Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Ядро ооцита насекомых как модельная система. Классификация типов оогенеза насекомых 14
2.2. Структурно-функциональная организация ядер ооцитов 18
2.2.1. Особенности организации хроматина 18
2.2.1.1. Хромосомы типа ламповых щеток 18
2.2.1.2. Кариосфера в оогенезе насекомых 21
2.2.1.3. Амплификация рДНК в ооцитах насекомых 27
2.2.2. Внутриядерные тельца в ядрах ооцитов 30
2.2.2.1. Внутриядерные тельца в ядрах ооцитов амфибий 30
2.2.2.2. Внутриядерные тельца в ядрах ооцитов насекомых 32
2.3. Ядерные домены эукариотической клетки и их молекулярные компоненты 36
2.3.1. Перихроматиновые фибриллы 37
2.3.2. Роль РНК-пол II в координировании процессов созревания мРНК 39
2.3.3. Кластеры интерхроматиновых гранул 43
2.3.4. Тельца Кахала 48
2.3.4.1. Коилин 49
2.3.4.2. U7 мяРНП 54
2.3.4.3. Тельце Кахала и ядрышко 55
2.3.4.4. Тельце Кахала и биогенез сплайсосомных мяРНП 56
2.3.4.5. Тельце Кахала - динамичная структура 59
3. Материал и методика 61
3.1. Животные 61
3.2. Использование различных объектов для конкретных методических задач 61
3.3. Подготовка материала для флуоресцентной микроскопии 62
3.4. Антитела и ммунофлуоресцентное окрашивание препаратов 63
3.5. Микроинъекции 65 3.5.1. ШмяРНК 65 3.5.2.5-бромоуридин-5'-трифосфат 66
3.6. Ингибиторный анализ 67
3.6.1. Актиномицин D 67
3.6.2. DRB 68
3.7. Светооптическая микроскопия 68
3.7.1. Флуоресцентная микроскопия 68
3.7.2. Конфокальная микроскопия 68
3.7.3. Микроскопия по Номарскому и выявление ДНК в нефиксированных ядрах 69
3.8. Электронная микроскопия 69
3.8.1. Стандартная электронная микроскопия 69
3.8.2. Иммуноэлектронная микроскопия 70
3.9. Электрофоретическое разделение белков и иммуноблоттинг 71
4. Результаты 72
4.1. Строение овариол домового сверчка. Морфодинамика ядерных структур ооцитов Acheta domesticus на диплотене
4.2. Оценка транскрипционной активности ядер ооцитов A. domesticus с помощью микроинъекций бромо-УТФ 79
4.3. Ультраструктурная организация телец Кахала в ооцитах домового сверчка 81
4.4. Идентификация и молекулярный состав телец Кахала в ооцитах домового сверчка 82
4.4.1. Вестерн-блотинг антител к коилину с экстрактами белков ооцитов насекомых 84
4.4.2. Иммуноцитохимическая идентификация телец Кахала в ооцитах 87
4.4.3. Идентификация телец Кахала с помощью микроинъекций U7 мяРНК 94
4.4.4. Иммунологическая характеристика телец Кахала ооцитов сверчка с помощью антител к факторам транскрипции, сплайсинга пре-мРНК и процессинга пре-рРНК 97
4.4.4.1. Фибрилларин - мажорный компонент телец Кахала ооцитов домового сверчка 97
4.4.4.2. Распределение факторов сплайсинга (мяРНП и SR-белка SC35) в составе сложных телец Кахала ооцитов домового сверчка. 97
4.4.4.3. Тельца Кахала ооцитов домового сверчка содержат коактиваторы транскрипции СВР/рЗОО и базальный фактор транскрипции TFI1D, но не содержат РНК-полимеразу II 98
4.5. Идентификация и ультраструктурная организация кластеров интерхроматиновых гранул в ооцитах насекомых
4.6. Особенности организации и молекулярного состава телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул ооцитов в условиях подавления транскрипции с помощью ингибиторов
4.6.1. Морфологические эффекты действия DRB и актиномицина D на ядерные структуры ооцитов домового сверчка
4.6.2. Иммуноцитохимическая характеристика ядерных структур (телец Кахала и кластеров интерхроматиновых гранул) ооцитов домового сверчка при действии ингибиторов транскипции
4.6.3. Действие актиномицина D на ооциты моллюска Achatina fiilica 129
5. Обсуждение 138
5.1. О транскрипционной активности хромосом при автотрофном типе оогенеза
5.2. О ядрышковом аппарате ооцитов насекомых 139
5.3. Экстрахромосомные ядерные структуры ооцитов насекомых с паноистическими яичниками
5.4. Проблема идентификации экстрахромосомных ядерных структур в J43 ооцитах
5.5. Коилин как маркерный компонент телец Кахала 145
5.6. U7 мяРНК и тельца Кахала 148
5.7. О присутствии белка SC35 в тельцах Кахала ооцитов насекомых 149
5.8. Вьивление компонентов РНК-пол П-транскрипции в тельцах Кахала 151
ооцитов сверчка. Функции телец Кахала ооцитов
5.9. Кластеры интерхроматиновых гранул ооцитов насекомых 155
6. Выводы 160
7. Список литературы 162
- Ядро ооцита насекомых как модельная система. Классификация типов оогенеза насекомых
- Использование различных объектов для конкретных методических задач
- Строение овариол домового сверчка. Морфодинамика ядерных структур ооцитов Acheta domesticus на диплотене
- О транскрипционной активности хромосом при автотрофном типе оогенеза
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании различных аспектов экспрессии генов, однако вопросы структурной организации молекулярно-биологических процессов в трехмерном пространстве ядра, участие в них различных экстрахромосомных ядерных образований, или доменов, остаются открытыми.
В этой связи актуальной проблемой представляется изучение внутриядерного распределения основных «участников» экспрессии генов, в том числе РНК-полимераз, включая РНК-полимеразу II (РНК-пол II), факторов транскрипции и процессинга разных типов РНК. Следует учитывать, что в настоящее время преобладают представления о том, что на регуляцию экспрессии генов и координацию составляющих ее многостадийных событий наряду с особенностями упаковки генетического материала в хроматине и расположения собственно хромосом в ядре существенное влияние оказывают экстрахромосомные домены нуклеоплазмы (Misteli and Spector, 1998; Cremer et al., 2004).
Часть таких доменов представлена в виде перихроматиновых фибрилл, являющихся морфологическим «выражением» первичных транскриптов мРНК (Fakan, 1994), а другая оформлена в виде различных ядерных телец (nuclear bodies) (Brasch and Ochs, 1992). Среди ядерных телец, очевидно, имеются универсальные для разных типов клеток структуры, а также такие, которые характеризуют лишь определенный тип клеток или существуют лишь в определенных физиологических условиях (Gall et al., 2004).
На роль наиболее универсальных ядерных телец, по современным представлениям, подходят кластеры интерхроматиновых гранул (КИТ) и тельца Кахала (ТК) (Gall et al., 2004). В настоящее время можно считать установленным, что ТК и КИТ участвуют в ядерном биогенезе малых ядерных (мя) РНК, однако морфодинамика этих структур, их функциональная взаимосвязь друг с другом и непосредственная роль в процессинге РНК остаются до конца не изученными (Cioce and Lamond, 2005).
Весьма перспективными модельными объектами для изучения доменной организации экстрахромосомной части ядра в настоящее время становятся ооциты в силу крупных размеров их ядер и внутриядерных структур, динамичности самого процесса оогенеза, что позволяет одновременно выделять различные стадии развития яйцеклетки - от активных до инертных. Особенную привлекательность подобного рода исследованиям придают сложные и разнообразные взаимоотношения половых и вспомогательных клеток в оогенезе, при которых ядро ооцита может быть активным, либо инактивироваться. В последнем случае ядерные синтетические функции принимают на себя питающие клетки.
Имеющиеся в литературе данные по организации экстрахромосомных ядерных доменов ооцитов насекомых и по локализации в них компонентов ТК и КИТ весьма ограничены и касаются в основном видов с мероистическими яичниками, характеризующимися инактивацией ядра ооцита (Bogolyubov and Parfenov, 2001; Bilinski and Kloc, 2002; Zelazowska and Jaglarz, 2004; Batalova et al., 2005; Jaglarz et al., 2005). Кроме того, использование традиционных подходов по локализации маркерных компонентов ТК и КИТ в ооцитах насекомых привело к противоречивым результатам, что подчас затрудняет даже простую их идентификацию в связи с высокой гетерогенностью по размерам, количеству, ультраструктурной организации на разных стадиях оогенеза, а в ряде случаев - и по молекулярному составу.
Таким образом, в связи с отсутствием четких и адекватных критериев идентификации ТК и КИТ, противоречивыми данными по их молекулярному составу и преобладанием работ, выполненных на ядрах ооцитов в период их инактивации, представляется актуальным изучение организации, состава, динамики поведения и взаимоотношений друг с другом ТК и КИТ в активных ядрах ооцитов насекомых, характеризующихся паноистическими яичниками. В настоящей работе мы по существу впервые обращаемся к изучению ядерных доменов ооцитов таких насекомых на примере домового сверчка Acheta domesticus.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлась идентификация и анализ экстрахромосомных структур, содержащих компоненты транскрипции и процессинга РНК, в диплотенных ядрах ооцитов Acheta domesticus.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи.
Охарактеризовать транскрипционный статус ядер ооцитов A. domesticus на стадии диплотены.
Описать экстрахромосомные структуры интерхроматиновой области ядер ооцитов этого вида.
Проанализировать внутриядерное распределение компонентов транскрипции, осуществляемой РНК-пол II (факторов, непосредственно входящих в состав голоэнзима РНК-пол II или функционально с ним связанных), а также факторов процессинга РНК.
Идентифицировать структуры, соответствующие КИТ. С целью усиления сравнительного подхода и поиска возможных общих принципов организации КИТ ооцитов выявить гомологичные структуры в ооцитах животных, обладающих другими типами оогенеза: Sarcophaga sp. и Tenebrio molitor (нутриментарный оогенез), а за пределами класса насекомых - у моллюска Achatina fulica, обладающего типичным солитарным оогенезом.
С помощью комплексного подхода идентифицировать ТК ооцитов A. domesticus, исследовать динамику их основных компонентов, оценить структурно-пространственные взаимоотношения ТК с КИТ, хромосомами и ядрышками.
Изучить поведение внутриядерных структур, содержащих факторы созревания РНК, в транскрипционно активных ядрах и при подавлении транскрипции с помощью ингибиторов.
Основные положения, выносимые на защиту.
В ядрах ооцитов домового сверчка A. domesticus присутствуют ТК и КИТ -универсальные ядерные органеллы половых и соматических клеток, содержащие ведущие компоненты экспрессии генов.
ТК диплотенных ооцитов A. domesticus содержат маркерный белок - коилин, фактор процессинга пре-мРНК - фибрилларин, факторы сплайсинга пре-мРНК - мяРНП и белок SC35, компоненты РНК-пол П-транскрипции - базальный фактор транскрипции TFIID и белки-коактиваторы транскрипции СВР/рЗОО, но не содержат РНК-пол П.
КИТ ооцитов насекомых различных систематических групп имеют сходную ультраструктурную организацию и молекулярный состав.
Подавление транскрипции с помощью ингибиторов с разными механизмами действия вызывает сходные эффекты: существенную сегрегацию ультраструктурных компонентов ТК и КИТ и увеличение количества КИТ в нуклеоплазме. Действие ингибиторов не приводит к перераспределению основных молекулярных компонентов ТК и к накоплению в ТК РНК-пол II, которая аккумулируется в фибриллярных областях КИТ.
Научная новизна работы. Впервые в транскрипционно активных ядрах ооцитов насекомых с помощью различных адекватных критериев идентифицированы ТК и КИТ и доказана их гомология соответствующим структурам ооцитов других животных и соматических клеток млекопитающих. Впервые представлены сведения об особенностях организации, состава ТК и КИТ и их связи на разных стадиях оогенеза в нормальных условиях и после подавления транскрипции с помощью ингибиторов. Впервые с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии выявлена колокализация ряда ведущих компонентов процессинга разных типов РНК в ТК и КИТ ооцитов насекомых.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения структуры, функции и динамики ядерных структур, содержащих компоненты экспрессии генов; и способствуют углублению знаний о перераспределении факторов транскрипции и процессинга РНК на разных стадиях оогенеза. Полученные в работе данные создают базис для перспективного изучения
проблемы взаимосвязи различных ядерных доменов. Кроме этого, результаты работы используются в учебных спецкурсах, читаемых на кафедре биологии развития биолого-почвенного факультета СПбГУ, на факультете медицинской физики СПбГТУ, а также в учебно-методических пособиях для студентов.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на XIII, XIV и XV Всероссийских симпозиумах «Структура и функция клеточного ядра», (Санкт-Петербург, 1999, 2002, 2005), I Всероссийском съезде клеточных биологов (Санкт-Петербург, 2003), конгрессе ELSO (European Life Scientist Organization) (Ницца, Франция, 2004), XIV школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Звенигород, 2005), межинститутском семинаре «Современные конфокальные микроскопы фирмы Leica и их применение в биологии» (Санкт-Петербург, 2006), научных семинарах Лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН.
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 03-04-49389, 04-04-48080, 06-04-48904) и Администрации Санкт-Петербурга.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 статей и 8 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 194 страницах машинописного текста и иллюстрирована 31 рисунком и 2 таблицами.
Ядро ооцита насекомых как модельная система. Классификация типов оогенеза насекомых
В 1960-70-х годах происходило активное накопление сведений о морфологической организации экстрахромосомных образований ядер ооцитов насекомых, обладающих яйцевыми трубками разного строения и, соответственно, характеризующихся разными типами оогенеза (Gruzova, 1988).
Прежде всего, следует остановиться на общих принципах строения женской половой системы насекомых и классификации типов оогенеза, поскольку считается, что именно эти особенности во многом определяют морфофункциональный статус ядра ооцитов; при этом основным детерминирующим фактором будет, очевидно, являться источник РНК в оогенезе: поступает ли она в ооплазму из трофоцитов или синтезируется самим ооцитом (Грузова, 1977).
Общие принципы организации женской половой системы насекомых представлены на Схеме 1.
Функциональной единицей яичников являются яйцевые трубки (овариолы), покрытые эпителиальной оболочкой (tunica externa), под которой находится неклеточная tunica ргорпа. Яйцевая трубка состоит из трех анатомически не обособленных друг от друга отделов: терминального филамента, гермария и вителлярия. Гермарий во всех случаях является тем отделом овариолы, в котором на определенных этапах развития половой системы происходят оогониальные деления и формирование ранних фолликулов, а вителлярий является местом созревания ооцитов (Postlethweit and Giorgi, 1985). Размеры ооцитов постепенно возрастают по направлению к базальной части овариолы.
Яичники насекомых в зависимости от наличия вспомогательных клеток и особенностей их взаимоотношений с ооцитом принято подразделять на паноистические (от греч. pan - все, бон - яйцо), в которых ооциты окружены только фолликулярньм эпителием, а в овариолах отсутствуют трофоциты, и мероистические (от греч. mews - часть, ооп - яйцо) (Схема 2).
Использование различных объектов для конкретных методических задач
Основным объектом исследования являлся домовой сверчок Acheta domesticus (L.) (Insecta, Orthoptera: Gryllidae). Животных содержали в лабораторных условиях при температуре 27-30 С. В работе были использованы нимфы самок последних возрастов и взрослые самки.
В качестве дополнительных объектов были использованы половозрелые самки следующих видов: серой мясной мухи Sarcophaga sp. L. (Insecta, Diptera: Sarcophagidae), собранных в пос. Токсово Ленинградской области, Рапогра communis L. (Insecta, Mecoptera: Panorpidae), собранных там же, а также культивируемого в лабораторных условиях мучного хрущака Tenebrio molitor L. (Insecta, Coleoptera: Tenebrionidae), а помимо насекомых - особи гигантской африканской улитки Achatina fulica (Gastropoda, Stylommatophora: Helicidae). Культуру жуков Т. molitor содержали при комнатной температуре, моллюсков -при 23-25 С. 3.2. Использование различных объектов для конкретных методических задач
Перечисленные выше дополнительные объекты были привлечены, прежде всего в части работы, посвященной характеристике КИГ ооцитов животных, обладающих разными типами оогенеза (Sarcophaga sp. - мероистические политрофные яйцевые трубки, нутриментарный оогенез; Т. molitor -мероистические телотрофные яйцевые трубки, нутриментарный оогенез; A. fulica -солитарный оогенез). Ооциты A. fulica использованы также в опытах по подавлению транскрипции с помощью актиномицина D, а ооциты P. communis использованы для анализа природы «Binnenkorper» (ТК) с помощью иммуноцитохимических методов. Все виды насекомых, указанные выше, были использованы в опытах по Вестерн-блоттингу с целью выяснения возможности использования антител к коилину на разных объектах и оценки электрофоретической подвижности этого белка у далеких в систематическом отношении видов.
В Табл. 1 суммированы основные методические подходы, применявшиеся на ооцитах каждого объекта.
Гонады насекомых изолировали в растворе Рингера для насекомых (0,75 % NaCI; 0,035 % КС1; 0,021 % СаС12) или в физиологической среде OR2 (Wallace et al., 1973). В ряде случаев в соответствующем растворе отпрепаровывали отдельные овариолы. Гонады моллюсков изолировали в физиологической среде OR2.
Для флуоресцентного окрашивания использовали в основном давленые препараты (squashes), реже - тотальные препараты яйцевых трубок. Для приготовления давленных препаратов применяли методику Хулсебоса с соавторами (Hulsebos et al., 1984; Liu et al., 2006a, b). Выделенные овариолы или ооциты помещали на покрытое силиконом Sigtnacote (Sigma, США) покровное стекло в 3 мкл соответствующего физиологического раствора, затем предметным стеклом, предварительно покрытым слоем желатина, слегка надавливали на подготовленный препарат. Не допуская высыхания жидкости под покровным стеклом, препараты замораживали в жидком азоте до момента прекращения кипения азота. С помощью лезвия отделяли покровное стекло, и полученный препарат немедленно фиксировали в течение 20 мин в 2 %-ном растворе параформальдегида, приготовленном на 96 %-ном этаноле, затем проводили через 70 %-ный этанол и несколько раз отмывали в однократном (1х) фосфатно-солевом буферном растворе (PBS).
Строение овариол домового сверчка. Морфодинамика ядерных структур ооцитов Acheta domesticus на диплотене
Женские гонады домового сверчка Acheta domesticus анатомически устроены типично для других представителей прямокрылых насекомых (отр. Orthoptera) (Matsuzaki, 1971; Mahowald, 1972).
Каждый яичник состоит примерно из 100-120 яйцевых трубок паноистического типа, в которых ооциты, находящиеся на последовательных стадиях роста, окружены только фолликулярным эпителием, и в овариолах отсутствуют трофоциты (рис. 1). Каждая овариола покрыта плотно прилегающей к фолликулярному эпителию базальной мембраной - tunica propria, наружная оболочка овариол (tunica externa) отсутствует.
Апикальный отдел овариолы представляет собой гермарий, который содержит оогонии и молодые ооциты, вступившие в рост (стадии от лептотены до пахитены), и префолликулярные клетки. Далее находятся ооциты, еще не располагающиеся линейно и не полностью окруженные фолликулярными клетками (рис. 2, а). Большая часть яйцевой трубки представляет собой вителлярий, в котором находятся ооциты на стадии большого роста, что соответствует стадии диплотены. Каждый ооцит окружен однослойным фолликулярным эпителием; размер фолликулов последовательно увеличивается по направлению к базальной части овариолы. Последние 3-4 из 14 фолликулов овариолы взрослой самки содержат вителлогенные ооциты.
Таким образом, в составе каждой овариолы можно выделить ооциты, находящиеся на последовательных стадиях роста - от превителлогенеза до конца вителлогенеза, когда происходит формирование хориона и резорбция ядерной оболочки ооцитов перед первым делением созревания.
Факт, что подавляющее большинство ооцитов в яйцевой трубке находится на стадии диплотены, несомненно, свидетельствует о длительности этой стадии. Именно диплотенные ооциты домового сверчка и служили основным объектом нашего исследования. Следует подчеркнуть, что стадия диплотены (период большого роста), несмотря на длительность, - весьма динамичная стадия, характеризующаяся определенной и закономерной морфодинамикой ядерных структур.
Опираясь на собственные наблюдения, выполненные при помощи светооптических методов на нефиксированных ядрах (фазово-контрастная микроскопия, микроскопия по Номарскому и флуоресцентная микроскопия с использованием витальных красителей DAPI и То-Рго-3) (, а таюке на имеющиеся работы других авторов (Kunz, 1967b; Mahowald, 1972; Jaworska and Lima-de-Faria, 1973 a, b, с), мы разделили период большого роста ооцитов на три последовательные стадии (рис. 1). Критериями для выделения каждой стадии для нас служило состояние хромосомно-ядрышкового аппарата, а таюке количество и внутренняя организация телец Кахала (ТК) (подробнее об идентификации, организации и морфодинамике ТК ооцитов сверчка см. ниже в соответствующих разделах).
О транскрипционной активности хромосом при автотрофном типе оогенеза
Домовой сверчок Acheta domesticus имеет женские гонады паноистического типа, то есть в них отсутствуют питающие клетки, и следует ожидать, что потребность растущей яйцеклетки в разных типах РНК должна обеспечиваться ядром самого ооцита (автотрофный тип оогенеза - Гагинская, 1975). Полученные нами результаты вполне соответствуют данному предположению. Действительно, ни по нашим наблюдениям, ни по данным других авторов, никогда не наблюдалось конденсации хромосом на диплотене и их объединения в кариосферу, как это происходит в оогенезе многих животных и служит признаком определенной инактивации хромосомного аппарата (Gruzova and Parfenov, 1993; Грузова и др., 1995).
В настоящей работе нам удалось локализовать участки транскрипции с помощью микроинъекций в ооциты A. domesticus бромо-УТФ. Интенсивность включения предшественника была примерно одинакова на всех стадиях роста (ядра ооцитов I, II и III стадий по нашей классификации). Таким образом, каких-либо заметных всплесков транскрипционной активности, как это имеет место, например, в оогенезе Drosophila (Mahowald and Tiefert, 1970), в ооцитах A. domesticus не наблюдается.
Любопытно, что интенсивность включения бромо-УТФ в ядра ооцитов сверчка была не столь высокой, как можно было ожидать. Более того, нам удалось регистрировать флуоресцентный сигнал не ранее, чем через 30 мин - 1 ч после инъекции, в то время как, у паука-крестовика Araneus diadematus, обладающего солитарным типом оогенеза, интенсивное включение бромо-УТФ наблюдали уже через 5 мин после инъекции (Боголюбов, личное сообщение). Кроме того, мы выявляли дискретный характер включения метки, не по всей длине хромосом. Это может свидетельствовать об избирательном характере транскрипционной активности различных генных локусов ооцитов A. domesticus в течение протяженной диплотены. К сожалению, пока мы не можем сказать, какие именно гены экспрессируются в той или иной момент времени. Этот вопрос может послужить предметом дальнейших исследований.
Для насекомых с паноистическими яичниками, к которым относятся сверчки, характерна амплификация рибосомных генов (Cave, 1982). Исследованию организации нуклеолярного аппарата и амплификации в оогенезе A. domesticus посвещен целый ряд работ (Cave, 1973; Jaworska and Lima-de-Faria, 1973a, b). Мы могли точно идентифицировать ядрышки в ооцитах A. domesticus не только морфологически, на светооптическом и ультраструктурном уровнях, но и по их интенсивному связыванию антител к фибрилларину - мажерному фактору процессинга рРНК (Ochs et al., 1985; Туе and Steitz, 1989).
Похожие диссертации на Организация и динамика телец кахала и кластеров интерхроматиновых гранул в ооцитах домового сверчка Acheta domesticus
