные тенденции изменений суставного хряща при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением.
-
В экспериментах по биомоделированию ортопедического удлинения конечности выявить зависимость изменений суставного хряща от режима ручной и автоматической дистракции («1 мм за 4 приёма в день», «1 мм за 8 приёмов в сутки», «1 мм за 60 приёмов в день», «3 мм за 180 приёмов в сутки»).
-
Разработать, адаптировать к объекту и применить в исследованиях технологию колориметрического анализа метахромазии в цифровых полноцветных изображениях микропрепаратов суставного хряща.
-
Провести сравнительный анализ морфофункционального состояния суставного хряща при автодистракции, проводимой в дневное и ночное время («1 мм за 60 приёмов в день», «1 мм за 60 приёмов в течение ночи»).
-
Изучить компенсаторно-приспособительные изменения суставного хряща при повышенном темпе автодистракции в зависимости от её дробности («3 мм за 120 приёмов» и «3 мм за 180 приёмов»).
-
Выявить особенности структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени у экспериментальных животных.
-
Провести сопоставительный анализ реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности в эксперименте и в процессе естественного роста.
-
Оценить морфофункциональное состояние синовиальной оболочки при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением, при инволютивных изменениях и при ортопедическом удлинении конечности.
Научная новизна
Впервые на достаточном материале с применением современных методов световой и электронной микроскопии, компьютерной морфометрии проведено гистологическое исследование нагружаемых участков суставного хряща коленного сустава экспериментальных и интактных животных в различные периоды онтогенеза. Изучены гистоморфометрические признаки реактивно-деструктивных, компенсаторно-приспособительных и адаптационно-пластических изменений суставного хряща в процессе удлинения голени при дробных режимах ручной и автоматической дистракции. Выявлена зависимость степени повреждения суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности в эксперименте. Разработана и адаптирована к объекту технология изготовления гистологических препаратов, позволяющая проводить комплексные количественные исследования цифровых изображений. Разработаны количественные критерии оценки степени реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в условиях удлинения конечности в эксперименте, в процессе естественного роста, естественных инволютивных изменений и при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением. Определены градации зрелости и признаки регенерации хряща (ядерно-цитоплазматический индекс, количество и численный состав изогенных групп), что позволило выявить потенциальные возможности клеточных элементов и хряща в целом. Разработана и адаптирована к объекту технология колориметрического анализа метахромазии в цифровых полноцветных изображениях микропрепаратов суставного хряща. Получены новые данные о влиянии на состояние суставного хряща разных режимов дистракции и теоретически обоснована возможность использования этих режимов в клинической практике.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные о структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща в периодах интенсивного онтогенетического роста и старения организма животных, при биомоделировании остеоартроза, а также в условиях клинически релевантного биомоделирования удлинения голени при применении широкого спектра ручных и автоматических режимов дистракции углубляют и уточняют представления об адаптивности и пластичности гиалинового хряща. Показано, что прогноз репаративных процессов в обозначенных условиях определяется не только выраженностью реактивно-деструктивных изменений клеток и матрикса, но и преимущественной их локализацией.
Полученные результаты могут быть использованы для научных исследований с использованием модельных систем in vivo для выявления механизмов структурно-функциональных изменений хондроцитов и межклеточного матрикса, а также их регуляции.
Разработанная методика количественного исследования суставного хряща может быть применена при изучении патологических изменений, эффектов роста, старения, влияния физических упражнений, иммобилизации, лекарственных препаратов на структуру хряща. Разработанная экспериментальная модель остеоартроза может быть использована для испытания средств профилактики и методов лечения.
Основные положения по результатам исследования, выносимые на защиту
-
При моделировании ортопедического удлинения голени экспериментальных животных наибольшие структурные преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени, чем при моделировании остеоартроза и возрастных инволютивных изменениях.
-
Регенерация суставного хряща в условиях удлинения конечности осуществляется за счет собственных возможностей хондроцитов, пролиферирующих преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах.
3. Применение автодистракции создаёт оптимальные условия для реализации адаптационно-пластических возможностей суставного хряща и повышает реабилитационные возможности метода дистракционного остеосинтеза.
4. Возрастные инволютивные изменения суставного хряща на протяжении длительного времени сопровождаются компенсаторными реакциями - усилением пролиферативной и секреторной активности хондроцитов.
5. При моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением наиболее выраженные деструктивные изменения хондроцитов развиваются в промежуточной зоне, существенная роль в патогенезе принадлежит функциональной и структурной денервации синовиальной оболочки.
6. Разработанная методология количественного исследования суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации, расширяет возможности гистоморфометрических исследований, повышает их точность, эффективность, обеспечивает воспроизводимость получаемых данных.
Внедрение результатов исследования
Результаты проведённых исследований используются при выполнении плановых научно-исследовательских работ в ФГБУ «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова». Подготовлены методические рекомендации и лекции, которые включены в программу кафедры усовершенствования врачей ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова». Получено 3 патента.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и в эксперименте» (г. Тюмень, 12-14 июня, 2008г.), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (г.Оренбург, 18-19 ноября, 2008г), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Цивьяновские чтения, г.Новосибирск, 2010г., 2011г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ» (г.Курган, 2011г., 2012г.), V Всероссийском симпозиуме с международным участием (г.Уфа, 2012г.), 8th International Conferense of Skeletal Deformities Correction (Cairo, Egipt, 20-22 June, 2012), Международном Конгрессе ASAMI и BR (Греция, 6-9 июня, 2012г.), Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов», посвященная памяти чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (г.Оренбург, 19-20 ноября, 2013г.).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 58 работ, из них 24 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикаций материалов кандидатских и докторских диссертаций, 2 методических рекомендации, 3 патента на изобретения.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста (без приложения). Состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов. Работа содержит 201 иллюстрацию, 33 таблицы (не считая таблиц приложения). В списке литературы 282 наименования, из них отечественных авторов – 152, зарубежных – 130. Приложение включает 14 таблиц и 4 рисунка.
Связь работы с научными программами
Работа включена в план научно-исследовательской работы кафедры усовершенствования врачей ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова».
Роль механических факторов в патогенезе остеоартроза
Суставной хрящ относится к категории гиалинового с той особенностью, что его свободная поверхность не покрыта надхрящницей. Ни одна из разновидностей хряща не испытывает в такой мере воздействий механических факторов, как суставной хрящ, что сказывается как на его строении, так и свойствах: он может подвергаться упругим деформациям и в то же время сохранять способность к обмену веществ и росту. Как и любая ткань, суставной хрящ состоит из клеточного компартмента и внеклеточного матрикса. Они находятся в тесной морфологической и функциональной связи друг с другом, представляя в целом единую тканевую систему. Клеточный компартмент составляет 5-10%, внеклеточный матрикс – 90-95% от общегообъема [28, 29, 30, 39].
С позиций клеточно-дифферонного состава хрящевая ткань относится к монодифферонным тканям. Дифферон хрящевой ткани: хондрогенные клетки – хондробласты – хондроциты. В типе растущих тканей, к которым относится хрящевая ткань, преобладают процессы роста. В таких тканях одновременно присутствуют клетки средней и конечной частей дифферона [165, 194, 195, 239].
В эмбриогенезе хондроциты появляются в результате дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток. Особенности дифференцировки клеток от слабодифференцированного состояния до старения и функциональной дегенерации отражены в ряде работ отечественных и зарубежных исследователей [57, 84, 130, 282]. Главным условием индукции эмбрионального хондрогенеза является повышенная плотность пролиферирующих мезенхимальных клеток [56, 158, 187, 276]. В дальнейшем клеткам хрящевой бластемы свойственны синтез коллагена II типа, преобладание синтеза хондроитин-4-сульфата над синтезом хондроитин-6-сульфата, минимальный митотический индекс, необратимость дифференцировки. В большинстве работ такие клетки именуются уже хондроцитами [15, 54, 103, 261].
Хондроциты участвуют в регуляции синтеза (анаболизм) и деградации (катаболизм) компонентов хрящевого матрикса, эти процессы в норме находятся в сбалансированном состоянии. Хрящевые клетки - имеют овальную форму. Они лежат в особых полостях межклеточного вещества – лакунах. В отличие от метаэпифизарного хряща в суставном хряще хондроцит занимает всю лакуну. Хондроциты часто образуют т.н. изогенные группы из 2-6 клеток, которые произошли из одной клетки. При этом некоторые хондроциты сохраняют способность к делению, а другие активно синтезируют компоненты межклеточного вещества [37, 38, 45, 156].
Структурно-функциональной единицей хряща является хондрон [42, 94]. В состав хондрона входят хондроцит, перицеллюлярный матрикс и перицеллюлярная капсула [160, 247, 262]. Уникальная роль хондроцитов состоит в продукции внеклеточного матрикса, который определяет форму и биомеханические свойства хряща [90, 92, 104, 230]. Доказано, что один и тот же дифференцированный хондроцит синтезирует и секретирует как коллаген, так и протеогликаны одновременно. Хондроцит обладает значительной чувствительностью к содержанию протеогликанов в окружающем матриксе и быстро реагирует на его изменения [170, 171, 180, 276].
Внеклеточный матрикс состоит из трёх первичных компонентов: коллагена, протеогликанов и воды. В суставном хряще выявлено несколько иммуногистохимически определяемых типов коллагена: II, VI, IX, X и XI. Тип II -доминирует, составляя 95% общего коллагена хряща [129, 186, 262]. Роль коллагеновых волокон хряща состоит в сопротивлении нагрузкам, возникающим при функционировании сустава [51, 90, 196, 246]. Используя достижения сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии, Р.И. Еникеев (1988), I.C. Clarke (1971), De Bont Lambert G.M. et al. (1986), A.P. Gwynn et al. (2000) показали, что коллагеновые волокна располагаются параллельно суставным поверхностям в поверхностной зоне, рандомически – в средней зоне и перпендикулярно – в глубокой зоне [51, 175, 200, 214].
Второй главный компонент внеклеточного матрикса – протеогликаны. Протеогликаны состоят из сердцевинной протеиновой цепочки и одной или больше гликозаминогликановых боковых цепей [129, 145]. Боковые цепочки гликозаминогликанов не формируют организованных филаментов, они склонны ветвиться рандомически. Поскольку каждая дисахаридная единица гликозаминогликанов содержит, по крайней мере, одну отрицательно заряженную сульфатную или карбоксильную группу, они, по сути, являются длинными отрицательно заряженными цепями. Эти отрицательные заряды связывают большое количество молекул воды, которая составляет до 80% веса суставного хряща и обеспечивает способность хряща эффективно гасить ударные волны [166]. Гистохимически сульфатированные гликозаминогликаны выявляются при окраске тиазиновыми красителями. При этом возникает явление метахромазии, обусловленное наличием в субстрате кислотных групп, например –OSO32– и – COO–, от плотности расположения которых зависит цвет, интенсивность реакции [70, 106, 115]. Сульфатированные гликозаминогликаны играют основную роль в поддержании гомеостаза хрящевой ткани, обеспечивают её прочность, архитектонику, межклеточные взаимодействия, митогенную активность и рецепторную функцию клеток [55]. Именно гликозаминогликаны обеспечивают упругость матрикса в течение жизни, что и обусловливает высокую способность хряща к адаптации [40, 41, 165, 176].
На гистологическом срезе суставного хряща отчетливо виден зональный полиморфизм хондроцитов. Клетки хряща на различной глубине залегания отличаются друг от друга по объему, форме, репродуктивным свойствам, плотностью распределения в матриксе, ультраструктурной организацией и др. Различия структурно-функционального состояния генетически однородных клеток являлись следствием их адаптации к условиям, складывающимся в процессе морфогенеза самого суставного хряща [81, 253].
Исследования ультраструктурных особенностей хрящевых клеток позволили выделить в суставном хряще три фенотипа хондроцитов [37, 92, 104, 253]. Хондроциты I типа характеризуется высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, содержат умеренно электронно-плотное ядро; комплекс Гольджи и эндоплазматическая сеть относительно слабо выражены, вакуоли немногочисленны. Они способны митотически делиться, т.е. являются источником репродукции изогенных групп клеток [104]. Преобладают в молодом, развивающемся хряще. Хондроциты II типа отличаются снижением ядерно цитоплазматического отношения. Это зрелые, высокодифференцированные, активные в секреторном отношении клетки, имеют высоко электронно-плотное неровной формы ядро; комплекс Гольджи и эндоплазматическая сеть хорошо развиты; постоянным цитоплазматическим включением является гликоген. Они обеспечивают образование и секрецию гликозаминогликанов и протеогликанов в межклеточное вещество. Хондроциты III типа отличаются самым низким ядерно цитоплазматическим отношением. Их ультраструктурные особенности свидетельствуют об активной секреторной деятельности. Клетки содержат значительные скопления гликогена. Эти клетки сохраняют способность к образованию и секреции белка (коллагена), но в них снижается синтез гликозаминогликанов [37, 92, 104, 253].
Методы исследования
Анализ цифрового материала был проведен общепринятыми для медико-биологических исследований методами вариационной статистики в программе Microsoft Excel 97 (программное обеспечение AtteStat, версия 1.0, Гайдышев И.П., 2003) [27]. После получения параметров описательной статистики анализировали характер распределения в вариационных рядах, относящихся к индивидуальным выборкам. Индивидуальные выборки были объединены в одну общую (генеральную совокупность) после статистической проверки нулевой гипотезы о межиндивидуальных различиях. В зависимости от характера распределения и объема выборок использовали либо критерий Вилкоксона, либо критерий Стьюдента [1, 3, 27]. Для параметра h хряща гистограмма распределения вариант имела форму гауссовой кривой, что характерно для нормального распределения (среднее арифметическое, медиана и мода совпадали), поэтому для определения достоверности различий применяли критерий Стьюдента. Для параметров VVch, NAch, Sch, VVn, VVс, NCI, dmin, dmax, Ff характерно ассиметричное распределение (среднее арифметическое, медиана и мода различаются), поэтому для определения достоверности различий применяли непараметрический критерий – критерий Вилкоксона.
Для всех параметров различия считали статистически достоверными на уровне значимости p 0,05.
В работе использовали приемы количественной телепатологии, относящиеся к «новым информационным технологиям» [152]: для количественного исследования цифровые изображения микропрепаратов суставного хряща транспортировали по телекоммуникационным каналам – локальной учрежденческой компьютерной сети. Первичный материал и результаты его обработки архивировали в базы данных разного уровня: оперативный архив формировали на жестком диске компьютера, тактический и стратегический – на компакт-дисках (СD-RW и СD-R соответственно). По нашему опыту, такая трехуровневая система необходима и достаточна для сохранности информации, и, в то же время, обеспечивает условия для текущего и ретроспективного анализа данных, а также позволяет осуществлять выборочный контроль качества и, при необходимости, вносить соответствующие коррективы [65, 66]. Глава 3. Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща интактных собак в разные возрастные периоды
При светооптическом исследовании гистологических препаратов у щенков в 2 месяца постнатальной жизни отсутствовала цитоархитектоника, характерная для зрелого суставного хряща. Матрикс средней части хряща и более глубоких слоев содержал сосуды (Рисунок 11).
При окраске тиазиновыми красителями (толуидиновый синий, метиленовый синий) во всех слоях хряща выявлялась -метахромазия разной степени интенсивности. Наиболее интенсивная реакция наблюдалась в территоральном матриксе среднего слоя (Рисунок 13А).
Одиночно расположенные хондроциты содержали большое количество секреторных включений (Рисунок 13Б). В хрящевых клетках накапливаются ШИК-положительные вещества (Рисунок 13В). В межклеточном матриксе ШИК-реакции была повышена в зоне гипертрофированных клеток. В более глубоких слоях хрящевые клетки расположены в виде многочленных изогенных групп (Рисунок 14А), состоящих в основном из гипертрофированных (пузырчатых) хондроцитов (Sch - 67,46±19,29 мкм2), что свидетельствовало о дегенеративных изменениях. Некоторые клетки глубоких слоёв хряща находились в состоянии гибели, отличались конденсированным состоянием ядра и цитоплазмы, сжатием, потерей контактов с межклеточным матриксом (Рисунок 14Б). Матрикс глубоких слоёв хряща пронизывали сосуды. Базофильная линия в этом возрасте ещё не сформирована, гипертрофированный хрящ непосредственно контактировал с межбалочным пространством субхондральной губчатой кости (Рисунок 14В).
У щенков в возрасте 4-х и 6-ти месяцев в суставном хряще более четко, по сравнению с предыдущим сроком, определялось зональное расположение хондроцитов. Хондроциты поверхностной зоны овальной формы, располагались параллельно суставной поверхности (Рисунок 15А, Б). В верхней части промежуточной зоны клетки образовывали двухчленные изогенные группы (Рисунок 15А), количество которых снижалось относительно предыдущего срока.
Наблюдалось снижение ШИК-реакции в цитоплазме клеток и умеренная ее интенсивность в межклеточном матриксе, что свидетельствовало о наличие в матриксе хряща нейтральных мукополисахаридов. Реакция метахромазии усиливалась по направлению от суставной поверхности к субхондральной кости. В глубокой зоне отмечена тенденция к колончатому расположению хондроцитов, отличавшихся большими размерами. В отдельных участках начала формироваться базофильная линия (Рисунок 16), что свидетельствовало о формировании зонального строения суставного хряща.
Сохранялись участки, в которых базофильная линия не была сформирована, гипертрофированный хрящ непосредственно соприкасался с субхондральной костью, которая имела трабекулярное строение. У щенков в 10 месяцев в суставном хряще отчетливо выражено зональное строение (Рисунок 17). Относительно предыдущего возрастного периода отмечено снижение клеточной плотности.
При светооптическом исследовании полутонких срезов суставного хряща были отмечены очаги с нарушением гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, в которых хондроциты были аномальной формы с пикнотичными ядрами (Рисунок 18).
Основная часть хондроцитов промежуточной и глубокой зон функционально активна (Рисунок 19), отмечены изогенные группы клеток, интенсивная метахромазия территориального матрикса. Лакуны с клеточным детритом и пустые лакуны были выявлены единично во всех зонах хряща.
В суставном хряще собак в возрасте 1,5 - 2х лет исследование цитоархитектоники позволило четко выделить три структурные зоны: поверхностную, обращенную к синовиальной полости сустава; среднюю или промежуточную и глубокую или базальную, обращенную к кости (Рисунок 21), что соответствовало обобщенной классификации зон суставного хряща [92, 103, 271]. Кроме того, наблюдалось увеличение доли глубокой зоны в общей площади среза хряща.
Ортохроматическая окраска метиленовым синим свидетельствовала о сравнительно невысоком содержании гликозаминогликанов. ШИК-позитивные соединения равномерно определялись по всей поверхностной зоне. Клетки продолговатой формы (Ff - 0,47±0,13; dmn - 1,28±1,17 мкм; dmax - 10,75±1,84 мкм) располагались преимущественно поодиночке в четко выраженных лакунах, вытянутых параллельно поверхности хряща (Рисунок 22). Хондроциты имели короткие, но хорошо выраженные отростки, небольшой объем цитоплазмы, ядерно-цитоплазматический индекс составлял 0,75±0,23. Некоторые клетки, расположенные ближе к суставной поверхности имели признаки деструкции -пикнотичные ядра, вакуолизированную цитоплазму.
Морфофункциональное состояние нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при диафизарном удлинении голени автодистракторм с темпом 1 мм за 60 приемов, осуществляемом в ночное время
Во всех зонах хряща хрящевые клетки уменьшены в размерах, занимали часть лакуны. Основная часть хондроцитов с признаками деструкции, клетки имели в основном мелкие, часто пикнотически сморщенные ядра и скудную цитоплазму. Увеличена доля бесклеточных полей. Во всех зонах выявлены пустые лакуны, функционально активные хондроциты отмечены единично.
В глубокой зоне хряща нарушена цитоархитектоника, хондроциты располагались одиночно, редко в виде 2-х членных изогенных групп.
На большем протяжении базофильная линия фрагментарно утолщена в виде гиперхромных глыбок (Рисунок 68А). В отдельных участках нарушалась непрерывность базофильной линии, отмечены ее разрывы. В таких участках отсутствовала зона кальцифицированного хряща, отмечено проникновение сосудов субхондральной зоны в глубокую зону хряща (Рисунок 68Б).
Глубокая зона суставного хряща собаки через 1 год после МОА. Бесклеточные поля, хондроциты в состоянии деструкции. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об.- 40; ок. - 12,5х. А – бесклеточные поля, хондроциты в состоянии деструкции, базофильная линия фрагментирована. Б – проникновение сосудов в хрящ. Гистохимическая реакция на сульфатированные гликозаминогликаны существенно ослаблена, межклеточное вещество поверхностной и промежуточной зон не окрашивалось, в глубокой зоне бледно-голубые участки чередовались с бесцветными (Рисунок 69).
Прогрессировало снижение морфометрируемых параметров: толщины хряща - 306,86±0,99 мкм; численной и объемной плотности хондроцитов – 5,75±1,36 и 4,77±1,24% соответственно. Подавлена пролиферативная активность хондроцитов, значительно снижена доля изогенных групп (4,8%) в общем объеме выборки. Сохранялись высокие значения доли пустых лакун – 27,08%.
Через 3 года после МОА при светооптическом исследовании полутонких срезов выявлено нарушение гомогенности межклеточного вещества, снижение интенсивности его окраски, особенно в поверхностной зоне и верхних слоях промежуточной зоны (Рисунок 70). Во всех зонах хряща нарушена цитоархитектоника, отмечена демаскировка коллагеновых волокон. Подавлена пролиферативная активность хрящевых клеток, изогенные группы отмечены единично. Гистохимическая реакция на сульфатированные гликозаминогликаны существенно ослаблена.
В поверхностной зоне хондроциты имели неправильную отросчатую форму, их цитоплазма интенсивно базофильна, ядра пикнотически окрашены. Отмечены хондроциты в состоянии деструкции, остатки погибших клеток. Нарушена гомогенность межклеточного вещества, оно стало волокнистым, перицеллюлярный матрикс выглядел бесцветным (Рисунок 71). По-видимому, хондроциты поверхностной зоны литически воздействовали на окружающее межклеточное вещество.
В промежуточной и глубокой зонах хряща снижена клеточная плотность, отмечены пустые лакуны, увеличена доля бесклеточных полей, четко выявлялся коллагеновый каркас, что свидетельствовало о резком обеднении матрикса протеогликанами, обеспечивающие гомогенность межклеточного вещества. В отличие от предыдущего срока эксперимента отмечены хондроциты, которые отличались увеличением размеров, имели светлые гомогенные ядра, хорошо развитую цитоплазму, содержащую трофические включения, миелиновые структуры (Рисунок 72).
Как и на предыдущем сроке эксперимента базофильная линия на большем протяжении фрагментарно утолщена в виде гиперхромных глыбок, в отдельных участках нарушалась ее непрерывность, отмечены разрывы. Истончалась зона кальцифицированного хряща, отмечено проникновение сосудов субхондральной зоны в глубокую зону хряща (Рисунок 73).
Фрагментация базофильной линии, истончение зоны кальцифицированного хряща, проникноверние сосудов в хрящ. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим-основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Таким образом, при данных условиях моделирования остеоартроза через 28 суток иммобилизации наблюдалось разволокнение суставной поверхности, выявлены дистрофические изменения, выражающиеся гибелью и деструкцией части хондроцитов. Выявленные неравномерное окрашивание межклеточного матрикса и значительное снижение интенсивности гистохимической реакции на сульфатированные гликозаминогликаны сопровождались снижением толщины хряща. В мыщелках бедренной кости отмечены остеопороз, очаговый остеосклероз субхондральной зоны, нарушение микроциркуляции - агрегация эритроцитов и «предтромбоз» кровеносных сосудов микроциркуляторного русла. Выявленные морфологические изменения соответствуют ранним стадиям остеоартроза - степень 1-3 (Всего 6 стадий по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза OARSI, 2006.). В отдаленные сроки эксперимента после моделирования остеоартроза в суставах отмечен нарастающий артроз. Выраженность признаков регенерации была незначительной, с увеличением срока эксперимента деструктивные изменения прогрессировали.
При клинических наблюдениях за экспериментальными животными к концу дистракции в смежных суставах определялись контрактуры, в коленном суставе амплитуда движений составляла 70-80 (норма 100–110). Через 30 суток фиксации животные щадили оперированную конечность, амплитуда движений в коленном суставе составляла 80-90, стопа находилась в физиологическом положении. Через месяц после снятия аппарата функция коленного сустава собак практически не отличалась от исходных значений.
Сканирующая электронная микроскопия и гистологическое исследование на светооптическом уровне выявили, что к концу периода дистракции наиболее ранние изменения появляются в поверхностной и глубокой зонах хряща. При исследовании суставной поверхности с помощью СЭМ выявлены очаги разволокнения c утратой бесклеточной пластинки и формированием узур, лакуны хондроцитов были часто вскрыты, часть из них не содержала клеток (Рисунок 74).
При микроскопии полутонких срезов хряща обнаружено нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, снижение интенсивности его окрашивания основными красителями, выявлены очаги разволокнения (Рисунок 75). В очагах разволокнения хондроциты аномальной формы, часть из них с пикнотичными ядрами, в состоянии гибели (Рисунок 75).
Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща мыщелков бедра при метадиафизарном удлинении голени в ручном режиме с темпом дистракции 1 мм за 4 приема
Увеличение доли лиц пожилого возраста среди населения большинства развитых и развивающихся стран, распространённость дегенеративно дистрофических заболеваний суставов и нерешённые задачи функциональной реабилитации ортопедо-травматологических больных, перенесших операции по удлинению конечности, определили актуальность, цель и задачи проведённого исследования.
В последние десятилетия изучение суставного хряща животных и человека при физиологических возрастных изменениях и патологических состояниях проводятся с помощью новых биомеханических методов [164], магнитно-резонансной томографии [184, 206, 207], конфокальной лазерной микроскопии в сочетании со стереологическим анализом [208, 249]. Несмотря на выявленные этими методами отличия количественных параметров структурной организации суставного хряща человека от разных видов животных, используемых в ортопедических исследованиях [208], биомоделирование повреждений и заболеваний суставного хряща остаётся актуальным.
В процессе экспериментальных исследований суставного хряща животных мы разработали адаптированную к объекту методологию его количественного исследования, включающую единую технологию изготовления микропрепаратов. Известно, что наиболее часто применяемые в гистологических исследованиях целлоидиновые и парафиновые срезы имеют толщину более 5 мкм, которая не позволяет четко дифференцировать границы хондроцитов и определять цитологические параметры без поправки на эффект Холмса [153, 163].
Оптимальными для определения морфометрических и стереометрических параметров структур суставного хряща (диаметр хондроцитов 10–20 мкм), являются полутонкие срезы толщиной 0,5–1 мкм; однако их малая – до 1 мм2 – стандартная площадь затрудняет получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Разработанная нами технология изготовление полутонких срезов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью увеличенной площади существенно повышает разрешение препаратов, позволяет проводить исследования на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации, формировать репрезентативную выборку для количественного исследования, получать достоверные количественные характеристики объекта, пренебрегая эффектом Холмса. После изготовления срезов эпоксидные блоки можно изучать в сканирующем электронном микроскопе и использовать без дополнительной шлифовки для проведения микроанализа суставного хряща и субхондральной кости.
Для количественной оценки состояния суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях по полутонким срезам увеличенной площади нами разработан алгоритм определения комплекса параметров в главе 2, раздел 2.2.4.. Примененная трехуровневая система архивирования информации обеспечила условия для текущего и ретроспективного анализа данных, корректировки и контроля результатов.
Разработанная методология позволила дополнить и уточнить сведения о нормальном и патологически изменённом суставном хряще экспериментальных животных (собак) в различные периоды постнатальной жизни по сравнению немногочисленными описательными данными, известными из литературы [277].
В главе 3 приведены результаты исследования возрастных изменений суставного хряща от 2 месяцев до 8 лет постнатальной жизни собак. В процессе роста организма суставной хрящ претерпевал значительные морфологические преобразования. Полученные данные согласуются с литературными [92], в раннем постнатальном периоде онтогенеза популяция клеток суставного хряща неоднородна: в его составе присутствуют малодифференцированные, высокодифференцированные и деградирующие хондроциты. С ростом организма соотношение клеток менялось – возрастало количество высокодифференцированных форм. В возрасте 5-ти и 8-ми лет большая часть клеток находилась в неактивном состоянии либо в фазе дегенерации. Результаты гистоморфометрического исследования показали, что основные количественные изменения хондроцитов по мере удаления от суставной поверхности заключались в увеличении размеров клеток и их ядер. Такая своеобразная перестройка морфологии хондроцитов отражает последовательный путь их созревания и дифференцировки [22, 81, 92, 195, 230].
В суставном хряще исследованных животных во всех возрастных периодах наблюдали признаки репродукции и отмирания клеток. С ростом организма морфометрические показатели суставного хряща характеризовались тем, что увеличивалось количество основного вещества, при этом количество клеток и изогенных групп уменьшалось, снижалась способность клеток к пролиферации, сохранялась способность к синтезу компонентов межклеточного вещества.
Особенностью суставного хряща мыщелков бедра собак являлось преобладание матрикса над клетками, доля клеточного компонента в исследуемом объекте в разные возрастные периоды составляла от 11,2 до 4,68% от общего объема.
В 2 месяца постнатальной жизни у щенков отсутствовала цитоархитектоника, характерная для зрелого суставного хряща. Матрикс средней части хряща и более глубоких слоев содержал сосуды. Зональное строение суставного хряща прослеживалось только с 4-х месячного возраста. По мнению H. Brommer et al. (2005), хрящ новорожденного «биомеханически белый» и потому гистологически гомогенный, но функциональная адаптация к механическим нагрузкам имеет место уже в ранней постнатальной жизни и результатом является всё более отчётливая гетерогенность морфофункциональных характеристик [164].
После четырех месяцев у щенка начинается новый период онтогенеза – ювенильный, или как его иначе называют, подростковый или предадультный, т.е. предшествующий взрослению. В этот период наблюдается интенсивный рост щенка, с 4-х до 10 месяцев происходит особенно бурный рост трубчатых костей, (щенок растет в высоту) [114]. В возрасте 6 и 10 месяцев в суставном хряще выявлено увеличение количества пустых лакун относительно предыдущих возрастных периодов. В возрасте 10 месяцев отмечено нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, снижалась объемная плотность хондроцитов. К 1,5-2 годам гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны восстанавливалась, снижалось количество пустых лакун, увеличивалась объемная плотность хондроцитов. Аналогичные изменения были выявлены при исследовании суставного хряща коленного сустава человека в подростковом возрасте [10].
К инволютивным изменениям можно отнести нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, изменение окраски межклеточного вещества (снижение интенсивности, очаговое окрашивание), отсутствие колончатого расположения клеток в глубокой зоне, нарушения базофильной линии (размытые контуры, фрагментация) и проникновение сосудов со стороны субхондральной зоны. Морфологическая организация хрящевой ткани суставов в возрасте 5-ти и 8-ми лет свидетельствовала о наличии деструктивно-дегенеративных процессов выраженных во всех зонах хряща, но интенсивнее в глубоких слоях (глубокая зона, зона кальцифицированного хряща) и субхондральной кости. Выраженные признаки инволютивных преобразований, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включали минимальные по сравнению с другими возрастными периодами показатели содержания серы, численной и объёмной плотности хондроцитов, но максимальную площадь хондроцитов поверхностной зоны хряща. По сравнению с двухлетним возрастом в этот период значительно увеличены доля пустых лакун и доля хондроцитов в составе изогенных групп, содержание кальция.
