Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди трех известных в настоящий момент типов цитоскелетных структур (микрофиламенты, промежуточные филаменты, микротрубочки) особенно важное место занимает система микротрубочек. Эти цитоскелетные элементы играют ключевую роль в механизмах клеточного деления, активного транспорта органелл по цитоплазме, а также миграции клеток по субстрату. Нарушения функций микротрубочек лежат в основе многих патологических процессов, в том числе опухолевой трансформации и различных нейродегенерации (Alberts etal, 2007).
В большинстве клеток животных микротрубочки располагаются в цитоплазме в виде радиальной сети с фокусом схождения в точке вблизи ядра, называемой центром их организации. Выраженность радиальной организации сети микротрубочек бывает различной. Так, для культивируемых меланофоров характерна радиально-симметричная система микротрубочек, в то время как в культивируемых эпителиальных и фибробластоподобных клетках сеть микротрубочек устроена довольно хаотично. Так или иначе, практически все микротрубочки в клетках растут из центров организации так называемыми плюс-концами к периферии, а их минус-концы остаются собранными в центре (Бураков, Надеждина, 2006). Таким образом, сеть микротрубочек анизотропна, что используется клеткой для определения разных направлений транспорта органелл в цитоплазме.
Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков -механохимических АТФаз, принадлежащих к двум суперсемействам: динеинам и кинезинам. Связываясь одним концом молекулы с микротрубочкой, а другим - с переносимым грузом, кинезины, как правило, перемещают свой груз к плюс-концу микротрубочки, а динеины - к ее минус-концу (Holzbauer, Valle, 1994; Schroer, 1994; Vale, Fletterick, 1997).
В системах с хаотичной организацией микротрубочек преобладает хаотическое движение органелл, целью которого является объединение друг с другом различных клеточных компартментов. Напротив, в ситуации с радиальной системой микротрубочек доминирует направленный транспорт к центру или к периферии клетки.
Исследования последних лет показали, что многие органеллы в клетке несут на себе моторы обоих знаков, что определяет их движение по микротрубочкам как двунаправленное. Переключение активности одного из моторных белков в составе комплекса с органеллой может изменять вектор движения таких органелл; это явление лежит в основе координации различных транспортных направлений в клетке. Двунаправленный транспорт вдоль микротрубочек и участие в нем конкретных моторных белков, а также механизмы их координации наиболее четко охарактеризованы для мембранных органелл - митохондрий и меланосом - в клетках позвоночных. Однако транспорт немембранных компонентов клетки, например, рибонуклеопротеидных (мРНП) частиц, охарактеризован значительно хуже и описан, в основном, в специфических типах клеток - ооцитах и нейронах.
Традиционно микротрубочкам в организации внутриклеточного транспорта отводится роль «рельсов», вдоль которых моторные белки перевозят органеллы. Тем не менее, это представление кажется односторонним, ибо микротрубочки - не застывшие арматурные элементы, а вполне динамичные образования. Большинство микротрубочек в
клетке на плюс-концах постоянно претерпевают чередующиеся фазы роста и укорочения, что в целом делает систему микротрубочек динамичной. Таким образом, распределение органелл в клетке в каждый данный момент, по-видимому, является статистическим результатом сочетания активных перемещений органелл по микротрубочковым путям и динамики самих этих путей. Но вклад динамики микротрубочек в общую картину внутриклеточного транспорта до настоящего времени не исследовался.
Было высказано предположение о том, что динамичные микротрубочки, постоянно собираясь и разбираясь, как бы сканируют внутриклеточное пространство своими плюс-концами в поисках транспортируемых органелл (так называемая модель «поиска и захвата» (Kirschner, Mitchison, 1986)). Белки, специфически накапливающиеся на плюс-концах микротрубочек, могут временно «приклеивать» к микротрубочкам органеллы, расположенные на периферии, и тем самым способствовать началу их динеин-зависимого движения по микротрубочкам к центру клетки (Vaughan, 2004). Экспериментальные данные в пользу этой модели были получены, в основном, при наблюдении взаимодействий динамичных микротрубочек веретена деления с митотическими хромосомами (Tirnauer et al., 2002). Нарушение функций белков, локализованных на плюс-конце микротрубочки, приводило к потере контакта между микротрубочкой и кинетохором хромосомы. Это в конечном итоге служило причиной неравномерной сегрегации генетического материала в митозе (Draviam et al, 2006). Однако существование феномена «поиска и захвата» и его молекулярные механизмы в интерфазных клетках остаются практически не изученными.
Все вышеизложенное обусловило актуальность настоящего исследования и определило его цель и задачи.
Цель работы: диссертационное исследование ставило своей основной целью выяснение влияния микротрубочек и их динамики на внутриклеточный транспорт органелл в клетках с различной организацией микротрубочек в интерфазе - радиальной или хаотичной.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Изучить влияние ингибирования динамики микротрубочек на внутриклеточный транспорт меланосом в культивируемых меланофорах Xenopus laevis с радиальной системой микротрубочек.
Провести детальные видеонаблюдения за контактами плюс-концов микротрубочек с меланосомами во время активации динеин-зависимого транспорта.
Установить роль белков плюс-концов микротрубочек (ЕВ1, CLIP170, pl50G/ueuf) в «захвате» меланосом микротрубочками.
Охарактеризовать транспорт цитоплазматических мРНП стрессовых гранул и проанализировать зависимость этого процесса от микротрубочек и их динамики в культивируемых клетках HeLa с хаотичной системой микротрубочек.
Провести детальные видеонаблюдения за совместным поведением стрессовых гранул и микротрубочек в клетках.
Установить участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул.
Научная новизна и практическая значимость работы. В работе получены оригинальные, мирового уровня результаты, позволяющие выявить физиологическую роль явления динамической нестабильности микротрубочек в интерфазной клетке:
глобальная динамика плюс-концов микротрубочек является определяющим фактором в осуществлении синхронного динеин-зависимого транспорта мембранных органелл в клетках с радиальной системой микротрубочек. Показано, что когда плюс-концы растущих микротрубочек контактируют с меланосомами, то меланосомы, временно заякоренные в результате контакта, приступают к минус-концевому транспорту вдоль микротрубочки. Это первое наблюдение об использовании интерфазной клеткой механизма «поиска и захвата», некогда предложенного для объяснения способов взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками веретена деления в митозе. Кроме того, в настоящем исследовании впервые выявлено участие белков, специфически аккумулирующихся на плюс-концах микротрубочек (+TIPs), в осуществлении временных контактов между микротрубочкой и транспортируемой органеллой. Впервые продемонстрирована роль белка СЫР 170 в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом. Также, впервые показано функциональное значение ЕВ 1-зависимого привлечения СЫР 170 на плюс-конец микротрубочки.
Впервые показана ассоциация мРНП стрессовых гранул с клеточными микротрубочками. Впервые описан и охарактеризован внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и его зависимость от системы микротрубочек. Показано, что динамика микротрубочек не играет существенной роли в транспорте стрессовых гранул. Впервые продемонстрировано участие микротрубочек в процессе диссоциации стрессовых гранул.
Выяснение механизма взаимодействия микротрубочек с транспортируемыми грузами может оказаться полезным не только для понимания функций микротрубочек во внутриклеточном транспорте, но и для поиска фармакологических мишеней в патологически измененных клетках, с нарушенной функцией внутриклеточного транспорта Разработанные методические подходы к наблюдению и анализу движения меланосом и стрессовых гранул могут быть использованы для изучения внутриклеточного транспорта других органелл. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебных лекционных и практических курсах по молекулярной биологии клетки.
Апробация работы. Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном заседании ученого совета факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ и отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ 15 октября 2009 г.
Результаты работы были представлены на семинаре департамента системной биологии медицинской школы Гарвардского Университета (Бостон, США, 2009), на семинаре департамента клеточной биологии медицинской школы Университета Коннектикута (Фармингтон, США, 2009).
Материалы диссертационного исследования послужили основой для докладов на следующих конференциях:
49ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Сан-Диего, США, 2009);
Гордоновская научная конференция «Подвижные и сократимые системы» (Нью-Хэмпшир, США, 2009);
48ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Сан-Франциско, США, 2008);
Международный симпозиум «Биологическая подвижность: современные достижения и перспективы» (Пущино-на-Оке, Россия, 2008);
Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции» (Пущино-на-Оке, Россия, 2007, 2008);
IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008);
Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, Россия, 2008);
XIX Зимняя молодежная научная школа-конференция «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2007);
Летняя объединенная конференция Американского общества клеточных биологов и Европейского форума по исследованию цитоскелета (ASCB/ECF) (Дижон, Франция, 2007);
47ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Вашингтон, США, 2007).
Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 14 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа написана и оформлена по традиционному плану. Рукопись включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 73 рисунка. Список литературы включает 237 наименований.
