Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время актуальность проблемы овофолликулогенеза обусловлена высокой частотой заболеваний яичников, связанных с нарушениями процесса их развития, возникновением в репродуктивном периоде дисфункциональных состояний, возможностью бесплодия (Amsterdam A., Sasson R., 2002; Г.Т.Сухих и др. 2006 и многие другие). Накопленные данные позволяют сделать заключение, что женские половые железы относятся к наиболее динамичным системам организма, характеризующимся не только сложностью происходящих в них морфогенетических преобразований (для развивающихся фолликулов характерен целый комплекс тканей с высокой динамикой развития за очень короткий период времени), но и сложностью и многообразием механизмов регуляции их функции.
Установлено, что система регуляции фолликулогенеза представлена сложным иерархическим комплексом, включающим гипоталамо- гипофизарный и гонадный уровни. Кроме того, в регуляции развития яичников и фолликулогенеза принимают участие гормоны периферических эндокринных желез (щитовидной, надпочечников) (Алкадарская И.М. 1980; Миловидова Н.С. 1987; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 1998). Нарушение физиологического баланса гормонов и других биологически активных веществ в рассматриваемой системе неблагоприятно влияет на органогенез и гистофизиологию яичников на последовательных этапах развития.
Однако, полученные данные свидетельствуют о том, что именно внутрияичниковым, внутрифолликулярным механизмам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза, ибо они опосредуют и модулируют действие центральных и многих других механизмов регуляции (Волкова О.В. 1986; Бурлеев В.А. и др. 1998; О.В.Волкова, Т.Г.Боровая 1999; Adashi A. et al. 2000; Боярский К. Ю. 2001; Weestergaad L. et al. 2004; Erickson G. et al. 2007 и другие).
В настоящее время сохраняется пристальное внимание к локальным регуляторным механизмам. Именно им принадлежит определяющая роль в селекции фолликулов, генезе атрезии, ановуляторных состояний и бесплодия. Среди ведущих влияний этих механизмов: различия в активности рецепции фолликулами гонадотропных гормонов, разные уровни интрафолликулярного синтеза эстрадиола, неравноценное гемообеспечение фолликулярных регионов и многое другое. (Zeleznik A.J. 1981; Shipper I., Hop W. and Fauser B. 1998; Stouffer R., Dahl K. 2002 и др).
К таким местным модуляторным механизмам относятся, неспецифичекие факторы роста и многочисленные внутриклеточные белки – регуляторы процессов пролиферации и апоптоза. Наиболее яркими и информативным белками, отражающими протекающие синтетические процессы в клетках и тканях, являются белки Кi-67 и PCNA. К белкам, регулирующим процессы апоптоза, относятся белки семейства Bс1-2, р-53, каспазы. В исследованиях последних лет уделено большое внимание экспрессии этих белков и факторов элементами яичника. Наиболее широко изучается пролиферативная активность, механизмы клеточных иммунологических взаимодействий, механизмы апоптоза клеток созревающих и атрезирующихся фолликулов (Huirne J. and Lambalk C. 2001; Gougeon L. 2004; Butt A.J., Dickson K.A., Jambazov S. et al. 2005; Dragovic R.A., Ritter L.J. 2005; McNatty K.P., Fidler A.E. 2006 и другие).
С вопросом фолликулярной селекции тесно сопряжено и дальнейшее исследование систем передачи гормональных сигналов в соматических клетках фолликулярных гистионов, от состояния которых во многом зависит реализация всего комплекса регуляторных сигналов, поступающих в фолликул, включая местные пара- и аутокринные влияния. К таким вторичным мессенджерным системам относятся аденилилциклазная система, фосфатидилинозитольный механизм, принимающий участие в механизме передачи гормональных сигналов соматическим клеткам фолликулов в процессе роста и атрезии (Кулинский В.И. 1997; Волкова О.В., Боровая Т.Г. 2000; Kodaman P.H., Behrman H.R. 2005; Emmen J.M., Couse J.F. 2008 и др).
Цель и задачи исследования
Получить новую информацию о структурно-цитохимической организации фолликулов яичников и их тканевого микроокружения. Выявить внутриклеточные белки и факторы роста в различных структурах яичников и проследить динамику этих химических соединенеий на этапах позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.
Для этих целей использовать комплексный морфологический, иммуногистохимический анализ структур яичников:
1. Провести исследование спектра белков, участвующих в процессах пролиферации и регуляции апоптоза в указанных структурах (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9).
2. Исследовать распределение неспецифических факторов роста (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) и оценить их роль в процессе овофолликулогенеза и лютеогенеза.
3. Исследовать состояние внутри- и парафолликулярного матрикса на примере системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2.
4. Исследовать состояние гормонтрансдукторных систем соматических клеток фолликулов (на примере анализа содержания универсальных мессенджерных соединений – -субъединиц G-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-).
5. Сопоставить активность и количественное распределение исследуемых соединений в структурах фолликулов и их микроокружения, временные параметры их взаимодействия в течение процесса позитивного и атретического овофолликулогенеза, развития желтых тел.
Научная новизна
В настоящей работе впервые проведено комплексное, многогранное изучение распределения химических соединений, выполняющих пара- и аутокринное влияние в обеспечении жизнедеятельности структур яичников: 1)белков клеточной пролиферации и апоптоза (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9), 2)универсальных ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1), 3)системы матриксных металлопротеиназ-1,9 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ-1,2, 4)гормонтрансдукторной системы ( -субъединиц G-белков, аденилилциклазы, фосфолипазы С-). Оценены распределение и закономерности синтеза этих соединений в половых клетках, фолликулярном эпителии, клетках желтых тел, в структурах парафолликулярных регионов (в текальных оболочках, интерстиции и кровеносных сосудах) на этапах позитивного и атретического развития фолликулов и желтых тел.
Получены свидетельства о том, что регуляция жизнедеятельности яичников осуществляется не одним специфическим фактором, а экспрессией различных химических соединений, присутствующих в структурных компонентах яичника одновременно и меняющихся в количественном отношении в течении фолликулогенеза. Сочетание комплекса этих факторов обеспечивает адекватную реализацию функционального эффекта в каждый период овофолликуло- и лютеогенеза.
Кроме качественной оценки интенсивности иммуногистохимических реакций нами впервые был проведен сравнительный количественный анализ функциональной активности структур фолликулов и их регионов методом компьютерной морфоденситометрии (КМДМ).
Теоретическая и практическая значимость работы.
Исследование носит экспериментальный характер, направлено на изучение закономерностей овофолликулогенеза и лютеогенеза, оценки механизмов регуляции этих процессов (в частности пара- и аутокринных).
С использованием метода иммуногистохимии получена новая информация о наличии, взаимодействии и динамических преобразованиях важнейших внутриорганных белков (белки PCNA, Ki-67, Bcl-2, p-53, каспаза-9) и ростовых факторов (васкулярного эндотелиального, эпидермального, инсулиноподобного фактора роста-1) в структурах фолликулов (овоцит, фолликулярные клетки), желтых тел и окружающей их гормонпродуцирующей интерстициальной ткани на всех этапах их позитивного и атретического развития. Особенности структуры яичника позволили одновременно визуализировать на серийных срезах исследуемые белки на этапах роста и атрезии фолликулов и желтых тел.
При подробном анализе фолликулогенеза были уточнены наиболее ответственные (круциальные) процессы в химической организации структур яичников, необходимые для поддержания жизнеспособности овоцитов, сохранения блока мейоза, подготовки к овуляции, образованию гормонопродуцирующих желтых тел и атретических фолликулов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Выявлен комплекс факторов - химических соединений, взаимодействие которых обуславливает оптимальность течения процессов роста и атрезии фолликулов и развития желтых тел. Этим местным внутрияичниковым регуляторным факторам принадлежит ключевая роль в физиологическом течении фолликулогенеза и лютеогенеза (они опосредуют и модулируют действия центральных нервных и гуморальных механизмов).
2. Важнейшими компонентами этих химических соединений в овоцитах, фолликулярном эпителии, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани, в желтых телах на всех этапах позитивного роста и атрезии являются:
а) группа внутриклеточных белков (PCNA, Ki-67), ответственных за пролиферацию и дифференцировку, индукцию митотической активности;
б) группа внутриклеточных белков (Всl-2, р-53, каспаза-9), осуществляющих контроль за процессами апоптоза в указанных элементах яичника. Интенсивность их экспресси варьирует на этапах фолликулогенеза.
3. Универсальные ростовые факторы (инсулиноподобный-1, васкулярный эндотелиальный, эпидермальный) – перманентные компоненты химической организации овоцитов, фолликулярного эпителия, гормонопродуцирующей интерстициальной ткани и желтых тел яичника. Интенсивность их экспрессии неоднозначна на различных этапах овофолликулогенеза, лютеогенеза и атретических процессов.
4. Выявлена экспрессия матриксных металлопротеиназ (1,9) и их тканевых ингибиторов (1,2) структурами фолликулов, желтых тел и парафолликулярного окружения. Спектр этих соединений меняется в соответствии со стадией развития фолликулов и желтых тел на этапах позитивного и атретического процесса, что свидетельствует об их значении, как региональных механизмов в реаранжировке тканевых структур яичников, обеспечивающих оптимальные условия роста фолликулов и желтых тел.
5. Выявлена закономерность в интенсивности экспрессии компонентов гормонотрансдукторной системы фолликулярного эпителия в процессе развития и созревания фолликулов.
Внедрение в практику. Полученные данные найдут применение в курсах обучения студентов гистологии, эмбриологии, эндокринологии, работе научно-исследовательских лабораторий по репродукции и в клинической практике для разработки новых подходов в оценке гипопластических и дисфункциональных состояний яичников.
Апробация работы. Основные результаты исследования были доложены на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Всероссийской научной конференции «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2006); Всероссийском конгрессе гистологов и морфологов (Москва, 2006); на съезде Всероссийского научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов (Казань, 2007); совместной научной конференции кафедр гистологии, цитологии, эмбриологии лечебного и педиатрического факультетов РГМУ.
Публикации. Результаты исследования отражены в одиннадцати печатных работах.
Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 192 источника отечественных и зарубежных авторов. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и иллюстрированы микрофотографиями, графиками, таблицами.
