Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 10
1. Активация яйца 10
1.1. Возможные способы активации яйца рыб 11
1.2. Спонтанная активация яйца рыб . 12
1.3. Искусственная активация яйца рыб 14
1.4. Активация яйца при гиногенезе у рыб 15
2. Сохранение яйцом способности к оплодотворению в разных условиях 16
2.1. Происхождение полостной жидкости у рыб 18
2.2. Состав полостной жидкости у рыб 19
2.3. Функции полостной жидкости у рыб 20
2.4. Изучение влияния ингибиторов протеаз на процесс активации и оплодотворения 21
3. Особенности организации кортикального слоя зрелого яйца рыб .. 26
3.1. Строение неоплодотворенного яйца медаки 26
3.2. Строение неоплодотворенного яйца данио 27
3.3. Кортикальные гранулы рыб 28
3.3.1. Строение и состав кортикальных гранул рыб 29
3.3.2. Образование кортикальных гранул в ооцитах рыб 31
4. Общие закономерности экзоцитоза кортикальных гранул в яйце 31
4.1. Экзоцитоз кортикальных гранул у осетровых рыб 33
4.2. Особенности экзоцитоза кортикальных гранул у костистых рыб 34
5. Роль экзоцитоза кортикальных гранул в блокировании полиспермии 36
5.1. Полиспермия как следствие замедления и подавления экзоцитоза кортикальных гранул 38
6. Роль подмембранного цитоскелета яйца в экзоцитозе кортикальных гранул 39
7. Участие ионов кальция в процессе активации яйца 40
7.1. Источники ионов кальция и механизмы его высвобождения 41
7.2. Са - зависимые сигнальные процессы активации яйца 42
7.3. Особенности распространения волны кальция на примере костистых рыб: медаки (Oryzias latipes) и данио (Brachydanio rerio) 43
7.3.1. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце медаки 44
7.3.2. Изменение концентрации свободных ионов кальция в яйце данио 44
8. Участие ионов кальция в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул 47
8.1. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул у рыб 48
9. Влияние форболовых эфиров на экзоцитоз кортикальных гранул ... 51
10. Кальцийсвязывающие белки 54
10.1. EF-hand белки 54
10.1.1. Кальмодулин 55
10.1.2. S-100 белки 55
10.2. Аннексины 55
10.3. С2 — кальцийсвязывающие белки 58
Глава II. Материалы и методы 59
1. Объекты исследований. Способы получения половых продуктов.. 59
2. Выделение и очистка смеси аннексинов из зрелых яиц вьюна 60
3. Выделение и очистка аннексинов из зрелых яиц данио 61
4. Масс-спектрометрический анализ белков, выделенных из ооцитов данио 61
5. Иммунизация лабораторных животных 61
6. Выделение и очистка поликлональных антител к белку 31кДа 62
7. Иммунологический анализ материала яиц вьюна и данио 64
8. Иммунологический анализ образцов различных тканей вьюна 64
9. Получение Зл- концевой нуклеотидной последовательности аннексинаЗІ кДа 64
10. Определение размеров мРНК аннексина 31 кДа данио 65
11. Получение 5"-концевой нуклеотидной последовательности аннексинаЗІ кДа данио 65
12. Получение 5" -концевых последовательностей кДНК аннексинов А13.1,А13.2иАЗ данио 66
13. Получение полноразмерньгх кДНК аннексинов А13.1 и А13і2 67
14. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2 68 .
15. Микроинъекции 69'
16. Световая и электронная микроскопия 70
17. Определение количества актина в яйце вьюна 70
Глава III. Результаты 71
1. Влияние ионов кальция и фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна 71
1.1. Строение кортикального слоя яйца вьюна и экзоцитоз кортикальных гранул 71
1.2. Влияние ионов кальция на экзоцитоз кортикальных гранул в яйцах вьюна 76
1.3. Влияние фаллоидина на экзоцитоз кортикальных гранул 78
2. Влияние сред различного состава на спонтанную активацию яйца вьюна и данио 82
2.1. Изучение влияния сред разного состава на процесс спонтанной активации икры вьюна и данио 83
2.2. Влияние лейпептина и апротинина- ингибиторов протеаз на спонтанную активацию яиц вьюна и данио и на их последующую способность к оплодотворению 84
2.3. Влияние форболовых эфиров на активацию яиц вьюна и данио 89
3. Идентификация кальцийсвязьівающих белков, присутствующих в
ооцитах данио и яйцеклетках вьюна 91
3.1. Выделение белков группы аннексинов из яиц рыб 91
3.2. Получение моноспецифических поликлональных антител к белку 31 кДа вьюна 93
3.3 Исследование распределения белка ЗІкДа в разных тканях вьюна 96
3.4. Получение и анализ кДНК, содержащей полноразмерную кодирующую последовательность белка с молекулярной массой 31 кДа данио 97
3.5. Идентификация аннексинов, выделенных из ооцитов данио. 102
3.6. Идентификация в ооцитах данио копина Ш 107
3.7. мРНК аннексинов, запасенные в ооцитах данио 108
3.8. Получение и выделение рекомбинантного белка аннексина А13.2 113
Обсуждение 114
Заключение 126
Выводы 128
Список сокращений 129
Благодарности 130
Список литературы
- Спонтанная активация яйца рыб
- Функции полостной жидкости у рыб
- Строение и состав кортикальных гранул рыб
- Особенности экзоцитоза кортикальных гранул у костистых рыб
Введение к работе
Актуальность темы.
Для рыб характерно внешнее осеменение, при котором половые клетки выводятся в водную среду, где и происходит их слияние. Если осеменение не произошло, в неоплодотворенном яйце начинаются некоторые изменения, аналогичные происходдщим при нормальном развитии, в частности повышение в цитоплазме концентрации свободных ионов кальция, экзоцитоз кортикальных гранул, образование оболочки оплодотворения. Для обозначения этого явления в литературе используются термины «спонтанная активация», «автоактивация». Природа включения спонтанной активации яйца рыб, равно как и активации при оплодотворении, остается неясной.
Изучение спонтанной активации имеет важное значение при решении некоторых проблем рыборазведения: Искусственное разведение рыб предполагает в качестве одной из задач разработку методов получения* зрелых половых, продуктов и проведение искусственного оплодотворения. Проблема сохранения у яйца способности к оплодотворению осложнена тем, что при попадании в водную среду икра рыб спонтанно активируется и теряет эту способность. В связи с этим особенно актуальным представляется изучение природы сигналов активации, а также возможности (механизмов) их ингибирования.
Разнообразные сигнальные процессы, приводящие к активации яйцеклетки, в настоящее время широко исследуются с использованием современных методов молекулярной и клеточной биологии. Главное внимание в этих работах уделяется сигнальной роли ионов кальция при активации. Повышение концентрации ионов кальция в яйце при активации может указывать на их роль в регуляции экзоцитоза кортикальных гранул, как одного из типов секреции.
Однако существует Са -независимая секреция. Например, секреция в тромбоцитах под действием эндогенного диацилглицерина или его
искусственных аналогов форболовых эфиров может происходить^ и без изменения концентрации внутриклеточного кальция: Возможно, что секреторный ответ в этом случае обеспечивается за счет стимуляции протеинкиназы С. Участие форболовых эфиров в процессе активации яйцеклетки показано для разных видов животных. О возможном существовании более чем одного механизма регуляции экзоцитоза в яйцеклетке свидетельствуют экспериментальные данные многих работ. Электронно-микроскопические исследования показывают, что популяция кортикальных-гранул неоднородна по строению, размеру и распределению в кортикальном слое яйца. Разные типы гранул имеют различную чувствительность к веществам^ вызывающим; искусственную активацию яйцеклеток. Для; некоторых видов? рыб отмечено^ что при активации кальциевая волна ни по времени, ни пространственно не совпадает с экзоцитозом кортикальных гранул. Все это делает актуальным изучение возможной- роли диацилглицеринового? сигнального пути в активации яйца рыб:
Единым механизмом реализации кальциевого сигнала- в клетке является* связывание ионов кальция при повышении их концентрации с белками. Изучение состава и свойств кальцийсвязьшающих белков, присутствующих в яйцеклетке и обеспечивающих кальциевую сигнализацию, позволит расширить -представление о молекулярных механизмах, обеспечивающих протекание процесса активации у рыб:
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей диссертационной работы было изучение клеточных и
молекулярных механизмов активации яйца; которая^ определяет начало
включения программы развития. Исследовались три стороны, определяющие
протекание этого процесса: Во-первьщ изучались механизмы процессов-
предотвращающих активацию. Во-вторых, сигнальные процессы; приводящие к;
активации яйца, а также компоненты, яйцеклетки, обеспечивающие ее
реализацию. '
Были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать роль подмембранного актинового цитоскелета в процессе
спонтанной активации, в частности в экзоцитозе кортикальных гранул.
2. Исследовать влияние форболовых эфиров на процесс образования
оболочки оплодотворения у двух карповых рыб: вьюна (Misgiirnus fossilis) и
данио {Brachydanio rerio).
3. Исследовать влияние состава среды инкубации на активацию
яйцеклеток вьюна {Misgurnus fossilis) и данио {Brachydanio rerio), а также
влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению у
яйцеклеток данных видов рыб.
Исследовать влияние искусственного изменения концентрации ионов кальция на процесс формирования оболочки оплодотворения у вьюна.
Идентифицировать кальцийсвязывающие белки, присутствующие в ооцитах данио.
Научная новизна работы.
В работе впервые* показано влияние ингибиторов протеаз на сохранение способности к оплодотворению яиц костистых рыб вьюна и данио.
Впервые показано активирующее действие форболовых эфиров на процесс формирования оболочки оплодотворения у яйцеклеток рыб.
Был разработан микрометод выделения кальцийсвязывающих белков. Протеомный анализ выделенной смеси с использованием масс-спектрометрии позволил впервые идентифицировать в виде запасенных белков ооцита данио аннексины А5, А13.1, Ala, А2а и копии Ш, содержащий С2-кальцийсвязывающий домен.
Научная и практическая значимость работы
Выявлены новые компоненты сигнальных путей процесса активации у рыб. Показано, что форболовые эфиры - искусственные активаторы протеинкиназы С, оказывают активирующее действие на яйцо рыб в сигнальном каскаде на более поздних этапах, чем действие протеаз. Изучена
роль актинового цитоскелета яйца в экзоцитозе кортикальных гранул при активации. Полученные данные вносят вклад в изучение фундаментальной проблемы биологии развития - механизма активации яйцеклетки.
Обнаружено, что процесс спонтанной активации подавляется ингибиторами протеаз. Это открывает новые возможность для» разработки искусственных сред, позволяющих продолжительное время сохранять икру рыб, способную к оплодотворению. Этот результат имеет большую потенциальную значимость для развития аквакультуры.
Работа полностью выполнена в Институте биологии развития* им. Н.К. Кольцова РАН, поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты. № 93-04-07372-а; 98-04-48247-а; 01-04-48943-а; 05-04-48975-а).
Публикация результатов исследования и апробация работы.
Материалы^ диссертации докладывались на коллоквиумах лаборатории экспериментальной эмбриологии Института биологии развития' им. Н.К. Кольцова РАН; на конференции «Молекулярные механизмы^ процессов онтогенеза» (Москва, 2001 г.); на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 2004 г.; на конференции «Молекулярные механизмы онтогенеза: эмбриогенез, геномы, эволюция» (Москва, 2006 г.).
По материалам диссертации опубликовано четыре статьи, все в рецензируемых журналах и тезисы двух докладов.
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы и список цитированной литературы.
Работа проводилась в лаборатории экспериментальной эмбриологии, им. Д.П. Филатова Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Научное руководство осуществлял к.б.н. А. А. Минин.
Спонтанная активация яйца рыб
Активация зрелой яйцеклетки у позвоночных животных в норме обычно запускается спермием (Runft et al., 2002; Horner, Wolfher, 2008). Рыбььявляются самым многочисленным классом позвоночных, отличающимся большим разнообразием в строении гамет и условий их соединения, поэтому способы активации у них по сравнению с другими животными более разнообразны.
Размножение и развитие рыб имеет ряд специфических особенностей, обусловленных водным образом жизни. У большинства рыб осеменение наружное, при этом половые клетки выводятся в воду, где происходит оплодотворение и дальнейшее развитие зародыша.
Зрелое яйцо рыб может активироваться спермием в процессе оплодотворения. Этот способ активации показан у таких рыб, как медака (Oryzias latipes), кета (Oncorhynchus keta), восточная сельдь (Clupea pallasi) (Iwamatsu, 1992) и нильская тиляпия (Oreochromis niloticus) (Myers, Hershberger, 1991). При таком способе активации оплодотворяющий спермий выполняет две функции - генетическую и активационную.
Известно, что у многих рыб при попадании в воду яйцо спонтанно активируется. В ряде работ последних лет, проведенных на данио, этот процесс был изучен более подробно. Было показано, что при наличии в нерестовой среде спермиев, яйцо данио может быть оплодотворено не позднее, чем через ЗО секунд после контакта с водой (Hart, Fluck, 1995; Hart, Yu, 1980; Lee et al., 1999; Sakaietal., 1997).
В отсутствии спермия, в спонтанно активированном яйце- происходят некоторые процессы, характерные для раннего развития, в частности подъем концентрации ионов кальция и экзоцитоз кортикальных гранул, однако очень быстро наступает гибель активированного гаплоидного яйца. Если оплодотворение произошло, и диплоидность восстановилась, развитие зародыша происходит нормально. По мнению авторов исследования, при естественном нересте данио сначала происходит активация яйца, далее за время менее 30 с, а скорее всего - за 5-10 с, следует оплодотворение спермием (Lee et al., 1999). В данном случае, активирующим агентом является среда оплодотворения, роль спермия же ограничивается доставкой генетического материала.
Стратегия активация/оплодотворение, описанная! выше для данио, по-видимому, не является уникальной. В литературе имеются указания на то, что аналогичным образом процесс происходит и у некоторых других видов рыб, например, у золотой рыбки {Carassias auratus) и малоротой корюшки (Hypomesus olidus) (Lee et al., 1999).
Более сложный вариант активации/оплодотворения реализуется у морского бычка Hemitripterus villosus (Pallas), у которого . осеменение происходит внутри тела самки. Спермий по микропилярному каналу лишь достигает кортикального слоя яйца. На этом процесс оплодотворения тормозится и завершается после попадания яйца с покоящимся внутри микропилярного канала спермием в воду (Mimehara et al., 1997).
Яйца рыб могут активироваться без участия спермия, в результате действия различных активирующих агентов. У многих видов рыб с наружным осеменением яйцо, попав в воду, активируется и начинает развиваться партеногенетически. В литературе для описания этого явление используются термины - автоактивация, спонтанная активация. Б.Л. Астауров при изучении данного явления у осетровых рыб предложил использовать термин «зачаточный партеногенез», подчеркивая тем самым, что развитие активированного яйца ограничивается только начальными стадиями эмбриогенеза (Астауров, 1951). Прижизненные наблюдения за яйцами севрюги, помещенными в воду, показали, что партеногенетически развивающиеся яйца ведут себя подобно оплодотворенным: отслаивают правильно структурированную оболочку, образуют центральное скопление пигмента, приклеиваются и поворачиваются внутри оболочки. Дробление этих яиц может вообще не наступать, а если и наступает, то носит довольно хаотичный характер и идет примерно вдвое медленнее, чем у "оплодотворенных. Распределение материала по бластомерам неравномерное и их деление асинхронное. Наблюдения, проведенные Астауровым, показали, что стадия, далее которой партеногенетическое развитие никогда не идет, соответствует приблизительно моруле. В дальнейшем такой партеногенетически развивающийся зародыш погибает.
Сходные морфологические изменения происходят и у спонтанно активированных яиц данио и фундулюса. При попадании яйца данио в воду у него наблюдается образование оболочіси оплодотворения, аномальная сегрегация и неправильное дробление, а в дальнейшем -получившийся из неоплодотворенного яйца гаплоидный зародыш погибает. (Hart, Fluck, 1995; Sakai et al., 1997). Развитие спонтанно активированного яйца фундулюса не идет дальше одноклеточной стадии (Bush, Weis, 1983).
Функции полостной жидкости у рыб
Изучение участия протеаз в процессах активации и оплодотворения имеет давнюю истории. Интерес к этой проблеме сохраняется до настоящего времени. Ранние работы в основном были посвящены изучению различных аспектов акросомной реакции: выделению содержимого акросомы и исследованию действия этого содержимого на яйцо в процессе оплодотворения. В целом ряде таких работ, проведенных как на позвоночных, так и на беспозвоночных животных, было показано, что в акросомном пузырьке среди других белков содержатся различные протеазы. Считается, что они служат для разрушения яйцевых оболочек и прокладывают путь спермию через эти оболочки к поверхности яйца, а также участвуют в активации яйца (Gould et al., 1986; Gould, Stephano, 1987, 1991; Carroll, Jarre, 1995). В одной из таких работ было показано, что воздействие на яйца ксенопуса, у которых были удалены оболочки, специально очищенной протеазы из спермиев тритона приводило к изменению мембранного потенциала, сокращению кортекса, экзоцитозу кортикальных гранул и формированию женского пронуклеуса. В этой же работе было показано, что оплодотворение яиц ксенопуса в присутствии ингибитора протеаз вызывает подавление процесса оплодотворения (Mizote et al., 1999).
О специфическом влиянии ингибиторов протеаз на процесс оплодотворения сообщалось также в недавней работе польских исследователей (Dabrowski et al.-, 2004). Влияние ингибиторов трипсина: 4-acetamidophenyl, tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLCK), 4-guanidinobenzoate (AGB) и химотрипсина: хемостатина, Nosyl-L-phenylalanine chloromethyl keton (TPCK) на процесс оплодотворения исследовали у морской миноги (Petromyzon marinus L.). В первом варианте опыта яйца миноги оплодотворяли непосредственно в присутствии ингибиторов. При этом было показано, что все перечисленные ингибиторы снижали процент развивающихся яиц (подсчет развивающихся зародышей производили на стадии 2-х бластомеров) по сравнению с контролем. Во втором варианте опыта неоплодотворенные яйца сначала преинкубировали в среде с добавлением ТРСК либо TLCK, затем яйца переносили в среду без ингибиторов и там оплодотворяли. Преинкубация яиц с ТРСК, в два раза снижала процент оплодотворенных и развивающихся яиц, в то время как TLCK не оказывал никакого влияния на процент развивающихся яиц. Такую же процедуру проделывали и со спермием перед оплодотворением интактных яиц.
Результаты опыта со спермием оказались прямо противоположными результатам с яйцом. Это позволило авторам работы говорить о наличии у неоплодотворенного яйца миноги химотрипсин - подобной, а у спермия трипсин - подобной активности, вовлеченной в процесс оплодотворения.
У костистых рыб спермин не содержат акросомы, кроме того, в оболочке яйца у них имеется микропиле, поэтому круг проблем, обсуждаемый в предыдущих работах для костистых рыб не так актуален, что, однако, не снимает вопроса участия протеаз в процессе оплодотворения. Для костистых рыб существует проблема сохранения половыми клетками способности к оплодотворению, поскольку у большинства из них не только яйцо, но и спермий при попадании в воду в течение очень короткого .времени ее теряет. Как было отмечено раньше, полостная жидкость оказывает на яйцо защитное действие. Семенная жидкость также способна поддерживать спермин в неактивном состоянии. В ряде работ было показано существование природных ингибиторов протеаз в семенной и полостной жидкостях (Ciereszko et al., 1998; Knoll-Gellida et al., 2006). Работы, выполненные на рыбах, базируются на этих данных и посвящены, в основном, изучению способности ингибиторов протеаз поддерживать у яиц рыб способность к оплодотворению. Результаты исследований зачастую неоднозначны и противоречивы.
Свойство ингибиторов протеаз in vitro предотвращать отделение оболочки оплодотворения и сохранять способность яйца к оплодотворению изучалось на примере золотой рыбки (Carassius auratus). В работе было показано, что ингибиторы сериновых протеаз - бензамидин и соевый ингибитор, предотвращают отделение оболочки оплодотворения у -яиц золотой рыбки, находящихся в растворе Рингера. Яйца золотой рыбки в присутствии ингибиторов сохраняли способность к оплодотворению в течение 30 минут, тогда как в солевой среде без ингибиторов яйца теряли эту способность значительно быстрее. Однако яйца, помещенные в воду, теряли способность к оплодотворению даже в присутствии ингибиторов. В воде у яиц золотой рыбки эта способность сохраняется меньше 1 минуты (Hsu, Goetz, 1993).
Продолжая исследования, начатые на золотой рыбке, Гетц с сотрудниками (Goetz, Cofrman, 2000) исследовал влияние соевого ингибитора на сохранение способности к оплодотворению у форели. Однако полученные результаты противоречили данным, полученным на золотой рыбке. Неоплодотворенные яйца форели в течение 24 часов инкубировали в полостной жидкости, а также в солевом растворе Кортланда без и в присутствии соевого ингибитора, а затем оплодотворяли. О действии ингибитора судили по количеству зародышей, доживших до поздних стадий развития. Результаты опыта были неожиданными» Так, если у контрольных яиц, инкубированных в полостной жидкости и растворе Кортланда без ингибитора, процент вылупившихся личинок составлял соответственно 60% и 50%, то у яиц, инкубированных в присутствии ингибитора, он составлял всего несколько процентов. При этом оплодотворение яиц в присутствии ингибитора без предварительной инкубации никак не сказалось на количестве вылупившихся личинок. Авторы делают вывод, что действие соевого ингибитора является видоспецифичным и при длительном воздействии может отрицательно влиять на жизнеспособность яиц.
Строение и состав кортикальных гранул рыб
Кальций является одним из универсальных регуляторов многочисленных процессов, происходящих в клетке. Существуют специальные транспортные системы, обеспечивающие поддержание низкой концентрации ионов кальция в цитоплазме. Внутри- и внеклеточные сигналы могут приводить к кратковременному повышению концентрации кальция в цитоплазме клетки. Единым механизмом действия ионов кальция является связывание их с белками, которое сопровождается изменением пространственной ориентации определенных групп белка и приводит к изменению его свойств. В зависимости от концентрации кальция, кальциисвязывающие белки по-разному связываются, со своими белками мишенями и регулируют их активность. Существует несколько классов кальцийсвязывающих белков, которые отличаются друг от друга, прежде всего, строением кальцийсвязывающего центра.
Участок связывания кальция у белков данного семейства имеет структуру петли, состоящей из 12 аминокислотных остатков. Слева и справа (т.е. cN-иС-концов) такая петля ограничена 12-14-членными а-спиралями полипептидной цепи. Таким образом, структура кальцийсвязывающего центра у данной группы белков имеет вид спираль - петля - спираль и каждый элемент состоит из 12 аминокислотных остатков (Kretsinger, 1980).
В настоящее время описаны кальцийсвязывающие белки, содержащие в своей структуре от двух до шести центров связывания кальция.
Кальмодулин, один из наиболее подробно изученных Са -связывающих белков, широко распространен и встречается в клетках животных, растений и грибов. Он содержит в своем составе четыре кальцийсвязывающих центра. Широкая распространенность обусловлена, вероятно, тем, что кальмодулин способен регулировать большое количество (более 30 описанных к настоящему времени) различных процессов, происходящих в клетке. Кальмодулин - белок, способный кальцийзависимым образом модулировать (регулировать) активность других белков (Kretsinger, 1992; Crivici, Ikura, 1995).
К EF-hand белкам относятся белки семейства S-100, представляющие собой димеры, содержащие две одинаковые или две разные полипептидные цепи, каждая их которых содержит по два участка связывания кальция. Функции белков данного семейства многообразны, как и его представители. S-100 белки принимают участие в разборке и сборке элементов цитоскелета, а также в процессах экзо- и эндоцитоза (Bianchi et al., 1992; Schafer, Heizmann, 1996).
EF-hand белки, присутствующие в яйцеклетках рыб, изучены недостаточно. Ранее в нашей лаборатории из яиц вьюна были выделены и охарактеризованы кальмодулин и белок типа S-100A (Ivanenkov et al., 1993).
Аннексины - особая группа кальцийсвязывающих белков. Аннексины были открыты около 30 лет назад. Свое название - аннексины (от греч. Annex -связывать, удерживать вместе) белки данного семейства получили в 1999 году. Первым аннексином, который был выделен и очищен, стал человеческий аннексии А7 (Creutz et al., 1978).
Общим свойством аннексинов является их способность связываться обратимым и регулируемым образом с кислыми фосфолипидами в присутствии ионов кальция. Это их свойство было продемонстрировано in vitro, но, вероятно, присуще аннексинам и в живых клетках (Ernst, 1991; Gerke, 1991; Selbert et al., 1995; Barwise, Walker, 1996; Chasserot et al., 1996).
По принятой в настоящее время классификации различают пять типов аннексинов (А, В, С, D, Е), которые встречаются у различных групп организмов - от простейших и грибов до растений и высших позвоночных животных. Аннексины позвоночных животных относятся к типу А и подразделяются на двенадцать групп (ANX1 - ANX13, исключая ANX12) (Moss, Morgan 2004).
В клетке они могут находиться: в цитоплазме в свободном виде, либо быть ассоциированными с цитоплазматической мембраной, а также с различными мембранными структурами (клеточным ядром, мембранами эндоцитозных гранул, эндоплазматическим ретикулумом).
Аннексины имеют характерную первичную структуру. Они состоят из двух доменов: корового (С-домена) и N-концевого домена (Liemann, Huber, 1997). Коровый домен является консервативным доменом, в нем присутствуют четыре так называемых аннексиновых повтора длинной около 70 аминокислотных остатков, каждый из которых образует пять а-спиралей (Moss, Morgan, 2004). Исключение составляет аннексии Аб, который имеет два коровых домена и соответственно восемь повторов. В пространстве коровый домен имеет трехмерную структуру, напоминающую диск. Выпуклая сторона1 диска обращена к, мембране, здесь находятся центры связывания ионов кальция
Особенности экзоцитоза кортикальных гранул у костистых рыб
Для этого в качестве модельного объекта нами была. использована икра вьюна (Plisgurnus fossilis). Вьюн является удобным лабораторным объектом для подобных исследований по нескольким причинам. Важной особенностью является простота искусственного получения зрелой неоплодотворенной икры. Яйца вьюна достаточно долго сохраняют способность к оплодотворению и дальнейшему нормальному развитию. Любые манипуляции с ними, включая микроинъекции, можно проводить при комнатной температуре, при этом яйца достаточно крупные и их удобно наблюдать даже при небольшом увеличении под бинокулярной лупой прижизненно и без фиксации. В своей работе мы использовали также особенность яиц вьюна активироваться в воде в отсутствии спермия. Этот процесс носит название спонтанной активации.
Кортикальный (поверхностный) слой цитоплазмы -яйца по своему строению различается у разных видов рыб, что сказывается на особенностях протекания кортикальной реакции при оплодотворении и активации (Гинзбург, 1968). Структура кортикального слоя и кортикальных гранул яйца вьюна ранее не были описаны, поэтому нами была поставлена -задача изучить микроструктуру кортикального слоя неактивированного яйца вьюна и ее изменения; происходящие при активации яйца в воде. Исследования проводили используя методы световой и электронной микроскопии.
На рисунке 1 представлено неактивированное яйцо вьюна, находящееся в полостной жидкости, а тоже яйцо через 10 минут инкубации в воде. Неактивированное яйцо вьюна достигает 1,2 мм в диаметре, одето двумя оболочками: внутренней, хорошо развитой zona radiata (в англоязычной литературе ее часто называют - хорион), толщина которой составляет примерно 4 мкм (рис. ЗА) и примыкающей к ней наружной оболочки ворсинчатого строения. Оболочки плотно примыкают к плазматической мембране яйца, и создается впечатление, что они находятся в тесном контакте (рис. 1А). Однако, при высоком увеличении; можно видеть узкое щелевидное пространство около 0;4 мкм толщиной между внутренней поверхностью .-zona radiata и плазматической мембраной яйца - перивителлиновое пространство, в котором находятся микроворсинки, отходящие от поверхности яйца. (рис. ЗА, В).
В периферическом, свободном от желточных гранул слое цитоплазмы зрелых неактивированных яиц вьюна содержаться особые секреторные органеллы - кортикальные гранулы, которые представляют собой пузырьки округлой или овальной формы, от 4 до 25 мкм диаметром, окруженные мембраной. Кортикальные гранулы располагаются в.один ряд, причем гранулы, разного размера распределены случайным образом. При. этом в области анимального полюса присутствуют лишь единичные гранулы мелкого размера (рис. 2А).
На ультратонких срезах видно, что кортикальные гранулы, митохондрии и частицы диаметром 25-30 нм (по-видимому, рибосомы) отделены от плазматической мембраны яйца слоем фибриллярного материала толщиной 0,05-0,15 мкм (рис. ЗА, В), так называемым подмембранным цитоскелетом, который, как было показано ранее в нашей лаборатории, представляет собой сеть актиновых микрофиламентов (Ivanenkov et al., 1987).
При помещении неактивированного яйца в воду происходит спонтанная активация яйца. В процессе активации начинается кортикальная реакция, в ходе которой происходит экзоцитоз кортикальных гранул - слияние мембраны кортикальных гранул с цитоплазматической мембраной яйца. При этом содержимое гранул выделяется под оболочку яйца и обводняется, что приводит к расширению зачаточного перивителлинового пространства. Это пространство при малом увеличении выглядит как прозрачная зона (рис. 1В), отделяющая яйцевую оболочку от поверхности плазматической мембраны на значительное расстояние. На полутонких срезах яиц, инкубированных 10 минут в воде, в периферическом слое цитоплазмы кортикальные гранулы отсутствуют (рис. 2В). Толщина слоя актиновых микрофиламентов составляет 0,15-0,3 мкм (рис. ЗЕ, F), что в несколько раз превышает толщину этого слоя в неактивированных яйцах. За счет увеличения перивителлинового пространства, а также в результате набухания самого яйца, размеры активированного яйца увеличиваются до 1,7 мм в диаметре (рис. 1В).
