Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Анализ методов исследования и особенностей природных ассоциаций углеводородокисляющих бактерий (ПАУОБ) 8
1.1.1. Выделение и исследование ПАУОБ 8
1.1.2. Качественный состав ПАУОБ 11
1.1.3. Физиологические и биохимические свойства углеводородокисляющих бактерий (УОБ) 13
1.1.3.1. Поверхностно-активные свойства УОБ 16
1.1.3.2. Бактериальный матрикс 20
1.1.3.3. Биохимические пути окисления углеводородов бактериями 22
1.2. Способы очистки нефтезагрязнённых акваторий 27
1.2.1. Биовосстановление нефтезагрязнённых акваторий 35
1.2.2. Биопрепараты 36
1.3. Методы определения эффективности бактериальной очистки нефтезагрязнённых акваторий 42
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48
2.1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 48
2.1.1. Определение анионного состава воды 48
2.1.2. Получение накопительных культур 48
2.1.3. Количественный учёт 49
2.1.4. Выделение чистых культур и идентификация УОБ 50
2.1.5. Экспресс-метод определения полианионной природы межклеточного матрикса УОБ с цетавлоном 51
2.1.6. Получение поверхностной плёнки микромицета 52
2.1.7. Конструирование биопрепарата 52
2.1.8. Определение тяжёлых металлов и других токсичных химических элементов в биопрепарате 55
2.1.9. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённой морской воды 56
2.1.9.1. Определение общего содержания углеводородов нефти методом ИК-спектроскопии 56
2.1.9.2. Определение содержания н-алканов методом ГХ—МС 57
2.1.9.3. Определение группового состава нефти методом жидкостной хроматографии 57
2.1.10. Экотоксикологическая оценка очищенной воды от нефти, культур ПАУОБ и разработанного биопрепарата методом биотестирования 59
2.1.11. Определение фотосинтетической активности микроводорослей спектральным методом 62
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 63
2.2.1. Выделение и исследование ПАУОБ Балтийского моря 63
2.2.1.1. Анионный состав воды Балтийского моря 63
2.2.1.2. Количество УОБ в морской воде 63
2.2.1.3. Культивирование ПАУОБ 64
2.2.2. Конструирование биопрепарата, включающего выделенные бактерии на природном носителе-подкормке и сорбент для нефти 67
2.2.2.1. Конструкция разработанного биопрепарата «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий 67
2.2.2.2. Микромицеты, используемые в качестве носителей-подкормок ПАУОБ / УОБ и сорбента для нефти 71
2.2.2.3. Результаты количественного химического анализа биопрепарата «Морской снег» 72
2.2.3. Определение эффективности очистки нефтезагрязнённых акваторий разработанным биопрепаратом 73
2.2.3.1. Определение общего содержания нефти методом ИК-спектроскопии 73
2.2.3.2. Хроматограммы изменения н-алканов и их количество в нефтезагрязнённой и очищенной ПАУОБ морской воде 73
2.2.3.3. Изменение группового состава углеводородов в морской воде, очищенной ПАУОБ от нефтяного загрязнения 76
2.2.3.4. Результаты биотестирования очищенной морской воды на микроводорослях Dunaliella salina и Chlorella minutissima 77
2.2.3.5. Результаты биотестирования культур ПАУОБ на микроводорослях, salina и С. minutissima 80
2.2.3.6. Результаты биотестирования очищенной морской воды на ракообразных Artemia salina 82
2.2.3.7. Результаты биотестирования культур ПАУОБ на ракообразных A. salina 84
2.2.3.8. Результаты биотестирования биопрепарата «Морской снег» на микроводорослях С. minutissima и ракообразных Л. salina... 85
2.2.3.9. Определение фотосинтетической активности микроводорослей спектральным методом 86
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 89
ВЫВОДЫ 106
БЛАГОДАРНОСТИ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 108
ПРИЛОЖЕНИЕ Экологический сертификат соответствия 124
- Выделение и исследование ПАУОБ
- Количественный учёт
- Конструкция разработанного биопрепарата «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий
Введение к работе
В Мировом океане по разным данным ежегодно разливается от 10 до 16 млн. тонн транспортируемой нефти, в том числе, только в Балтийском море эти разливы достигают нескольких тысяч тонн в год. На основании статистических данных можно с большой вероятностью прогнозировать, что общие объёмы разливов нефти будут возрастать.
При загрязнении акватории нефтью и нефтепродуктами происходит отравление и/или гибель большого количества организмов. Разрываются пищевые цепи, в результате чего прерываются связи в экосистеме и разрушается её живая составляющая. Поэтому даже при восстановлении жизни на данном участке возможны очень сильные преобразования в доминантах экологических ниш, что проявляется в уменьшении разнообразия живого мира. Это в свою очередь может привести к другим крупным негативным изменениям экосистемы.
Современные технологии, применяемые при ликвидациях разливов нефти, несовершенны, так как не исключают опасность проникновения и накопления углеводородов в пищевых цепях. Кроме того, недостатками существующих технологий являются их высокая стоимость и недостаточная эффективность очистки морской акватории. Поэтому необходимы эффективные способы восстановления морской среды от разливов нефти.
Нефтяное загрязнение представляет меньшую опасность для микроскопических обитателей акваторий - бактериопланктона. Это связано с тем, что бактерии являются единственным компонентом экосистемы, способным разрушать нефтяное загрязнения до простых соединений в процессе жизнедеятельности. Поэтому перспективным способом восстановления нефтезагрязнённых акваторий является микробиологический. Однако использованию микробиологического способа препятствуют следующие проблемы.
Известные биопрепараты разработаны для очистки почв и не пригодны для использования в акваториях.
Низкая эффективность таких биопрепаратов обусловлена конкурентным вытеснением, вымыванием, долгой адаптацией вносимых бактерий.
Таким образом, целью диссертационной работы являлась разработка нового биопрепарата для восстановления нефтезагрязнённых акваторий на примере Балтийского моря. Задачи исследования:
Выделение и исследование природных ассоциаций углеводородокисляющих бактерий (ПАУОБ) из Балтийского моря.
Конструирование биопрепарата, включающего выделенные бактерии на природном носителе-подкормке и сорбент для нефти.
Определение эффективности очистки нефтезагрязнённых акваторий разработанным биопрепаратом.
Научная новизна. Впервые предложено использовать в качестве активного начала биопрепарата ПАУОБ в виде накопительной культуры, что позволило сохранить всё биоразнообразие углеводородокисляющих бактерий (УОБ) и их спутников - бактерий-соокислителей, способствующих полноте деструкции нефти. Предложено использовать микромицеты Fusarium и Trichoderma в качестве носителя и подкормки для УОБ, а также как сорбент для нефти. Сформированы принципы конструирования биопрепаратов, на основе которых разработан 3-х уровневый биопрепарат «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий.
Для оценки эффективности очистки морской воды от нефти применён метод биотестирования на гидробиоытах, что позволило получить целостный комплексный ответ. Впервые показано, что
биотестирование на гидробионтах является не только адекватным и эффективным методом для определения качества очистки воды, но и тонким экологическим приёмом определения влияния нефтяного загрязнения и действия биопрепарата в пищевой цепи.
Практическая ценность. Предложена новая оригинальная конструкция биопрепарата, состоящая в том, что в нём нефть и бактерии локализуются в пространстве в плавучей кассете, адсорбируясь на селективных носителях и сорбентах. Степень очистки от нефти на лабораторной модели биопрепаратом составила за 7 суток более 70 %. Биотестированием продемонстрировано отсутствие острой токсичности очищенной морской воды для микроводорослей Dunaliella salina и Chlorella mimitissima и стимулирование их развития в очищенной воде и в накопительных культурах метаболитами ПАУОБ, а также безвредность для ракообразных Artemia salina очищенной морской воды и ПАУОБ в естественных экологических концентрациях. Подтверждена адекватность использования биотестирования для оценки качества очистки биопрепаратом морской воды и ПАУОБ. Предполагаемая рыночная стоимость биопрепарата на порядок меньше существующих. Способ получения биопрепарата защищен патентом на изобретение Российской Федерации №2327649 от 27.06.2008 г. «Способ получения биопрепарата для восстановления водоёмов, загрязнённых нефтью или нефтепродуктами».
Выделение и исследование ПАУОБ
Поверхностный слой океана представляет собой своеобразную экологическую нишу со специфическими физико-химическими особенностями (Hatcher et al., 1974). Изучение обитающих здесь микроорганизмов особенно интересно, так как в поверхностном слое часто концентрируются загрязняющие вещества, в частности нефть и нефтепродукты (Mills, 1978). О толщине поверхностного микрослоя океана до сих пор нет единого мнения. Согласно одной точке зрения, его толщина не превышает размера нескольких молекул, а по результатам последних исследований можно считать, что своеобразие структуры поверхностного слоя распространяется на ЮООА и более. В зависимости от характера волнения толщина этого слоя может оцениваться от 5-10" до 0,1 см, составляя в среднем около 0,02 см (Михайлов, 1978).
Для отбора проб из поверхностного микрослоя на микробиологический анализ разработаны различные приспособления, захватывающие в зависимости от конструкции слой толщиной от 22 мкм до 1-2 см (Ильинский, 1979; Цыбань, 1970; Sieburth, 1965). Как правило, чем тоньше слой воды, отбираемой для анализа, тем большие количества микроорганизмов удается обнаружить. Наибольшее распространение для отбора проб из поверхностного микрослоя получили методы Харвея (Harvey et al., 1973) и Гаррета (Garret, 1965). Также применяют пробоотборник с капроновой сеткой вместо металлической (Михайлов, 1978).
В ряде лабораторий для определения численности углеводородокисляющих бактерий методом предельных разведений используют морскую калийно-дрожжевую среду (МКД). В состав среды МКД кроме нефти входит дрожжевой экстракт (50 мг/л), который играет роль источника витаминов и факторов роста. В то же время это легкодоступный источник углерода для многих микроорганизмов (Коронелли и Ильинский, 1984).
Большинство авторов учитывают углеводородокисляющую микробиоту на безвитаминных средах, поскольку эти микроорганизмы синтезируют сами все необходимые для роста вещества. Вследствие этого отпадает необходимость в дрожжевом экстракте как источнике витаминов (Mills, 1978; Aaronson, 1970).
Морская калийно-дрожжевая среда готовится на основе морской воды. Морская вода, взятая в разных акваториях Мирового океана (Ильинский, 1995), неодинакова по солевому составу и может также содержать органические вещества, ингибирующие или стимулирующие рост бактерий. Использование жидкой среды, приготовленной на такой воде, может привести к завышению или занижению численности учитываемых на ней бактерий (Walker et al., 1976). Поэтому для приготовления жидких сред большинство морских микробиологов используют либо искусственно приготовленную морскую воду, либо «старую» морскую воду, что нашло отражение в практических руководствах и статьях (ZoBell, 1946b; Aaronson, 1970; Mills et al., 2003; Akagi, 1980). Для получения «старой» морской воды свежую воду выдерживают в темноте в течение нескольких месяцев (в зависимости от количества в ней органических веществ) до полной их минерализации (Aaronson, 1970; Коронелли и Ильинский, 1984).
Важную роль при учете углеводородокисляющих бактерий на жидких средах играет буферность среды: недостаточная буферкость приводит к занижению результатов определения численности (Mills, 1978). Буферность среды МКД очень низка — она содержит малые количества фосфатов, и кроме этого в ее состав входит соль слабого основания и сильной кислоты (NH4CI), существенно подкисляющая среду. Вероятно, для устранения этого действия авторы методики рекомендуют добавлять NaOH до рН 7,2-7,5. В результате буферная система морской воды, на которой готовится среда МКД, нарушается. Большое значение для получения адекватных сведений о численности бактерий в природных водах наряду с составом среды имеют условия и сроки инкубирования посевов. Инкубировать посевы желательно при температуре, близкой естественной в месте отбора пробы. Срок инкубации посевов зависит от температуры и колеблется от 2 недель (при 20С) до 1 месяца и более (при 2—5С) (Коронелли и Ильинский, 1984).
Для учета численности углеводородокисляющих бактерий методом предельных разведений предложен метод, основанный на использовании среды Миллса с соавторами (среда ММС) (Mills, 1978). ММС имеет стабильный солевой состав, достаточную буферность и не содержит посторонней органики. Эта среда успешно опробована для учета углеводородокисляющей микробиоты. Солевой состав среды ММС следующий, г/л: NaCl - 24,0; MgS04 7Н20 - 1,0; КС 1 - 0,7; КН2Р04 - 2,0; Na2HP04 - 3,0; NH4NO3 - 1,0; вода дистиллированная — 1,0 л, рН 7,1. При необходимости учесть отдельно численность углеводородокисляющих дрожжей и грибов в среду добавляют стрептомицин и тетрациклин по 50 мкг/мл каждого (Colwell et al. 1977; Colwell et al. 1978; Коронелли и Ильинский, 1984).
Одним из путей повышения элективности сред может быть использование силикагеля в качестве отвердителя. Основное преимущество гелевых сред — возможность контролировать содержание органики в среде, в отличие от агара, который сам по себе — сложное органическое соединение. Это особенно важно при выращивания автотрофных бактерий, а также при выделении определенных групп бактерий на элективных средах (Ильинский, 1981).
Количественный учёт
Количественный учёт углеводородокисляющих бактерий (УОБ) в морской воде и в накопительной культуре (титр клеток) производили по методу Коха - высевом на плотную минеральную среду с нефтью. Определение количества микроорганизмов этим методом включало три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри, подсчёт выросших колоний (Практикум по микробиологии, 2005).
Для получения изолированных колоний был приготовлен ряд последовательных разведений в стерильной водопроводной воде. Использовали коэффициент разведения, равный 10.
Далее осуществляли посев микроорганизмов из каждого разведения на плотную питательную среду с углеводородами. Перед посевом разливали расплавленную агаризованную питательную среду в стерильные чашки Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляли на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет, после чего на поверхность среды наносили стерильную нефть в количестве 0,4 мл на чашку и распределяли её стеклянным шпателем по всей поверхности чашек. Далее в чашки вносили 0,1 мл суспензии соответствующего разведения и распределяли стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду производили из исходной суспензии и из всех пяти разведений. После посева чашки переворачивали крышкой вниз во избежание слияния колоний и инкубировали в термостате в течение 3 суток при температуре 22 С.
Выросшие колонии микроорганизмов подсчитывали на чашке с изолированными колониями не открывая чашек, отмечая каждую учтенную колонию точкой (Практикум по микробиологии, 2005).
Количество клеток в 1 мл исследуемой воды (титр микроорганизмов) вычисляли по формуле: где М — количество клеток в 1 мл; а — среднее число колоний при высеве разведения; V — объём, взятый для посева, мл; 10" -коэффициент разведения.
Выделение чистых культур и идентификацию УОБ проводили на плотной среде «rich». Состав среды «rich», г/л: пептон — 2, дрожжевой экстракт - 1, гидролизат казеина - 1, глюкоза - 1, глицерин - 10 мл/л, мел - 2, агар - 17, вода водопроводная или морская, рН 6,7-7,2.
Идентификацию УОБ проводили по культуральным, морфологическим и физиолого-биохимическим признакам (Берджи, 1997а; Берджи, 1997b; Добровольская, Лысак, 1990).
Ключевыми признаками при определении родовой принадлежности бактерий являлись: особенности жизненного цикла, подвижность, характеристики колоний бактерий, грампринадлежность (тест с 3 %-ным раствором КОН), наличие оксидазы и каталазы. Форму и подвижность клеток определяли микроскопированием препаратов живых бактерий. Морфологические особенности выявляли на фиксированных препаратах, окрашенных фуксином или метиленовой синью.
Грампринадлежность определяли экспресс-методом. Для этого исследуемую односуточную культуру бактерий с помощью бактериальной петли переносили с твёрдой среды на предметное стекло в каплю 3 %-го раствора КОН и тщательно перемешивали. Через 10 секунд петлю поднимали над каплей. Для грамотрицательных бактерий характерно образование слизи, которая тянется за петлёй на 0,5-1,0 см. Если образования слизи не наблюдается, бактерии относятся к грамположительным. Образование слизи происходит в результате разрушения клеточных стенок грамотрицательных бактерий и выхода из них нуклеиновых кислот.
Тест на каталазу проводили следующим образом: часть выросшей культуры суспендировали с помощью бактериологической петли в капле 3 %-ной перекиси водорода на предметном стекле. О наличии каталазы свидетельствовало образование пузырьков газа, наблюдаемое невооружённым глазом через 1-5 минут после внесения бактерий.
В тесте на оксидазу наносили несколько капель 1 %-го свежеприготовленного раствора солянокислого тетраметил-п-фенилендиамина на отрезок фильтровальной бумаги, суточную культуру бактерий распределяли по поверхности увлажнённой этим раствором бумаги. При положительной реакции через 10-20 секунд развивалась фиолетовая или пурпурная окраска.
Для поддержания УОБ и ПАУОБ в лабораторных условиях использовали периодические пересевы на свежие питательные среды с нанесённой на их поверхность нефтью. Для длительного хранения чистых культур УОБ их выращивали на скошенной плотной среде «rich» в пробирках и заливали стерильным вазелиновым маслом. Масло стерилизовали в автоклаве 0,5 часа при избыточном давлении в 1 ати.
Конструкция разработанного биопрепарата «Морской снег» для очистки нефтезагрязнённых акваторий
Технология (от греч. techne - искусство, мастерство, умение и logos — слово, учение) - это совокупность приёмов и способов получения, переработки, обработки или переработки сырья, материалов, полуфабрикатов или изделий (http://slovari.yandex.ru/dict/bse).
Для разработки технологии получения биопрепарата для очистки акваторий от нефтезагрязнений были сформированы принципы конструирования биопрепарата, разработана структура и характеристики биопрепарата. Для этого провели анализ существующих биопрепаратов, выделив общие параметры их конструирования, структуры и свойств.
Задачей, на решение которой была направлена, разработка конструкции биопрепарата, являлась активизация процесса доставки загрязняющих воду нефти или нефтепродуктов к ассоциациям углеводородокисляющих бактерий, количество которых было увеличено биотехнологическим путём, и надежная иммобилизация ассоциаций бактерий на носителе. Таким образом, достигалось повышение эффективности очистки воды от нефти или нефтепродуктов.
По результатам анализа существующих технологий для очистки акваторий от нефти и полученных в исследованиях, были сформированы принципы конструирования биопрепарата, заключающиеся в следующем.
1. Реализация экологически этичного подхода по отношению к природе, что выражается в использовании только природных материалов в компонентах биопрепарата и аборигенных для данной акватории целостных ПАУОБ.
2. Использование нескольких видов носителей бактерий для создания внутри биопрепарата условий, способствующих адгезии на них УОБ с разными свойствами клеток (гидрофобными и гидрофильными) и увеличению площади поверхности.
3. Использование нескольких видов сорбентов для нефти, что обеспечивает эффективную сорбцию нефти и селективное и дозированное поступление углеводородов к клеткам УОБ.
4. Использование подкормки для УОБ, включающей минеральные и органические вещества, микро- и макроэлементы в доступных для УОБ формах, локализованные в биопрепарате.
5. Использование плавучего элемента, обеспечивающего нахождение биопрепарата на поверхности воды, где наиболее активно происходит биодеструкция нефтяного загрязнения.
6. Использование универсального метода очистки, сочетающего в себе микробиологический, биохимический и физико-химический способы очистки и учитывающий разные погодно-климатические условия.
