Введение к работе
, Актуальность проблемы. Проблема вида у инфузорий очень запутана. Морфологи-
еские критерии зачастую не дают возможности однозначно определить видовую при-
адлежность тех "или иных представителей рода (Schlegel, Meisterfeld, 2003). Внутри
(классических» морфологических видов у большинства инфузорий выделяют репродук-
ивно изолированные группы - сингены, границы между которыми могут быть более или
енее ярко выраженными. Иногда сингенам придают статус генетических видов, или ви-
ов-двойников (Sonneborn, 1975; Nanney, McCoy, 1976). Комплекс видов-двойников
aramecium aurelia является одним из наиболее изученных комплексов генетических ви-
ов у инфузорий. По сути, появление генетических видов отражает начальные этапы ви-
ообразования. Именно сравнительное изучение сингенов кажется наиболее перспектив-
1ым подходом к проблеме видообразования и структуре вида у инфузорий.
Исключительная распространенность сингенов у инфузорий дает основания свя-ывать это явление с уникальной особенностью этой группы протистав - наличием ге-ероморфного ядерного аппарата. У инфузорий в одной клетке функционирует два типа ер (Райков, 1978; Осипов, 1981): микронуклеус (МИК) и макронуклеус (МАК). МИК одержит десятки мелких хромосом; это в целом транскрипционно инертное ядро, чья сновная функция -.передача генетической информации дочерним клеткам при поло-ом процессе. МАК является соматическим ядром с активной транскрипцией, опреде-яющим фенотип клетки; в этом ядре отсутствуют традиционные хромосомы, и геном остоит из тысяч амплифицированных молекул ДНК (Prescott, 1994).
В ходе полового процесса (конъюгации) МАК постепенно деградирует, а МИК ретерпевает мейоз. В результате слияния образующихся при этом гаметических ядер ормируется зиготическое ядро (синкарион), из продуктов деления которого дифферен-ируются новые МАК и МИК. При формировании МАК зиготический геном претерпевает ряд существенных перестроек (Jahn, Klobutcher, 2002): происходит фрагментация исходных хромосом, значительная часть генетического материала элиминируется, а оставшиеся последовательности амплифицируются. Общая схема данного процесса одинакова [я всех инфузорий, но детали формирования (и, соответственно, организации) генома МАК сильно различаются у разных групп Ciliata (Prescott, 1994; Katz, 2001).
Сформированный в ходе таких перестроек геном МАК состоит из набора фрагментов ДНК различной длины, представленных различным числом копий, фланкированных теломерами и способных к репликации. В нём практически отсутствуют повторы, некрдирующие последовательности и транспозонные элементы, характерные для генома МИК.
Одной из предпосылок дивергенции видов является высокая изменчивость геномов и кариотипов (см. Кайданов, 1996). Однако сложность и нетривиальность организации генома МАК не позволяют использовать стандартные методы цитогенетики для кариотипирования этого ядра; хромосомный набор МИК, содержащий у большинства инфузорий десятки очень мелких и не имеющих отличительных черт хромосом, также неудобен для цитогенетических исследований.
Электрофоретическое разделение молекул ДНК МАК - пока единственный способ кариотипирования МАК. «Хромосомы» МАК большинства инфузорий находятся за пределами разрешения обычного электрофореза, но могут быть исследованы методом
пульс-электрофореза (ПЭФ), позволяющим разделять в геле молекулы ДНК размером от 50 т.п.н. до 10 млн.п.н. (Maule, 1996). Получаемые при этом ПЭФ-профили можно использовать как своеобразный эквивалент традиционных, классических кариотипов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование изменчивости генома макронуклеуса инфузорий на ранних этапах видообразования. В качестве объекта исследования был выбран комплекс видов-двойников P. aurelia.
Нами были поставлены следующие конкретные задачи:
-
На модели P. tetraurelia проанализировать ПЭФ-профиль и локализовать на нем несколько генов, сопоставив полученные результаты с данными секвенирования генома МАК этого вида (). Показать, что электрофоре-тический кариотип отражает реальную молекулярную организацию генома МАК.
-
Изучить возможные изменения ПЭФ-профиля МАК в ряду клеточных поколений. Для этого получить синхронные культуры (все клетки которых находятся на одной стадии жизненного цикла) и сравнить ПЭФ-профили синхронизированного клона на разных этапах «старения» МАК.
-
Провести сравнительный анализ ПЭФ-профилей видов-двойников комплекса P. aurelia: определить уровень внутри- и межвидового полиморфизма по данному признаку, а также его связь с географическим происхождением клонов; локализовать несколько сцепленных у P. tetraurelia генов на ПЭФ-профилях разных видов комплекса P. aurelia.
-
Сопоставить полученные результаты с опубликованными молекулярными филогениями комплекса P. aurelia. Определить, сопровождается ли дивергенция видов-двойников комплекса P. aurelia возникновением и накоплением изменений в геноме МАК.
Научная новизна работы. Предлагаемая работа является первым сравнительным исследованием молекулярной организации генома МАК видов-двойников комплекса Р. aurelia. Впервые получены и детально описаны электрофоретические кариотипы всех пятнадцати видов комплекса.
На примере вида P. tetraurelia, геном МАК которого секвенирован (Aury et al., 2006), показано, что электрофоретический кариотип отражает реальное распределение «хромосом» МАК по размерам. Впервые установлено, что молекулярная организация генома МАК не изменяется в ходе жизненного цикла Paramecium и является постоянной характеристикой клона
Впервые определен уровень внутривидового полиморфизма электрофоретических кариотипов для видов комплекса P. aurelia, при этом показано, что полиморфизм по молекулярной организации генома МАК может быть связан с разным географическим происхождением сравниваемых клонов.
Впервые получены данные о том, что возникновение изменений в организации генома МАК сопряжено с дивергенцией видов или групп видов у инфузорий.
Практическая ценность. Работа носит фундаментальный характер. Полученные в работе данные вносят важный вклад в понимание проблемы видообразования у инфузорий. Синтез различных - геномных, генетических, физиологических, молекулярно-филогенетических - данных, позволяющих достоверно определять уровень филогенетической близости видов, может открыть возможности для изучения механизмов видообразования, и, видимо, является единственно адекватным на сегодняшний день подходом к проблеме вида и изучению биоразнообразия у Protozoa в целом.
Генетические виды характеризуются высоким морфологическим сходством, что затрудняет процесс определения видовой принадлежности вновь выделяемых в природе
клонов. Показано, что для восьми из пятнадцати видов-двойников комплекса P. aurelia
электрофоретический кариотип является видоспецифичным. Полученные данные позво-
[ют использовать метод ПЭФ для точной идентификации представителей этих видов.
Показана возможность использования метода ПЭФ для исследования групп сцеп-ения у инфузорий, что, в свою очередь, важно для понимания общих закономерностей волюции геномов.
Полученные результаты используются в курсах лекций "Частная зоология беспо-воночных. Инфузории" на кафедре зоологии беспозвоночных, "Эволюция геномов и ариотипов" на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета ПбГУ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Международной онференции по молекулярной биологии и биотехнологии инфузорий и анаэробных ротистов (Ниймеген, Голландия, 2003), III Съезде ВОГиС (Москва, 2004), IV (Сан-енедетто дель Тронто, Италия, 2003) и V (Санкт-Петербург, Россия, 2007) Европейкой протистологическом конгрессе, XII Международном конгрессе по протозоологии Гуанчжоу, Китай, 2005), 2-ом Международном совещании по геномике Paramecium Дурдан, Франция, 2006). Материалы диссертации неоднократно обсуждались на науч-ых семинарах кафедры цитологии и гистологии и лаборатории кариологии однокле-очных биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результа-ы исследования и их обсуждение, выводов и списка литературы, содержащего 142 на-менования. Работа изложена на 172 страницах, содержит 41 рисунок и 4 таблицы.
