Введение к работе
Актуальность проблемы. Выяснение молекулярных механизмов регуляции пролиферации клеток является одной из основных задач современной биологии, которая имеет не только теоретическое, но и практическое значение: исследования в этой области открывают возможности для создания средств подавления злокачественного роста, также как и средств стимуляции регенерации тканей. Пролифера-тивное действие ряда гормонов и других внеклеточных сигналов (включая факторы роста, цитокины, интерлейкины, антигены и т.д.) обеспечивается их взаимодействием со специфическими рецепторными белками, находящимися на поверхности плазматических мембран клеток-мишеней. Эти рецепторы имеют по крайней мере две функции - связывание агониста с высокой аффинностью и инициацию процесса проведения сигнала путем образования вторичных посредников внутри клеток: сАМР, Са2*, диацилглицерина и др. Активирующиеся вследствие этого различные протеинкиназы служат передаточным звеном между образованием вторичных посредников и активацией синтеза ДНК, распространяя таким образом сигнал от внешней мембраны до клеточного ядра. Наличие каталитических каскадов внутриклеточных посредников позволяет многократно усиливать внеклеточный сигнал, так что определенный клеточный ответ достигается при действии наномолярных (и менее) концентраций сигнальных веществ.
В свете вышесказанного большой интерес представляет изучение механизма пролиферативного действия стероидного гормона эстрадиола на клетки-мишени, имеющее как теоретическое, так и практическое значение в силу существования большого числа видов злокачественных новообразований, рост которых регулируется эстрадиолом. Открытие субпопуляции мембранных рецепторов эстрадиола (помимо "классических" цитозольных, выступающих в комплексе с гормоном как транскрипционный фактор) явилось новым этапом в понимании механизма его воздействия на клетки, однако данных о том, насколько "негеномные"эффекты эстрадиола вовлечены в общий пролиферативный ответ клетки на гормон, довольно мало.
Механизм действия олигонуклеотидов (ON) на клетки также представляет большой интерес, во-первых, в связи с интенсивным развитием антисенсовой технологии (разрабатываемой с целью подавления роста опухолей и размножения вирусов путем избирательного ингибирования определенных генов), а во-вторых, в связи с открытием предполагаемых рецепторов для ON на поверхности многих типов клеток. Известно также, что олигонуклеотиды присутствуют в крови и межкле-
точной жидкости организма в норме и при различных патологиях, в связи с чем ряд исследователей предполагает возможность существования у ON неких сигнальных функций, подобных регуляторным функциям нуклеотидов, действующих через пу-ринэргические рецепторы.
Мы предположили также, что использование в "антисенс"-экспериментах олигонуклеотидов, ковалентно присоединенных к эстрадиолу, решило бы проблемы нуклеазной устойчивости ON, адресности его доставки в клетки, имеющие рецепторы кэстрадиолу, и, вследствие этого, привело бы к понижению эффективной концентрации ON и, значит, к понижению его токсичности на организм в целом. Привлекательность данного подхода послужила дополнительным стимулом для изучения механизмов действия обоих составляющих конъюгата гормон-олигонуклеотид, поскольку знание этих механизмов является необходимым для адекватного проведения подобного рода экспериментов.
Полью исследования было: 1) изучение связи между мембранными, "негеномными", эффектами эстрадиола и событиями, обеспечивающими пролиферативный ответ клетки; 2) изучение механизма влияния олигонуклеотидов на клетки. Конкретные задачи работы включали: 1) изучение влияния эстрадиола на метаболизм сигнальных фосфолипидов, на экспрессию протоонкогена c-fos и на быструю, не зависимую от синтеза белка, активацию казеинкиназы II - одного из ключевых ферментов-регулятороа клеточной пролиферации; 2) определение роли С-киназной сигнальной системы в экспрессии протоонкогена c-fos, в активации казеинкиназы II и стимулируемой эстрадиолом пролиферации; 3) изучение эффектов, оказываемых низкими концентрациями конъюгатов эстроген-олигонуклеотид и не-модифицированных олигонуклеотидов, на клетки; 4) определение роли С-киназной сигнальной системы в обеспечении эффектов ON на клетки.
Работа проводилась на эстрогенчувствительных тканях (почках молодых самок крыс и опухолях молочных желёз крыс линии Спрэг-Доули) и линиях клеток MCF-7 и L929.
Научная новизна работы. В данной работе впервые показано, что уже через 15-30 минут после введения животным эстрадиола происходит двух-трехкратное увеличение с ядрах клеток-мишеней активности казеинкиназы II, связанного с пролиферацией фермента. Одновременное введение аминазина, ингибитора протеинки-назы С, предотвращает стимулирующий эффект эстрадиола на активность казеинкиназы II.
Для подтверждения участия С-киназного сигнального каскада в пролифера-тивном действии эстрадиола на клетки-мишени были изучены изменения метаболизма сигнальных липидов в мембране клеток в ответ на введение гормона. Было обнаружено накопление меченой фосфатидовой кислоты, что свидетельствует об активации эстрадиолом мембранных фосфолипаз - сопряженных с G-белками ферментов, продуцирующих сигнальные соединения в клетке в.ответ на внеклеточный стимул. Кроме того, истощение клеток культуры по протеинкиназе С длительной предобработкой форболовым эфиром приводило к отмене пролифера-тивного действия эстрадиола, а также к отмене стимулируемой эстрадиолом экспрессии протоонкогена c-fos, продукт которого является компонентом известного фактора транскрипции АР-1.
Впервые показано также, что олигонуклеотиды в очень низкой концентрации, близкой к физиологической концентрации гормонов, сиквенснезависимым образом вызывают быстрый подъем общего уровня синтеза РНК и увеличение синтеза ДНК в обеих протестированных линиях клеток. Причем конъюгаты. гормонов с олиго-нуклеотидами стимулировали синтез ДНК в меньшей степени, нежели гормоны или ON в отдельности.
Установлено, что стимулирующее действие олигонуклеотидов на клетки не обусловлено продуктами их деградации - мононуклеотидами, способными, как известно, взаимодействовать с пуринэргическими рецепторами, обнаруженными на поверхности многих типов клеток, и оказывать целый ряд эффектов, в том числе и митогенный.
Впервые показано, что низкие концентрации ON могут инициировать проли-феративные процессы в клетке, по-видимому, путем рецептор-опосредованной активации мембранных сигальных систем, поскольку в опытах по изучению влияния олигонуклеотидов на метаболизм сигнальных липидов имело место очень быстрое (через 30-40 секунд) увеличение мечения фосфатидовой кислоты, а также образование диацилглицерина, активатора РКС. Кроме того, истощение клеток по протеинкиназе С предобработкой форболовым эфиром приводило к отмене стимулирующего влияния олигонуклеотидов на синтез ДНК.
Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в работе данные развивают представление о механизме действия эстрадиола на клетки-мишени при стимуляции их пролиферации - не только через цитозольные рецепторы, способные в комплексе с гормоном выступать как транскрипционные факторы, но и через
активацию мембранных сигнальных систем систем, в частности, как нами показано - через активацию фосфолипаззависимого сигнального пути, сопровождающегося усилением метаболизма фосфатидовой кислоты и РКС-зависимыми процессами стимуляции экспрессии протоонкогена c-fos и активации казеинкиназы II.
Принципиально важными являются также данные о том, что олигонуклеоти-ды сиквенснезависимым образом способны стимулировать синтез РНК и ДНК в клетках, очевидно, также путем активации одной из фосфолипаззависимых мембранных сигнальных систем. Вследствие этого использование в антисенсовой технологии даже сравнительно низких концентраций олигонуклеотидов (на порядки меньших, чем используемые обычно в генотерапии) не позволит избежать целого ряда побочных, "неантисенсовых", эффектов на клетки. С другой стороны, использование олигонуклеотидов, присоединенных к гормону, возможно, является перспективным, так как, будучи в составе конъюгата, как тот, так и другой, по-видимому, не способны в полной мере реализовать свое пролиферативное действие на клетки.
Публикации и апробация работы. Основные результаты диссертации опубликованы в 4 печатных работах. Результаты работы были представлены на V-ом Всесоюзном биохимическом съезде (1986, Киев), на франко-российском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (1995, Новосибирск), на И-ом биохимическом съезде РАН (1997, Пущино).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 97 страницах, содержит 26 рисунков и 6 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов, методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 314 источников.
