Введение к работе
Актуальность исследования
Изучение закономерностей становления в эволюции реактивности и пластичности функционально-аналогичных тканей с позиции теории параллелизма - фундаментальная задача современной биологии (J. C. Venter, 2001; J. B. Pritchard, 2002; H. Scholz, 2002).
В эволюции различных видов температура является одним из факторов, который обеспечивает развитие, рост, пролиферацию, функционирование и гибель клеток в системе целостного организма у экто- и эндотермных животных с различным содержанием ДНК (В. Г. Шахбазов, 2001; М. М. Калашникова, 2006; D. L. Bayne, 2004; A. E. Vinogradov, 2005; P. J. Verschure, 2005; M. Michelle, 2005; T. Ryan, 2005; M. Kelly, 2006; S. Harpreet, 2006; J. Frampton, 2006). Особенно актуальным становится изучение этого вопроса в свете глобального потепления климата (Всемирная метеорологическая организация, 2003; Изменения климата ..., 2002; Конвенция ООН об изменении климата, 2002). В свою очередь, изучение влияния гипертермии на биологические системы имеет адекватную как физиологическую (климато-географическая миграция, условия высокотемпературных технологий), так и клиническую актуальность (Н. В. Зеленина, 2002; М. А. Пальцев, 2004; S. C. Chen, 2001; A. V. Souvernev, 2001; H. Talbot, 2001; M. Muraca, 2002). При этом особое значение приобретает состояние органов, непосредственно участвующих в поддержании гомеостаза организма. Одним из таких органов является печень. Сложность структуры, полифункциональность, быстрота вовлечения печени в деструктивные и репаративные процессы - все это определяет неослабевающий интерес исследователей к проблемам ее регенерации: источники, масштабы, механизмы. Высокая интенсивность метаболических процессов у эндотермных животных, становление у них новых механизмов устойчивости к стрессу способствовали усложнению и совершенствованию морфологии печени, которая, по сути, является «периферическим интегратором метаболизма». Вместе с тем, многие реактивные и пластические аспекты выхода её из шоковых ситуаций эндо- и экзогенной природы даже у млекопитающих изучены недостаточно. Отрывочны сведения об экспериментальном изучении влияния гипертермии на организм других видов экто- и эндотермных позвоночных (М. М. Калашникова, 2000, 2001, 2006; Е. И. Яковлева, 2003; P. P. Warren, 2000; A. N. Rice, 2006). Это не позволяет в полной мере проанализировать закономерности эволюционного направления в развитии срочно реализуемых общих и частных структурных реорганизаций, модификаций активности ферментов печени в процессе развития реактивных и пластических реакций.
В рамках этой фундаментальной проблемы особый интерес вызывает исследование повреждения и восстановления печени в различных моделях гипертермии. Для детального анализа деструктивных и репаративных последствий, а также способов восстановления полноценной структуры и функций печени после экстремальной тепловой нагрузки представлялось целесообразным сравнительное морфофункциональное исследование этого органа у двух классов теплокровных животных — млекопитающих и птиц, у которых терморегуляция складывалась в ходе эволюции самостоятельно.
Недостаточно работ, посвященных анализу становления в эволюции таких количественных и качественных показателей, как стромально-паренхимные соотношения клеток печени и пролиферативно-репликативные соотношения гепатоцитов, пути клеточной гибели и особенности клеточного цикла гепатоцитов в сравнительном ряду позвоночных. Спектр этих вопросов практически не изучен с позиций временнй адекватности, степени выраженности, распространенности в пределах печеночного ацинуса как в норме, так и после воздействия гипертермии в сравнительном ряду позвоночных (В.П. Скулачев, 2001; Д. Н. Маянский, 2002; Е. В. Малышева, 2007; М. Leist, et al., 2001; В. Levine, 2004; M. Artal-Sanz, 2005; Y. P. 2005; A. Kelekar, 2006, S. A. Lakhani, 2006; C. Indiani, 2006).
Не в полной мере в сравнительном ряду изучена и систематизирована динамика биохимических маркеров пролиферации, путей клеточной гибели, взаимосвязи митохондриальных и цитоплазматических оксидоредуктаз. Не определены направления регуляции активности оксидоредуктаз в системе in vivo, в сравнении с in vitro. Отсутствуют схемы развития метаболических компенсаций в свете сопряженности метаболических процессов биоэнергетической системы позвоночных в модели in vivo и in vitro (Н. О. Бабич, ; М. Ю. Еропкин, 2000; С. Я. Проскуряков, 2002; М. В. Левенкова, 2004; Г. В. Ганусова, 2005; Н. С. Зыкина, 2007; S. , 2003; F. Gao, 2004; M. , 2006). Отсутствуют работы, посвященные анализу реактивности и пластичности печени после действия гипертермии в прямом (система in vitro) и опосредованном (система in vivo) режиме (Животная клетка в культуре, 2000; Е. А. Завьялова, 2006; O.S. , 2004; L. Sez, 2005).
В силу известной полифункциональности печени особую трудность в исследовании представляет классификация наблюдаемых после теплового удара явлений раннего периода активации регенерации, а также зависимости путей гибели клеток паренхимы и принципов их восстановления. Для того чтобы обнаружить и выделить структуры печени и специфические механизмы «противостояния» тепловому стрессу, необходимо изучение последствий общего перегревания также и в ряду эктотермных позвоночных животных — рыб, амфибий и рептилий. Прямое сопоставление структурных и функциональных событий, выявляемых в печени животных разных таксонов, которые обладают разнокачественными системами терморегуляции, детоксикации и различным содержанием ДНК, дало возможность значительно дополнить существующие представления о реактивности и пластичности печени в сравнительном ряду позвоночных.
Все вышеперечисленное определило проблему настоящего исследования, проводимого по федеральному плану (№ гос. регистрации 01 9 10 011014).
Цель работы – выявить гисто-энзиматические закономерности проявления реактивности и пластичности печени на кратковременную гипертермию в сравнительном ряду позвоночных.
Задачи исследования:
-
Изучить функциональную морфологию печеночного ацинуса, стромально-паренхимные соотношения клеток печени в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.
-
Выявить показатели биологии гепатоцитов (ультраструктура, клеточный цикл, пути гибели) в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.
-
Исследовать источники физиологической и репаративной регенерации гепатоцитов на клеточном и субклеточном уровне в норме и после острой гипертермии.
-
Изучить биохимические проявления реактивных и пластических реакций печени (оксидоредуктазы митохондриальной и цитозольной фракции, маркеры путей гибели и пролиферации гепатоцитов) в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии.
-
Проанализировать особенности биологии гепатоцитов in vitro в сравнительном ряду позвоночных в норме и после острой гипертермии (ультраструктура, пути гибели), выделить спектр метаболических изменений гепатоцитов в показателях энергетического и пластического обмена, вызванных прямым действием гипертермии, от событий, обусловленных изменениями во внутриорганных взаимодействиях в условиях стресса в системе in vivo.
Научная новизна работы
Впервые в сравнительном ряду позвоночных животных с различной системой терморегуляции установлена видовая специфичность функциональной морфологии печеночного ацинуса, реактивность и пластичность печени на органном, межтканевом, межклеточном, клеточном, субклеточном и биохимическом (молекулярном) уровне после кратковременного действия гипертермии.
Выявлены видовые общие и частные закономерности и клеточные особенности реакции сосудисто-тканевых компонентов печеночного ацинуса, особенности в динамике соотношения количества гепатоцитов и стромальных клеток печени через час после действия гипертермии в сравнительном ряду позвоночных.
Результаты исследования расширяют представления о механизмах, способах и масштабах регенерации печени как показателях пластичности органа, сформированного у изучаемых видов эндо- и эктотермных позвоночных. Выявлена степень выраженности реактивности и пластичности с позиции гистотопографии печени эндо- и эктотермных животных согласно эволюционно обусловленным закономерностям в ответ на действие гипертермии в моделях in vivo и in vitro.
Установлены и сопоставлены особенности клеточного цикла, соотношения путей гибели гепатоцитов, определены морфобиохимические маркеры пролиферации, путях программируемой клеточной гибели гепатоцитов, энергетического и пластического обмена в сравнительном ряду позвоночных в клеточных культурах in vitro в норме и после острой гипертермии.
Мультипараметрический принцип исследования реактивности и пластичности печени в модели in vivo и гепатоцитов в модели in vitro, в норме и после гипертермии позволили выявить в сравнительном ряду направление, в котором формировались особенности реорганизации структур печени, обеспечивающих выживание и последующие этапы репаративной регенерации в восстановительном периоде.
Теоретическая и практическая значимость
Показаны сравнительно-гистологические аспекты биологии гепатоцитов: особенности клеточных циклов, соотношения путей гибели гепатоцитов, способов репарации печени. Полученные данные расширяют представления о развитии реактивных и пластических процессов печени в зависимости от системы терморегуляции организма.
Выявлены источники восстановления эпителия печеночного ацинуса, определен диапазон реактивных и пластических структурных компонентов печени у животных с различной системой терморегуляции и различным количеством ДНК.
Показана топография реактивных и пластических изменений печеночного ацинуса в сравнительном ряду позвоночных, динамика биохимических процессов печени и гепатоцитов.
Выявлена связь реактивных изменений ультраструктуры гепатоцитов с изменениями активности внутриклеточных ферментов, особенности этих корреляций в сравнительном ряду позвоночных.
Результаты исследований представляют практический интерес для уточнения показаний к использованию гипертермии, позволяют обосновать механизмы нарушений, развивающихся в организме животных при тепловом ударе, а применение предложенных методов исследования – оценить тяжесть воздействия.
Полученные результаты могут быть использованы для научных исследований с использованием модельных систем in vivo/in vitro для выявления эволюционных механизмов реализации структурно-функциональных компенсаций и их регуляции.
Полученные нами первичные культуры гепатоцитов различных видов животных являются оптимальными модельными системами для решения таких фундаментальных и прикладных проблем, как исследование процессов пролиферации, дифференциации и межклеточных взаимодействий и предоставляют возможности для изучения управляемых модификаций метаболизма в условиях физиологической нормы и в эксперименте. Отработанная схема получения и культивирования обеспечивает возможность использования культур гепатоцитов для изучения размножения, выявления спектра чувствительности к различным вирусам в данных культурах.
Внедрение в учебный процесс.
Полученные результаты пополнили разделы общих лекционных курсов: "Цитология", "Гистология с основами эмбриологии", "Генетика", «Биология клетки», "Молекулярная биология", спецкурсов: "Частная сравнительная гистология", "Основы современной биологии и экологии", «Общая биология» - в Омском государственном педагогическом университете, Омской государственной медицинской академии, Ханты-Мансийском государственном медицинском институте, Тюменской государственной медицинской академии, Новосибирской государственной медицинской академии, Институте ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Омского государственного аграрного университета, Московского государственного медико-стоматологического университета, Саранском государственном университете.
Внедрение в практическую деятельность. Получен номер государственной регистрации заявки на изобретение «Способы выделения гепатоцитов животных с различной системой терморегуляции (амфибии, черепахи, птицы)» Рег. № 2008132219 от 08.08.2008.
Результаты исследования внедрены в практику научно-исследовательского учебного центра Института ветеринарной медицины ФГОУ ВПО Омского государственного аграрного университета с 20.01.2007 года.
Первичные культуры гепатоцитов in vitro изучаемых животных нашли применение в практике Федерального государственного учреждения науки Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций, Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в качестве объекта для вирусологических исследований в рамках проводимых исследований биологических и генетических характеристик флави–, тога- и хантавирусов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В сравнительном ряду позвоночных определено становление структурно-функциональных единиц печени, а также морфометрические показатели хроматина, источники физиологической регенерации, соотношения путей гибели гепатоцитов, стромально-паренхимные соотношения клеточных типов печени, апоптоз/некрозные соотношения и ряд общих и отличительных ультраструктурных показателей гепатоцитов.
2. Однократная гипертермия в группах животных «амфибии/птицы», и «рыбы/рептилии/млекопитающие» вызывает видоспецифичные изменения морфометрических показателей сосудистого русла печеночного ацинуса, увеличение количества стромальных клеток печени с изменением их топографии в пределах ацинуса; изменения показателей клеточного цикла, состояния фракций хроматина гепатоцитов; смену источников физиологической регенерации и путей гибели гепатоцитов.
3. Ультраструктурные изменения ядра и цитоплазмы гепатоцитов носят мозаичный характер, зависят от степени биологической и функциональной зрелости, топографии в пределах ацинуса и видовой принадлежности. В зависимости от развития либо гипо-, либо гиперметаболических реакций эти изменения отражают увеличение количества двуядерных или PCNA-позитивных гепатоцитов, или обеих популяций гепатоцитов. Выявлена активация стромальных клеток печени.
4. В сравнительном ряду выявлены видоспецифичные отличия активности изучаемых оксидоредуктаз митохондрий и цитозоля, биохимических маркеров гибели гепатоцитов, содержания ионов [Са2+]i, [К+]i и [Nа+]i. Гипертермия определяет дифференцированную модификацию активности оксидоредуктаз, содержания ионов, соответственно реализацию в большей мере программы гибели гепатоцитов по пути некроз/аутофагия и реализацию реакций как гипо-, так гиперкатаболизма.
5. В клеточных культурах гепатоцитов, в сравнении с in vivo, установлены видовые различия в индексе пролиферации, направлениях гибели и показателях энергетического и пластического обмена гепатоцитов. Гипертермия приводит к ультраструктурным изменениям гепатоцитов, смене путей клеточной гибели, разнонаправленному изменению активности оксидоредуктаз, биохимических маркеров клеточной гибели, отражая развитие реакции как гипо-, так и гиперкатаболизма гепатоцитов.
Апробация результатов научных исследований
Результаты исследований обсуждены на Международной конференции орнитологов «Актуальные проблемы изучения и охраны птиц Восточной Европы и Северной Азии», Казань, 2001; Международной научно-практической конференции «VI Царскосельские чтения», С-Петербург, 2002; VI конгрессе международной Ассоциации морфологов, г. Уфа, 2002; Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии», «Современные технологии лабораторной диагностики XXI века» и Международном симпозиуме «Пиридоксальфосфат – зависимые ферменты: структура, молекулярная патология и медицина», Москва, 2002; Всероссийской конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», С-Петербург, 2003; Всероссийской научной гистологической конференции «Реактивность и пластичность гистологических структур в нормальных, экспериментальных и патологических условиях», посвященной памяти Ф.М. Лазаренко, Оренбург, 2003; III Региональной научной конференции «Адаптация биологических систем к естественным и экстремальным факторам среды, Челябинск, 2004; V Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов с международным участием, г. Казань, 2004; VII Международном конгрессе ассоциации морфологов, Москва, 2004; XIX Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004; VII Всероссийской конференции по патологии клетки, Москва, 2004; Международном научном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2004; Международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере», Сургут, 2004; II Международном эмбриологическом симпозиуме «Югра-Эмбрио-2006» Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 2006; Научном совещании гистологов «Актуальные проблемы учения о тканях», С.-Петербург, 2006; V Научной международной конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины», Таиланд (Паттайа), 2008; Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации», посвященной памяти член корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко, Оренбург 2008; Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» посвященной П.В. Дунаеву, Тюмень, 2008; IX Международной ассоциации морфологов и IV съезде ассоциации морфологов Узбекистана, Бухара, 2008.
Публикации. Основные положения диссертации представлены в 32 печатных работах. В изданиях, рекомендованных ВАК, - 11. Одно учебное пособие.
Объем и структура диссертации. Содержание диссертации изложено на 397 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: обзор литературы, изложение материалов и методов исследования, собственных исследований, обсуждение полученных данных, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 187 фотографиями и схематичными рисунками, 18 таблицами. Список использованной литературы включает 768 работ, в том числе зарубежных 578 зарубежных авторов.
