Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы
1. Эволюция понятия геном 8
2. Геномный (молекулярный) полиморфизм растений 10
2.1. RAPD-анализ 12
2.2. Полиморфизм длин амплифицированпых фрагментов (AFLP) 13
2.3. Межмикросателлитный анализ (ISSR-маркёры) 14
2.4. Полиморфизм межгенных спейсерных последовательностей (ITS) 15
3. Хромосомный полиморфизм у растений 16
3.1. Дифференциальное окрашивание хромосом растений 17
3.2. В-хромосомы, растений 20
4. Локализация генов, повторяющихся последовательностей и анонимных фрагментов ДНК на хромосомах с* помощью флуоресцентной гибридизации in situ 23
5. Межвидовые филогенетические и эволюционные взаимоотношения в пределах рода Linutn 27
6. Молекулярно-филогенетические исследования видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum 33
7. Исследования кариотіїпов видов льна секции Syllinum, Dasylinum и Linastrum 36
8. Межвидовые скрещивания в роде Linum L 40
П. Материалы и методы исследования.
1. Материалы 41
2. Методы 41
2.1. Проращивание семян 41
2.2. Приготовление хромосомных препаратов 41
2.3. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробами 26S и 5S рибосомных генов и дифференциальное DAPI-окрашиваине хромосом ...43
23.1. Мечение проб .43
2.3.2. Обработка препаратов РНК-зон А перед FISH 44
2.3.3. Гибридизация... 44
2.4. Дифференциальное С-окрашивание хромосом ...45
2.5. СМА-окрашивание хромосом. ..45
2.6. Микроскопия 46
2.7. RAPD-анализ ...46
2.7.1; Выделение ДНК 46
2.7.2. Выполнение полимеразной цепной реакции с использованием случайных праймеров (RAPD-PGR);.. ...47
2.7.3. Анализ электрофореграмм RAPD-спектров ДНК исследуемых; образцов льна 48
Ш. Результаты
1. Кариологическое изучение видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum. 49
1.1. Секция Syllinum... ...49>
1Л.1. Определение.числа хромосом у видов секции Syllinum... 49
ІЇІ.21 Локализация, генов. 26S и 5S рРНК в кариотипах L. flavtim; L. campanulatum, L. elegans, L.. thracicum^ L. capitatum nLL czernjajevii...51c
1.1.3. DAPI- дифференциального окрашивание хромосом видов секции Syllinum L. Jlavum; L. campanulatum, L. elegans, L. thracicum, L. capitatum и L. czernjajevii. 56
1.1.4. Добавочные хромосомы 65
1.1.5. Изучение кариотипа L. nodijlorum L 69
1.2. Секция Dasylinum. 72
1.2.1. Определение числа хромосом у L. hirsutum L. subsp. hirsutum 72
1.2.2. Локализация генов 26S и 5S рРНК в кариотипе L. hirsutum 72
1.2.3. DAPI-днфференциалыше окрашивание хромосом L. hirsutum 73
1.3. Секция Linastrum. 75
1.3.1. Хромосомные числа видов секции Linastrum 75
1.3.2. Результаты DAPI- дифференциального окрашивания и одновременной локализации генов 26S и 5S рДНК на хромосомах видов секции Linastrum 75
2. RAPD-анализ молекулярного полиморфизма видов секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum внутри рода Linum L 81
IV. Обсуждение полученных результатов.
1. Особенности хромосомной организации геномов видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum рода Linum. 84
1.1. Секция Syllinum. 85
1.1.1. Хромосомные числа видов льна секции Syllinum 85
1.1.2. Сравнительный анализ кариотипов и структуры хромосом у видов льна секции Syllinum 86
1.1.3. В-хромосомы у видов секции Syllinum 88
1.1.4. Особое положение L. nodiflorum в секции Syllinum 91
1.2. Секция Dasylin ит 92
1.3. Сек ция Linastrum 94
1.3.1. Хромосомные числа видов секции Linastrum. 94
1.3.2. Сравнительный анализ кариотипов и структуры хромосом у льнов секции Linastrum 94
2. Геномный полиморфизм видов секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum рот Linum. 96
Заключение 102
Выводы 104
Список литературы
- Межмикросателлитный анализ (ISSR-маркёры)
- В-хромосомы, растений
- Молекулярно-филогенетические исследования видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum
- Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробами 26S и 5S рибосомных генов и дифференциальное DAPI-окрашиваине хромосом
Введение к работе
В Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии в течение ряда последних лет изучается хромосомная организация генома различных видов льна, начиная с его основного, с хозяйственной точки зрения, культурного вида льна (Linum usitatissimum L.), и кончая его многими дикими сородичами, принадлежащими к нескольким секциям: Linum, Adenolinum и Stellerolinum.
В результате исследования, проведенного с помощью разработанного ранее комплексного подхода, основанного на последовательном или одновременном использовании различных методов молекулярно-цитогенетического маркирования метафазных хромосом, были впервые идентифицированы все индивидуальные хромосомы у культурного и дикорастущих видов льна секций Linum, Adenolinum и Stellerolinum; установлены хромосомные числа у L. squamulosum Rudolphi и L. komarovii Juz. (2п=18); уточнены хромосомные числа у L. decumbens Desf., L. stelleroides Planch, L. pallescens Bunge (2n=18) и L. narbonense L. (2n=28). Ha основании проведенной работы был сделан ряд выводов относительно филогении льнов, принадлежащих к секциям Linum, Adenolinum и Stellerolinum, а также происхождения культурного вида.
Изучение геномов представителей рода Linum L. имеет важное значение, причем не только теоретическое, но и практическое. Лен культурный занимает одно из первых мест в структуре сельскохозяйственного производства многих стран мира, включая Россию. Высказано предположение, что лен идет на смену хлопку, развитие научной базы льноводства имеет особое значение для нашей страны в связи с происшедшей утратой собственных источников хлопка. Исследование геномов дикорастущих видов льна позволит подобрать перспективные источники необходимых генов для селекции, направленной на получение новых форм культурного льна с повышенной продуктивностью и устойчивостью к болезням и вредным факторам окружающей среды. Знание кариотипов дикорастущих видов льна, используемых в качестве доноров хозяйственно-ценных признаков, позволит выявить перспективные объекты для проведения межвидовой гибридизации. В последнее время появились сведения о перспективности прямого применения разных видов рода Linum в качестве источников активно действующих веществ для лечения некоторых онкологических заболеваний. Виды льна секции Syllinum являются самыми перспективными в этом отношении. Однако, среди представителей различных секций рода Linum, виды секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum оказались наименее
изученными. Установлено, что виды рода Linum не имеют единого базового числа, что не позволяет предположить определенный эволюционный ряд и затрудняет понимание межвидового родства. Сравнительное изучение кариотипов с помощью монохромного окрашивания показало, что виды льна представлены в основном мелкохромосомными формами. Для более детального изучения их геномов необходим комплекс современных молекулярно-биологических и цитогенетических методов. Такой подход позволит наиболее полно выявить сходство и различия геномов как на генном, так и на хромосомном уровнях.
Целью данной работы было сравнительное изучение геномов близкородственных видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum рода Linum с помощью хромосомных и молекулярных маркёров для уточнения их таксономического статуса и определения гненетической близости.
В основные задачи исследования входило:
Определение хромосомных чисел у близкородственных видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum.
Идентификация хромосом в кариотипах исследуемых видов льна и построение хромосомных идиограмм.
Физическая локализация рибосомных генов на хромосомах изучаемых видов льна с помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Исследование геномного полиморфизма видов секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum с помощью RAPD-анализа.
Определение родственных взаимоотношений видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum.
Межмикросателлитный анализ (ISSR-маркёры)
Для исследования вариабельности геномов также часто используется метод AFLP. Этот метод, как и RAPD, не требует ни предварительного клонирования, ни секвестрования ДНК.
Особености подхода заключаются в следующем: геномная ДНК обрабатывается набором рестриктаз (как правило, двумя различными рестриктазами, узнающими 6-ти и 4-х нуклеотидные последовательности. Затем к полученным фрагментам лигируют специфические олигонуклеотидные адаптеры. Для амплификации используются специально сконструированные праймеры, которые состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы ( 15 нуклеотидов), и короткой произвольной последовательности из 2-4 нуклеотидов на З -конце (Mueller and Wolfenbarger, 1999; Vos et al, 1995). Относительно большая длина фиксированной части обеспечивает высокую специфичность праймера, что обеспечивает хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность на З -конце определяет долю фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-фингерпринтинг), которые затем разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой і уникальную последовательность ДНК, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при- любой другой технике анализа геномного полиморфизма. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования (Thomas et al, 1995; Menz et al, 2002), a также в популяционных и филогенетических исследованиях (Buntjer et al, 2002). В последние годы этот метод получает все более широкое применение для исследования I мало изученных таксономических групп.
Межмикросателлитный анализ (ISSR-маркёры). (ISSR - Inter Simple Sequence Repeats) Начиная с 1994 г. в практику молекулярного маркирования вошел ISSR-ПЦР анализ (Zietkiewicz et al., 1994). Микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, у которых повторяющиеся единицы І представлены ди-, три- или тетра- нуклеотидами и общая протяженность тандемных блоков составляет, как правило, не более 100 п.н. Микросателлиты широко распространены в эукариотических геномах (как растительных, так и животных). Например, в геноме человека динуклеотидные повторы встречаются в среднем каждые 2 т.п.н. \ Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные 4-12 единицам микросателлитного повтора и несущие на 3 конце последовательность из 2 - 4 произвольных нуклеотидов (так называемый "якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно \ близко расроложенными микросателлитными последовательностями (как правило, это ) уникальная ДНК). В результате амплифицируется большое число фрагментов, дающих на электрофореграмме дискретные полосы (ISSR-фингерпринтинг). Полученные паттерны ПЦР-продуктов видоспецифичны и представляют собой набор межмикросателлитных фрагментов ДНК разной длины. ISSR-маркеры относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/ отсутствию полосы.
Аналогично RAPD и AFLP, для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК (Bornet and Branchard, 2001). ISSR-анализ обеспечивает высокую разрешающую способность, свойственную для RAPD-метода, обладая при этом большей воспроизводимостью спектра (из-за большей длины праймера и его комплементарности микросателлитному району), и наряду с AFLP и RAPD может быть с успехом использован для выявления меж- и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в некоторых случаях - и для индивидуального генотипирования (Gumpta et al, 1994; Fang et al, 1998; Neve and Meglecz, 2000; Zietkiewicz et al, 1994). ISSR-маркеры могут применяться также для картирования геномов и маркирования хозяйственно-полезных признаков (Galande et al., 2001; Irzikovska et al., 2001; и другие).
Полиморфизм межгенных спсйссрных последовательностей (ITS). Рибосомная ДНК составляет значительную часть растительного генома и организована в тандемные повторы, которые состоят из консервативных последовательностей кодирующих рРНК и быстро эволюционирующих спейсерных участков. У эукариот рибосомные гены сгруппированы в кластеры, которые содержат сотни или даже тысячи копий генов. Несмотря на высокий общий консерватизм последовательностей рибосомных генов у растительных и животных видов, внутренние транскрибируемые спейсерные районы (ITS - internal transcribed spacer) генов рДНК характеризуются значительной вариабельностью последовательностей ДНК, и, в большинстве случаев, различаются даже у близкородственных видов (Porter etal., 1991).
У большинства видов участок ITS1 - 5.8S-pPHK - ITS2 имеет оптимальную для PCR-амплификации длину (-600 п. н.). Сравнительный анализ секвенированных последовательностей межгенных спейсеров позволяет определять степень генетической близости родственных видов. (Baum and Hoch, 1994; Родионов и др, 2005; Wang et al., 2009; и другие).
В-хромосомы, растений
Изучение геномов растений осуществляется уже длительное время с помощью "классической" стратегии, базирующейся на картировании хромосом с использованием генетических и физических маркеров (Журавлева и др, 2000; Islam-Faridi et al., 2002). Гибридизация нуклеиновых кислот in situ, является одним из наиболее наглядных и информативных методов исследования генома. Он не только позволяет локализовать на хромосомах определенные последовательности ДНК, но и объективно выявлять индивидуальные хромосомы и их отдельные районы на основе особенностей их молекулярно-генетического строения. Гибридизация in situ может проводиться на тканевых, клеточных и хромосомных препаратах, сочетая в себе преимущества классического цитологического и цитогенетического анализа и современных молекулярных методов. При этом она позволяет связать морфологические особенности хромосом или клеток с молекулярной организацией нуклеотидных последовательностей, входящих в их состав. Поскольку с помощью гибридизации in situ возможно обнаружить тонкие изменения организации наследственного материала в индивидуальных клетках, использование этого метода позволяет выявлять измененные клетки среди тысяч клеток с нормальным генотипом, что не под силу ни одному молекулярному методу.
Как метод прямого картирования последовательностей ДНК на хромосомах, гибридизация нуклеиновых кислот in situ была впервые проведена в конце 60-х годов на животных (Gall and Pardue, 1969; John et al., 1969; Yasminech and Yunis, 1970; и другие) и несколько позже - на растительных объектах (Brady and Clutter, 1972; Wimber et al., 1974; Timmis et al., 1975; и другие). Первоначально для гибридизации с цитологическими препаратами использовали РНК- или ДНК-зонды, меченые радиоактивными изотопами. Денатурацию ДНК на препаратах проводили с помощью щелочей (Pardue and Gall, 1970, 1975), сильных кислот (Gall et al., 1971; Wimber et al., 1974), органических растворителей (Восток и Самнер, 1981) или сильным нагреванием (Jones, 1970). В 1970г. Уимбер и Стеффенсен предложили использовать формамид, который облегчает расхождение комплиментарных цепей ДНК и позволяет использовать более мягкие условия при денатурации ДНК, что предотвращает ее разрушение. Для выявления сайтов гибридизации радиактивно меченных зондов использовали радиоавтографию (Gall and Pardue, 1969; John et al., 1969; Hutchinson et al., 1982; и другие).
Радиоактивная in situ гибридизация - как метод картирования различных последовательностей ДНК на хромосомах животных и растений имеет ряд недостатков. Наиболее существенные из них - низкая чувствительность и разрешающая способность и, связанная с этим, необходимость анализа большого числа метафазньгх пластинок при локализации уникальных последовательностей. А также долгая экспозиция препаратов, связанная с длительным периодом полураспада изотопов.
Разработанный в начале 80-х годов метод in situ гибридизации с ДНК-зондами, мечеными биотином, позволил преодолеть эти сложности. Впервые гибридизация с использованием биотинилированных зондов была проведена на хромосомах животных (Manuelidis et al., 1982; Singer and Ward, 1982; Langer-Safer et al., 1982), a несколько позднее - и на хромосомах растений (Rayburn and Gill, 1985). Согласно этому методу, ДНК зонд метится биотинированньгм дУТФ (био-дУТФ), а сайты гибридизации выявляются авидином или стрептавидином; ковалентно связанные с ферментными репортерными молекулами - пероксидазой хрена или щелочной фосфотазой (Lapitan et al, 1987; Mukai et al., 1990; Fukui et al., 1994; и другие). Позднее была разработана система, основанная на использовании меченых дигоксигенином (диг-дУТФ) нуклеотидов, выявляемых с помощью антител, связанных с ферментом (например, Anti-digoxigenin-POD, fab fragment). Дигоксигенин, стероидный гаптен, выделенный из наперстянки (Digitalis), в природе распространен намного реже, чем биотин. В связи с этим, использование диг-меченых зондов для» гибридизации позволяет существенно снизить уровень неспецифического связывания при детекции сигнала по сравнению с биотинилированными пробами.
Дальнейшим усовершенствованием метода in situ гибридизации стала разработка способов флуоресцентной детекции сигнала - Fluorescence in situ Hybridization или FISH (Langer-Safer et al., 1982; Pinkel et al., 1986). Метод основан на гибридизации известной по нуклеотидному составу ДНК-пробы с тестируемыми хромосомами и последующим выявлением места ее локализации по флуоресцентной метке. Для этого ДНК-проба либо непосредственно метится флуоресцентным красителем (прямая детекция), либо метится репортерными. молекулами (биотин, дигоксигенин), которые на препарате выявляются с помощью других соединений (непрямая детекция). Использование зондов, напрямую меченых флуорохромами, не требует использования антител для выявление сайтов гибридизации, что значительно упрощает процедуру гибридизации (Wiegant et al., 1991). Однако, разрешающая способность такого метода невысока, поэтому он, как правило, непригоден для локализации малокопийных и уникальных последовательностей ДНК. При непрямой детекции биотин связывают с авидином или стрептавидином, который выявляют с помощью антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем. Дигоксигенин выявляют с помощью специфичных антител, также конъюгированных с флуорохромом. Интенсивность флуоресценции гибридизационных сигналов можно повысить, используя, связанные с флуорохромом, вторичные и третичные антитела. Разработка систем регистрации флуоресцентных сигналов и анализа изображений еще более расширили возможности FISH.
Важным преимуществом FISH над другими методами явилась возможность локализации на одном препарате одновременно нескольких ДНК-зондов (Lichter et al., 1990; Wiegant et al., 1991; Mukai, 1996). Для этого несколько проб метят различными гаптенами, которые выявляют с помощью специфичных антител, меченных разными флуорохромами (Leitch et al., 1991; Mukai et al., 1993; Badaeva et al, 1996, b). Например, FISH является самым наглядным методом физической локализации 5S и 45S рибосомных генов на хромосомах различных видов. Использование рибосомных генов в качестве хромосомных и эволюционных маркеров позволяет уточнить морфологические особенности хромосом, а также устанавливать родственные связи между отдельными видами, помогает понять их филогенетические взаимоотношения (Snowdon et al., 1999; Nakamura et al., 2001; Dhar et al., 2002; Vaio et al., 2005; и другие).
Одним из наиболее интересных вариантов метода является геномная in situ гибридизация - Genomic in situ Hybridization или GISH, позволяющая дифференцировать хромосомы родительских геномов в составе аллополиплоидов (Schwarzacher et al., 1989; Le et al., 1989; Heslop-Harrison and Schwarzacher, 1996; и другие). При проведении GISH меченую геномную ДНК одного из родителей используют как пробу, а немеченую ДНК другого родителя или самого полиплоида используют для блокирования кросс-гибридизации. В результате хромосомы или части хромосом, унаследованные от одного из родителей, оказываются меченными, а хромосомы, унаследованные от другого родителя - не флуоресцируют. GISH служит уникальным инструментом для исследования процессов формирования геномов полиплоидных видов, выявления интрогрессии чужеродного генетического материала и локализации точек разрывов при межгеномных транслокациях у отдаленных гибридов (Jiang and Gill, 1994; Heslop-Harrison and Schwarzacher, 1996).
Молекулярно-филогенетические исследования видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum
Для вида L. hirsutum из секции Dasylinum также определялись разные гаплоидные хромосомные числа: n=8 (Ray, 1944; Chennaveeraiah, Joshi, 1983) и n=15 (Seetharam, 1972).
У видов L. tenuifolium и L. suffruticosum из секции Linastrum число хромосом в гаплоидном наборе равно 9 (Ray, 1944; Rogers, 1980). Кроме того, была описана видовая форма L. suffruticosum, у которой гаплоидное число хромосом равно 36 (Rossello et al., 1987).
Попытка уточнить филогенетические взаимоотношения видов рода Ыпит проводилась также с помощью сравнительного анализа монохромно окрашенных кариотипов (Марценицина, 1927; Kikuchi, 1926; Ray, 1944; Harris, 1968; Petrova; 1973; Chennaveeraiah and Joshi, 1983).
Кариологическое изучение видов секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum с помощью монохромного окрашивания хромосом было начато в начале прошлого века (Марценицына, 1927; Kikuchi, 1926). Марценицына первая в своей работе даёт описание кариотипов культурного льна и его 9 дикорастущих сородичей. Ей было показано, что внутри рода виды различаются не только по числу, но и по размеру и форме хромосом. Автор исследуемые виды разделяет на пять групп в зависимости от определённого ей числа хромосом и их морфологии.
Из секции Syllinum в её работе был исследован вид L. flavum, из секции Linastrum - L. tenuifolium. Для L. flavum было определено два гаплоидных хромосомных числа: п=15 и п=16, для L. tenuifolium п-9. Бьшо отмечено сходство размеров и формы хромосом данных видов.
При сопоставлении своих данных сравнительного анализа кариотипов с данными о систематическом положении видов внутри рода автор отмечает их некие несоответствия, так как в группы с общим кариотипом попадают виды, помещённые систематиками в разные секции, и наоброт.
Позже в работе Ray, (1944) так же с помощью монохромного окрашивания бьшо проведено сравнительное исследование генетической системы рода Linum уже на сорока двух дикорастущих видах льна Старого и Нового Света, а так же различных сортов культурного льна.
Из секции Syllinum в их работе были описаны кариотипы L. flavum, L. capitatum и L. campanulatum, а также L. hirsutum из секции Dasylinum, и L. tenuifolium из секции Linastrum. Для видов L. capitatum и L. campanulatum автор определил гаплоидное число хромосом, равное 14, а для L. flavum — п=15; для видов L hirsutum и L. tenuifolium п=8 и 9 соответственно.
Было показано, что большинство видов льна имеет мелкие хромосомы (1-4 мкм). В зависимости от размера хромосом автор разделил виды на 3 группы: виды с хромосомами длиной 1-1,5 мкм были отнесены к «малой» группе, виды с длиной хромосом 3-4 мкм принадлежали к «средней» группе и виды с хромосомами размером 6 и более микрон были отнесены к «большой» группе. Все виды из секции Syllinum, изученные в данной работе, попали в «большую» группу. Сюда же был отнесён L. hirsutum (sec Dasylinum). L. tenuifolium был помещён в «среднюю» группу.
По числу и морфологии хромосом автор внутри рода выделяет 7 различных кариотипов: кариотшг с хромосомами «средней» группы с п=8; с хромосомами «большой» группы с п=8; с хромосомами «средней» группы с п=9; с хромосомами«средней» группы с п=10; с хромосомами «большой» группы с п=14; с хромосомами «малой» группы с п=15 и кариотип с хромосомами «большой» группы с п=15.
Ранее в работах некоторых систематиков (Hayek, 1914) предлагалось поместить L. hirsutum в секцию Syllinum. Несмотря на то, L. hirsutum имеет кариотип с хромосомами «большой» группы с п=8; а виды секции Syllinum кариотипы с хромосомами «большой» группы с п=14, и хромосомы «большой» группы с п=15, Рей на основании своих данных также счёл это правомерным.
Позже в исследовании индийских учёных (Chennaveeraiah and Joshi, 1983) с помощью монохромного окрашивания были изучены 19 видов рода Linum из секций Linum, Syllinum, Dasylinum и Linastrum. На основании данных кариотипирования и фенотипических различий авторами было построено предполагаемое филогенетическое древо как для старосветских, так и для новосветских видов рода Linum, в основе которого в качестве исходного вида указан Linum austriacum L. Для некоторых видов были приведены новые хромосомные числа и впервые - формулы кариотипов.
Из секции Syllinum в работе исследованы виды L. flavum, L. capitatum и L. nodiflorum L., а также L. hirsutum (sec. Dasylinum). Для L. capitatum было определено гаплоидное число хромосом, равное 17. Ни у одного из изученных ранее видов рода Linum такое число определено не было. Для L. flavum было определено п, равное 14, а у L. nodiflorum п=13. Для этих видов также были показаны значительные различия формул их кариотипов. На основании сравнительного анализа кариотипов и морфологических признаков видов льна, изученных в этой работе, авторами было сделано предположение, что базовым хромосомным числом рода является п-9, и L. hirsutum (2п=16) мог произойти от общего предкового вида рода — 18-хромосомного L. austriacum в результате нисходящей анеуплоидии.
Филогения видов секции Syllinum авторам представляется следующим образом: у L. capitatum п=17 объясняется возможным происхождением от видов с хромосомными числами, равными 9 и 8. L. flavum (п=14) имеет непрямое происхождение от L. capitatum (т.е. прямой предок не установлен), a L. nodiflorum (2п=13) имеет непрямое происхождение от L. flavum.
Таким образом, приведенные выше результаты сравнительного анализа монохромно окрашенных хромосом льна показали, что число хромосом у представителей секции Syllinum варьирует от 26 до 34, кариотип представлен крупными хромосомами, за исключением L. nodiflorum, у которого хромосомы имеют средние размеры. Кариотип L. tenuifolium из секции Linastrum содержит 18 хромосом среднего размера. L. hirsutum из секции Dasylinum имеет самые крупные среди льновых хромосомы, число которых равно 16.
По мнению Кутузовой и др. (1998) для изучения филогении столь разнообразной и сложной группы, как льновые, одного монохромного окрашивания, выявляющего лишь общие кариотипические различия, недостаточно. Необходим комплекс современных молекулярных и цитогенетических методов, которые позволят наиболее полно выявить черты сходства и различия геномов.
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) с пробами 26S и 5S рибосомных генов и дифференциальное DAPI-окрашиваине хромосом
Для выделения ДНК брали двух-трёх дневные индивидуальные проростки (200 мг) и такие же проростки 7-10 растений. Растительный материал» измельчали в присутствии жидкого азота, далее выделение проводилось с использованием набора реактивов Plant Genomic DNA Miniprep Kit (V-gene bio- technology limited, China) в соответствии с протоколом.
Концентрацию и степень очистки выделенной ДНК определяли на планшетном спектрофотометре SPECTRAmax PLUS384 (Molecular Devices, США), результаты измерений вычисляли с помощью программы SOFTmax PRO (Molecular Devices, США).
Выполнение RAPD-PCR проводилось с использованием 10-нуклеотидного праймера А12 (5 CGGCGATAG-3 ) фирмы Qiagen, Operon Technologies (Denmark).
Для полимеразной цепной реакции использовали 0.5 мл тонкостенные пробирки (QSP). Реакция собиралась в стерильных условиях в ламинарном потоковом боксе CAT V3-1300 (Kojair). Сначала собирали общую смесь -"премикс" в одной пробирке, затем смесь вносили в реакционные пробирки в объеме 20 мкл и добавляли 5 мкл нормализованной до концентрации 1нг/мкл матричной ДНК. Для ПЦР использовались стандартные наборы реактивов (Диалат ЛТД).
Стандартная реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции (конечный объем реакции 25 мкл) содержала (Таблица 7):
Реакцию проводили на термоциклере РТС-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research) по программе: первичная денатурация: 94C - 5 минут однократно; 37 рабочих циклов: 94С - 30 секунд, 36С - 30 секунд, 72С - 1 минута; достройка: 72С - 10 минут однократно. При проведении реакции использовали программный подогрев крышки термоблока.
По окончании амплификации к пробам добавляли по 5 мкл буфера для нанесения проб, содержащего 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 30% глицерина, и анализировали результаты в 6% полиакриламидном геле.
Электрофорез проводили при силе тока 75 тА/час в течение 2,5 часов в камере для вертикального электрофореза белков и нуклеиновых кислот VE-3M (ООО "Хеликон"). В качестве стандарта длин фрагментов ДНК использовали ДНК-маркер молекулярных масс ЮОЬр + 1,5КЬ («Сибэнзим») и 100 bp Molecular Ruler DNA Size Standard (Bio-Rad). После завершения электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 30 мин и отмывали в дистиллированной воде в течение 30 мин.
Регистрацию электрофореграмм проводили на компьютере с помощью программы записи изображения Typhoon Scanner Control (Molecular Dynamics) и сканера гелей Typhoon8600 (Molecular Dynamics) с использованием лазера с длиной волны возбуждения 532 шп, фильтра эмиссии ROX 610 ВР 30 и подачей напряжения на фотоумножитель 500 V при нормальной чувствительности. Разрешающая способность сканера составляет 100 мкм на пиксель.
RAPD-спектры ДНК видовых образцов льна были проанализированы с помощью программного обеспечения Phoretix ID Advanced (Nonlinear Dynamics, Великобритания). При анализе RAPD-спектров учитывали амплифицированные фрагменты размером от 100 до 1000 пар нуклеотидов. Для количественной оценки RAPD-полиморфизма между изученными видами льна учитывалось наличие или отсутствие в RAPD-спектрах одинаковых по размеру ампликонов, а также их интенсивность.
Филогенетические построения выполняли на основе расчётов коэффициентов корреляции индивидуальных RAPD-спектров по Пирсону (1896) с помощью программы PHORETIX ID Database "Nonlinear Dynamics" (Великобритания).
Дендрограмма геномного сходства исследуемых видов льна была построена методневзвешенных парногрупповых средних (UPGMA). 1. Кариологическое изучение видов льна секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum. Идентификация хромосом и сравнительный анализ кариотипов близкородственных видов льна из секций Syllinum, Dasylinum и Linastrum были проведены с помощью дифференциального DAPI-окрашивания и одновременной локализации на хромосомах сайтов 26S и 5S рДНК с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Дифференциальное DAPI-окрашивание по характеру распределения бэндов на хромосомах имеет значительное сходство с С-бэндингом и успешно применяется для идентификации хромосом (Schweizer, 1980).
Морфометрический анализ позволил составить формулы кариотипов и построить идиограммы хромосом исследованных видов в соответствии с основными принципами цитологической номенклатуры (Агапова и Гриф, 1982). На идиограммах схематично отображали распределение DAPI-бэндов по длине хромосом и указывали локализацию сайтов рибосомных генов.
Из секции Syllinum были исследованы виды L. flavum L., L. capitatum Kit. ex Schultes, L. tauricum Willd., L. thracicum Degen, L. campanulatum L., L. elegans Sprun. ex Boiss., L. czernjajevii Klokov и L. nodijlorum L.
Для определения хромосомных чисел был проведен подсчёт монохромно окрашенных хромосом (1% раствор ацетокармина) в метафазных пластинках у всех исследуемых видов секции. Подсчет показал, что у видов L. flavum, L. capitatum, L. campanulatum, L. tauricum, L. thracicum, L. elegans и L. czernjajevii количество хромосом варьирует от 28 до 34 на метафазную пластинку (Табл. 8). Вариабельность хромосомных чисел наблюдалась как между отдельными растениями, так и внутри индивидуального растения. Обнаруженное нами внутри- и межиндивидуальное варьирование количества хромосом объясняет несовпадения хромосомных чисел, определенных разными авторами для этих же видов секции Syllinum (Табл. 8).
