Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Костный мозг как источник клеток-предшественников неоваскулогенеза 11
1.2 Особенности эмбриогенеза сосудистой системы 17
1.2.1 Эндотелиальные клетки во время эмбрионального развития 17
1.2.2 Формирование первичного капиллярного сплетения 20
1.2.3 Ремоделирование капиллярного сплетения в артерии и вены 21
1.2.4 Молекулярные маркеры эндотелиальных клеток 22
1.3 Формирование сосудов и ангиогенные факторы 24
1.3.1 Модель формирования сосудов 24
1.3.2 Вазо-эндотелиальные факторы роста - их разновидности и рецепторы ' 25 1.3.3.PeryjMin«[VEGF , 28
1.3.4 Ангиопоэтины и их Tie-рецепторы 30
1.3.5 Angl и стабилизация клеточной стенки 31
1.3.6 Ang2: агонист или антагонист? 33
1.4 Лектины 35
1.5 Резюме 36
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования
2.1 Общая структура эксперимента 38
2.2 Характеристика материала 38
2.3 Моделирование хронической ишемической болезни сердца 39
2.4 Получение мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга и разделение ее на фракции 41
2.5 Морфологическое исследование образцов. 43
2.6 Иммуногистохимические и иммуноцитохимические методы исследования 44
2.7 Молекулярные методы исследования 45
2.8 Проточная цитофлюориметрия 49
2.9 Исследование фракций МНК КМ после культивирования
в средах направленной клеточной дифференцировки 49
2.10 Оценка перфузии миокарда с использованием 99шТс 50
2.11 Статистические методы исследования 50
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца 51
3.2 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга 53
3.3 Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации неприлипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга в лазерные каналы 59
3.4 Морфометрический анализ миокарда при проведении реваскуляризации 63
3.5 Проточный цитофлюориметрический анализ популяций клеток 63
3.6 Оценка уровня экспрессии генов-маркеров хондро-остеогенеза 66
3.7 Оценка уровня экспрессии генов вазо-эндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга 70
3.8 Исследование уровня экспрессии мРНК генов VEGF-A
и SDF в ишемизированном миокарде и зонах реваскуляризации 71
3.9 Иммуноцитологическое исследование клеточных популяций в средах направленной дифференцировки 72
3.10 Анализ перфузии миокарда по данным сцинтиграфии после операции комплексной реваскуляризации 74
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
- Особенности эмбриогенеза сосудистой системы
- Моделирование хронической ишемической болезни сердца
- Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга
- Оценка уровня экспрессии генов вазо-эндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга
Введение к работе
Актуальность темы. Ишемические состояния органов, в том числе инсульты, атеросклероз нижних конечностей, облитерирующий эндартериит, ишемическая болезнь сердца и их осложнения, занимают ведущее место среди причин инвалидизации и смертности преимущественно трудоспособного населения. Несмотря на значительный прогресс в профилактике рисков их развития и лечении, включая широкое распространение хирургических и эн-доваскулярных методов реваскуляризации, медико-социальная значимость этих патологий не снижается. По характеру и выраженности последствий, наносимых обществу (общей утрате трудоспособного населения), эти заболевания занимают второе место после рака легкого, поскольку являются наиболее частой причиной смерти в молодом возрасте. В связи с этим, разработка альтернативных методов улучшения кровоснабжения ишемизированных тканей остается актуальной. Терапевтический ангиогенез, который иногда называют биологическим шунтированием, представляет собой новую тактику улучшения перфузии ишемизированных тканей с помощью усиления естественных, но недостаточных процессов неоваскуляризации. Разработке этой лечебной тактики способствовало развитие современных представлений о молекулярных и клеточных механизмах регуляции роста и ремоделирования кровеносных сосудов.
Большое внимание в этом аспекте уделяется теоретическим и практическим разработкам использования клеток мононуклеарной фракции костного мозга (МНФ КМ). Это объясняется их уникальным свойством - пластичностью, т.е. способностью дифференцироваться в клетки практически всех мезенхимальных тканей. Проведен ряд исследований, в которых доказана возможность клеток костного мозга и других источников дифференцироваться в клетки других типов (нейроны головного и спинного мозга, гепатоциты, клеточные популяции поджелудочной железы, в том числе продуцирующие инсулин, эндотелиоциты, миобласты, остеоциты, хондроциты, эпителиоциты
и др.), (Деев Р.В. и др., 2005; Волков А.В. и др., 2005; Chen J. et al., 2001; Ar-vidsson A. et al., 2002; Riess P. et al., 2002; Aliotta J.M. et al., 2007).
За время, прошедшее после опубликования первой работы по терапевтическому ангиогенезу (Isner J.M. et al., 1996), было проведено более тысячи исследований, посвященных данной проблеме. Большие надежды, вызванные многообещающими данными экспериментальных исследований и в основном неконтролируемых клинических исследований, сменились разочарованием после получения результатов масштабных двойных слепых рандомизированных плацебо-контролируемых клинических испытаний, не подтвердивших однозначно эффективность такой тактики (Darwin J. et al., 2007). Более того, в экспериментальном исследовании имплантации несепарированных моно-нуклеарных клеток (МНК) КМ в зоны ишемического поражения миокарда собак выявлен рост костных балок в рубцовой зоне (Ларионов П.М. и др., 2004).
После первой публикации (Asahara Т. et al., 1997) об использовании эн-дотелиальных предшественников многие исследователи сосредоточили свое внимание на применении различных сепарированных клеток МНФ КМ с целью регуляции ангиоваскулогенеза. Появилось множество экспериментальных данных, свидетельствующих об ангиогенной эффективности различных фракций МНК, их сочетаний, генетических модификациях, а также о методах доставки клеток в ишемизированную область. Одним из самых многообещающих методов доставки клеток МНФ в очаг поражения на сегодняшний день является их имплантация в слепые лазерные трансмиокардиальные каналы (Ларионов П.М. и др., 2004; Patel A.N. et al., 2007; Klein H.M. et al., 2004; Angoulvant D. et al., 2004; Zhao H. et al., 2007; Gowdak L.H.W. et al., 2008; Horvath K.A., 2008).
Важным этапом в обосновании возможности терапевтического использования МНК с целью коррекции последствий ишемических состояний является изучение молекулярных механизмов активации и ускорения неадекват-
ного васкулогенеза, способов оптимизации получения эндотелиальных клеток-предшественников с необходимыми свойствами. Большое значение имеет разработка подходов к снижению побочных эффектов клеточной терапии и комбинированному использованию разных методов реваскуляризации. Это обосновывает актуальность изучения особенностей репаративной регенерации миокарда в условиях хронической ишемии при интрамиокардиальнои имплантации различных клеточных популяций МНФ КМ с использованием в качестве объекта эксперимента животного с относительно большой массой тела.
Цель исследования
- изучить структурную реорганизацию миокарда и молекулярные механизмы ангиогенеза при моделировании ишемической болезни сердца и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальнои имплантации клеток мононуклеарной фракции костного мозга.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда собак при моделировании ишемической болезни сердца.
2.Изучить морфологические и иммуногистохимические изменения миокарда в зонах трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации (ТМЛР) с имплантацией МНК КМ.
3.Оценить цитологические и молекулярные особенности прилипающих и неприлипающих к пластику мононуклеарных клеток костного мозга.
4.Оценить и сопоставить изменения микроциркуляторного русла в зонах ишемии и реваскуляризации морфологическими и радиологическими методами.
5.Изучить цитологические характеристики имплантированных клеток костного мозга, формирующих сосудистую почку.
Основные положения, выносимые на защиту.
Клетки мононуклеарной фракции костного мозга обладают ангиоген-ным и остеогенным потенциалом.
Направленная индукция аутологичных клеток костного мозга в культуре является источником эндотелиальных клеток-предшественников.
З.К биологическим особенностям прилипающей и неприлипающей фракций мононуклеарных клеток костного мозга относятся минимальные фено-типические и акцентированные молекулярно-генетические различия, что определяет потенциал их использования.
Научная новизна.
Впервые проведено изучение особенностей структурной реорганизации миокарда собак при моделировании ишемических повреждений и трансмио-кардиальной лазерной реваскуляризации с использованием интрамиокардиальной имплантации клеток МНФ КМ. Установлено, что применение интрамиокардиальной имплантации несепарированпых клеток костного мозга и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией неприлипающей фракции клеток костного мозга в постинфарктный период способствует индукции ангиогенеза в рубцовой и перирубцовой зонах миокарда левого желудочка собак. Выявлены побочные эффекты интрамиокардиальной имплантации несепарированной фракции клеток костного мозга, заключающиеся в появлении очагов эктопической регенерации (оссификации, хондро-генеза).
Впервые показано, что кратковременное сепарирование на пластике мононуклеарных клеток костного мозга позволяет получить фракции клеток с различным ангиогенным и остеогенным потенциалом. Показано, что клетки
неприлипающей фракции обладают более значительным ангиогенным потенциалом и существенно более низким остео- и хондрогенным потенциалом, чем клетки прилипающей фракции. По данным иммуноцитохимических исследований, около 90% клеток неприлипающей фракции экспрессируют маркеры эндотелиальных клеток - изолектин-В4 и VEGF-R2 (рецептор-2 к вазо-эндотелиальному фактору роста), что позволяет отнести их к эндотели-альным предшественникам. Интрамиокардиальная имплантация неприли-пающих клеток костного мозга способствует усилению экспрессии мРНК VEGF-A (вазо-эндотелиального фактора роста А) и SDF-1 (стромального клеточно-продуцируемого фактора-1), необходимых для интенсификации роста сосудов.
Впервые описаны последовательные стадии новообразования сосудов в зонах корригирующих воздействий. Дана цитологическая характеристика ан-гиобластной клетки.
Впервые разработан метод комплексного количественного анализа уровня экспрессии мРНК генов семейства VEGF, генов аггрекана, люмикана и остепонтииа в клетках различных МНФ КМ собаки.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученные в процессе исследования результаты развивают существующие представления о механизмах направленного ангиоваскулогенеза миокарда в постинфарктный период при использовании лазерных и клеточных технологий.
Обоснован метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием импульсного полупроводникового лазера и фракционированных МНК КМ, который используется в клинической практике ФГУ «Новосибирского НИИ патологии кровообращения Росмедтехнологий». Получена приоритетная справка № 2006128967 на выдачу патента на изобретение «Способ лазерного энграфтинга клеток».
Апробация работы.
Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены на VI научных чтениях с международным участием, посвященных памяти академика Е.Н. Мешалкина, «Новые технологии в сердечно-сосудистой хирургии и интервенционной кардиологии» (Новосибирск, 2008). IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти академика В.И.Шумакова (Москва, 2008). Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию проф. П.Г.Подзолкова (Красноярск, 2008), межлабораторной научной конференции ФГУ Новосибирского научно-исследовательского института патологии кровообращения им. акад. Е.Н.Мешалкина Росмедтехнологий и ГУ Научно-исследовательского института региональной патологии и патоморфологии СО РАМН (Новосибирск, 2009).
Публикации.
По теме диссертации опубликованы 7 работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материал изложен на 102 страницах компьютерного текста, включающего 25 рисунков и 6 таблиц. Список литературы содержит 137 работ. Весь материал, представленный в диссертации, собран, обработан и проанализирован лично автором.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Особенности эмбриогенеза сосудистой системы
Поскольку диффузия молекул ограничена (для кислорода, например, это расстояние составляет 100 - 200 мкм), то сосудистая система в любой ткани или органе должна сформироваться в самых ранних периодах развития. Сердечно-сосудистая система - фактически первая органная система, формирующаяся во время раннего эмбрионального развития. В первую очередь во время гаструляции наблюдается дифференцировка ЭК, которые затем инвагини-руют через первичную полоску с образованием мезодермы. Вновь сформированные клетки мезодермы вскоре реорганизуются в осевую мезодерму (ното-хорд), сомиты и промежуточную мезодерму.
Латеральный листок мезодермы расположен по обеим сторонам промежуточной мезодермы, и после формирования целома в дальнейшем разде ляется на дорзальныи листок, соматоплевральную мезодерму и вентральный листок, планхноплевральную мезодерму. Дорзальныи листок находится в контакте с эктодермой и формирует в дальнейшем стенку тела и конечности, в то время как вентральный листок, контактируя с энтодермой, формирует внутренние органы. Задняя часть мезодермы, занимающая почти половину эмбриона во время ранних стадий гаструляции, дает начало экстраэмбриональной мезодерме.
Впервые ЭК, формирующиеся во время гаструляции, обнаружены Мюрреем (Murray, 1932) и берут начало из латерального и заднего участков мезодермы. Мюррей разделил 24-часовые куриные эмбрионы на маленькие кусочки, in vitro вырастил из них клетки крови, которые были видны из-за содержащегося в них гемоглобина. Задние 2/3 эмбриона, принадлежащие предположительно зонам латеральной и задней мезодермы, дают начало как клеткам крови, так и ЭК. Показано (Eichmann et al., 1993), что в этих зонах экспрессируется VEGFR2.
Вазоэндотелиальный ростовой фактор (VEGF) и его рецептор (VEGFR2) - самые важные факторы эмбрионального формирования сосудов. VEGF экспрессируется в пространственной и временной связи с большинством физиологических событий при формировании сосудов in vivo. Экспрессия VEGFR2 также наблюдается на ранних стадиях развития и постепенно ограничивается только ЭК во всех типах кровеносных и лимфатических сосудов. Мыши, дефицитные по гену VEGFR2 (VEGFR2"7"), погибают внутриутробно на 8.5 - 9.5-е сутки в результате раннего дефекта развития гемопо-этических и эндотелиальных клеток. На 7.5-е сутки в желточном мешке отсутствуют кроветворные островки и нет сформированных кровеносных сосудов, как и предшественников гемопоэтических клеток.
VEGF-дефицитные мыши также погибают на 8.5 - 9.5-е сутки внутриутробного развития и имеют фенотипическое сходство с VEGFR2 /"-MbiinaMH (Shalaby et al., 1995). Этот фенотип также наблюдается у гетерозиготных VEGFR2+/"-MbiujeH (Carmeliet et al., 1996). Летальность, обусловленная потерей единичного аллеля, показывает тесную доза-зависимую регуляцию эмбрионального сосудистого развития VEGF. Таким образом, описанные результаты подтверждают главную роль системы VEGF/VEGFR2 в формировании сосудов.
Вновь сформированные клетки латеральной и задней мезодермы мигрируют навстречу желточному мешку, где они дифференцируются в гладко-мышечные клетки (ГК) и ЭК кровяных островков. Во время миграции их предшественники собираются в кластеры, называемые гемангиобластиче-скими агрегатами. Они впервые были описаны F.Sabin (Sabin, 1902), которая изучала их миграцию методами световой микроскопии. Она смогла различить агрегаты гемангиобластов и остальные клетки мезодермы по изменению преломления света. Периферические клетки этих агрегатов впоследствии становятся плоскими и дифференцируются в ЭК, в то время как клетки центральной зоны дифференцируются в гемопоэтические клетки.
Одновременное появление ЭК и ГК в кровяных островках позволило сформулировать гипотезу, согласно которой они дифференцируются из общего предшественника- гемангиобласта (Sabin, 1920) (рис. 1).
Во время последующих стадий дифференцировки гемангиобласта экспрессия VEGF-R2 наблюдается как в предшественниках гаструляции, так и в гемангиобластных агрегатах, в то время как в уже дифференцированных островках только ЭК экспрессируют этот ген. Эти наблюдения коррелируют с гипотезой о том, что VEGF-R2 «метит» бипотентные клетки-предшественники и что после изменения направления дифференцировки только одна или две дочерние клетки продолжают экспрессировать этот ген.
На индивидуальном клеточном уровне VEGF-R2+-raieTKH способны дифференцироваться или в ЭК или в ГК, но не в оба типа сразу, скрывая тем самым прямую демонстрацию существования «гемангиобласта».
Моделирование хронической ишемической болезни сердца
1. Моделирование хронической ишемической болезни сердца (п=21). 2. Спустя три месяца проведение операции непрямой лазерной рева-скуляризации миокарда с имплантацией неприлипающей фракции МНК (n = 8) и прилипающей фракции (п = 4) МНК КМ в сформированные лазерные каналы. 3. Вывод животных из эксперимента через 3 месяца после операции для контрольной группы (п=7) и через 4 недели после операции реваскуляри-зации, забор материала для морфологического и молекулярного анализа. 4. Морфологическая и молекулярная оценка результатов. 5. Тестирование систем клеточной дифференцировки на неприлипающей и прилипающей фракциях мононуклеарных клеток.
Основная часть работы выполнена на базе ФГУ «Новосибирского НИИ патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина Росмедтехнологий» в лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии под руководством доктора медицинских наук, профессора П.М.Ларионова.
Иммунофенотипирование фракций МНК КМ выполнено на базе кли-нико-иммунологической лаборатории ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН под руководством доктора медицинских наук, профессора B.C. Кожевникова.
Исследование перфузии миокарда методом планарной сцинтиграфии проводилось на базе Алтайского краевого кардиологического диспансера.
Работа выполнена на 21 беспородных собаках в возрасте 3-5 лет массой от 15 до 20 кг. Животных содержали в стационарных условиях вивария в условиях естественного светового режима на стандартной лабораторной дие те. При проведении экспериментов руководствовались рекомендациями, изложенными в Приказе № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г. Все экспериментальные работы выполнены с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или других целей.
Всем животным была выполнена модель хронической ишемической болезни сердца, которая осуществлялась путем перевязки передней межжелудочковой коронарной артерии и коллатеральных ветвей первой диагональной артерии в условиях интубационного наркоза. Премедикация осуществлялась внутримышечным введением калипсола 10 мг/кг, атропина 0,1% - 0,1 мг/кг, димедрола 1% - 2,0 мл, дроперидола 0,8 мг/кг. Затем после утраты болевой чувствительности и наступления сна, животное фиксировалось на операционном столе в положение на правом боку.
Для исключения гипоксических осложнений во всех случаях проводилась интубация трахеи и последующая искусственная вентиляция легких атмосферным воздухом. Управляемое дыхание осуществлялось с помощью аппарата РО-6. Основной наркоз - калипсол 15 мг/кг в час, дроперидол - 0,3 мг/кг в час - вводился вместе с кристаллоидными расстворами (5% раствор глюкозы, 0,9% раствор хлорида натрия) путем внутривенных капельных ин-фузий.
Доступ к сердцу осуществлялся при левосторонней торакотомии в 4-ом межреберье, продольно вскрывался перикард, выделялась передняя нисходящая коронарная артерия и перевязывалась в проксимальной трети (сразу ниже места отхождения первой диагональной ветви) и в дистальной трети (для предотвращения перетока крови из системы правой коронарной артерии). Формирование инфаркта миокарда подтверждалось электрокардиографически и визуально. После моделирования инфаркта выполнялся гемостаз и послойное ушивание раны с оставлением дренажа для эвакуации воздуха. Воздух удалялся после окончания действия наркоза. По окончании вмешательства животные выводились из наркоза. При адекватном самостоятельном дыхании - экстубировались и помещались в клетку с последующим уходом (кормление, прогулки, уборка помещения). Все собаки получали анальгетики и антибактериальную терапию в течение 2 недель после операции. Двое животных погибли от острой сердечной недостаточности на этапе формирования модели ХИБС.
Особенности оперативного вмешательства при выполнении тран-миокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией аутологич-ных клеток. По прошествии 3-месячного восстановительного периода выполнялась операция непрямой реваскуляризации со стандартным анестезиологическим обеспечением. Специальной подготовки в предоперационном периоде не проводилось, за исключением голодной диеты накануне операции.
Премедикация осуществлялась внутримышечным введением калипсола 10 мг/кг, атропина 0,1% - 0,1 мг/кг, димедрола 1% - 2,0 мл, дроперидола 0,8 мг/кг. Затем после утраты болевой чувствительности и наступления сна, животное фиксировалось на операционном столе в положение на правом боку. Для исключения гипоксических осложнений во всех случаях проводилась интубация трахеи и последующая искусственная вентиляция легких атмосферным воздухом. Управляемое дыхание осуществлялось с помощью аппарата РО-6. Основной наркоз - калипсол 15 мг/кг в час, дроперидол - 0,3 мг/кг в час - вводился вместе с кристаллоидными растворами (5% раствор глюкозы, 0,9% раствор хлорида натрия) путем внутривенных капельных инфузий.
Морфологический анализ миокарда при моделировании хронической ишемической болезни сердца после имплантации прилипающих клеток мононуклеарной фракции костного мозга
Наиболее значительным проявлением индуцированного морфогенеза в результате имплантации прилипающей фракции мононуклеарных клеток костного мозга, была распространенная оссификация эпикарда и субэпикарди-ального слоев миокарда (рис. 5, 6) с хаотично ориентированными костными балками (рис. 7, 8). Сформированные небольшие костные балки отличались значительной гетерогенностью и располагались в фиброзированной соединительной ткани. Здесь же отмечалось развитие жировой ткани. В некоторых случаях можно было дифференцировать фрагменты сформированных хрящевых структур с частичной минерализации или без нее (рис. 9).
К особенностям индуцированной репаративной регенерации миокарда в данных условиях (к «специфическим» морфологическим симптомам) относилась также очаговая пролиферация гладкомышечных клеток. В результате чего отмечалось «раздвигание» мышечных волокон миокарда без их прорастания. Следует отметить, что подобная реакция была выявлена в миокарде у двух животных, которым имплантировали клетки прилипающей мононуклеарной фракции костного мозга (рис. 10, 11, 12).
К следующей группе установленных нами дополнительных «особенных» симптомов, отражающих побочные эффекты имплантации клеток в пе-рирубцовую зону, относилась очаговая кальцификация без образования кости и хряща (рис. 13). Кальцификация могла происходить по периферии зон ос-сификации.
При детальном морфологическом анализе в зонах оссификации можно было наблюдать формирование крупных многоядерных клеток с овальными ядрами, непосредственно примыкающих к костным балкам. Подобные клеточные элементы были расценены нами как остеокласты. Более того, именно в подобных местах, где остеокласты непосредственно примыкали к костным балкам, определялась неровная поверхность балок, что позволило определить такие места как участки резорбции вновь образованных структур кости. Небольшие костные балки, могли окутываться многоядерными остеокластными клетками и подвергаться частичной резорбции (рис. 14).
Практически во всех наблюдениях выявлялась различной степени выраженности мононуклеарная клеточная инфильтрация. Кроме того, определялись явления новообразования сосудов, включая проявления ангиоматоза.
Таким образом, нами показана возможность эктопической оссификации миокарда при использовании несепарированных на пластике клеток МНФ костного мозга для имплантации в перирубцовую зону, появление хрящевых элементов, очагов кальцификации и гладкомышечных клеток.
Постоянным морфологическим признаком индуцированного морфогенеза у животных этой группы был обильно васкуляризированный рубец - в результате лазерного воздействия. Кроме рубцовых изменений, в местах лазерного воздействия с такой же частотой выявлялись крупные, перерастянутые сосуды, часто синусоидного типа. В области эпикарда они могли достигать 1 мм в диаметре. По мере продвижения к эндокарду размеры сосудов существенно уменьшались, крупные сосуды при дихотомическом ветвлении «рассыпались» на более мелкие сосуды, также синусоидного типа. Такие сосуды были в основном тонкостенными, просветы их отличались неправильной формой. Необходимо сказать, что подобные морфологические изменения выявлялись и в группе с имплантацией прилипающих клеток МНФ костного мозга в лазерные каналы.
В этой группе значимыми морфологическими изменениями были проявления распространенного ангиоматоза, ориентированного на зоны воздействия. Для ангиоматоза было характерно сохранение пролиферативной активности клеточных элементов, формирующих ангиоматозные структуры. Морфологическим симптомом, указывающим на явление ангиоматоза, было образование структур по типу «сосуда в сосуде» (рис. 15). Кроме того, в области имплантации мононуклеарных клеток в эпикарде и субэпикардиальном слое миокарда наблюдался диффузный рост небольших мономорфных, «штампованных», сосудов с гиперхромным эндотелием (рис. 16), здесь же обнаруживались «сосудистые почки».
Существенной постоянно встречающейся морфологической характеристикой мест имплантации клеток МНФ было присутствие в них очаговых инфильтратов из бластных клеток, часто с пролиферативной активностью. Более того, можно было проследить стадии формирования капилляра от крупной клетки с гиперхромным, эксцентрично расположенным ядром и слабо оксифильной цитоплазмой, что несколько напоминало плазматическую клетку (рис. 17). Происходило удлинение ядра, образовывались цепочки клеток, появлялось своеобразное расщепление с неравномерной конденсацией хроматина и, собственно, формирование сосудистой почки без четко сформированного просвета или со сформированным просветом (рис. 18).
Подводя предварительный итог проведенным исследованиям, можно утверждать, что в местах имплантации клеток МНФ в лазерные каналы наблюдалось новообразование сосудов с такими крайними проявлениями, как анигоматоз. Кроме того, присутствие бластных клеточных инфильтратов, состоящих из плазмоцитоподобных элементов, можно было связать с образованием сосудистых почек, образующих или не образующих просвет.
Оценка уровня экспрессии генов вазо-эндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга
Миокардиальная ишемия и периферические сосудистые заболевания -две главные причины заболеваемости и летальности у людей. Прогресс в лечении этих состояний реализовывается, потому что есть продвижение в нашем понимании ангиогенеза и, в особенности, развития коллатеральных сосудов коронарного русла. Действительно, ряд заболеваний, которые не так давно рассматривались как резистентные к лечению, в настоящее время становятся потенциальными целями для антиангиогенной терапии, в том числе диабетическая ретинопатия, эндометриоз, или проангиогенной терапии -ишемическая болезнь сердца.
Клеточно-опосредованные стратегии в лечении ИБС основаны на имплантации непосредственно в ишемизированный миокард или в коронарное русло костномозговых клеток. При этом преследуется две цели: реваскуляри-зация миокарда и устранение дефицита функциональных клеточных элементов миокарда.
Костный мозг содержит два принципиальных типа СК: гемопоэтиче-ские СК и мезенхимальные СК. Считается, что оба этих типа клеток имеют предшественников с потенциалом к трансдифференциации в клетки различных фенотипов (Huss R.N. et al., 2000).
Isner J.M. et al. (2000) выделяли из костного мозга предполагаемые эн-дотелиальные клетки-предшественники, которые имели некоторую часть поверхностных антигенов, общих с кроветворными стволовыми клетками (CD34, CD 133, Flk-1, Tie-2), и демонстрировали, что они способствуют неоан-гиогенезу в ишемизированном миокарде. Эндотелиальные клетки-предшественники системно вводились иммунодефицитным крысам с предварительно выполненной окклюзией коронарной артерии, впоследствии обнаружилось, что клетки донора аккумулировались преимущественно в областях неоангиогенеза внутри инфарктной зоны. Повышение плотности капилляров (количества капилляров на единицу объема миокарда) сопровождалось значительным улучшением функции и параметров левого желудочка по сравнению с контрольной группой.
Схожие работы с аналогичными результатами были выполнены на различных животных моделях несколькими коллективами других авторов (Kocher А.А., 2001. Jackson К.А., 2001).
Kamihata Н. et al. (2001) показали, что интенсивный неоваскулогенез после имплантации костномозговых клеток в область инфаркта миокарда обусловлен не только их непосредственным участием, но и значительной экспрессией этими клетками таких факторов ангиогенеза, как фактор роста эндотелия сосудов, ангиопоэтин и другие.
В настоящее время за модель хронической ишемической болезни сердца принимается модель, выполненная на животных, перенесших инфаркт миокарда (Schwartz P.J. et al., 1984). Показано, что именно такие модели могут приводить к сердечной недостаточности у животных и, как было показано, сочетаются с высоким риском развития спонтанных ишемических желудочковых аритмий (Issa Z. et al., 2004).
И именно на такой модели ХИБС - 10 недель спустя от момента моделирования ИМ у овец, с перевязкой передней нисходящей и огибающей коронарных артерий - была выполнена непрямая лазерная реваскуляризация свободной и задней стенок ЛЖ. Проведенный анализ перфузии миокарда, а также миокардиальной функции (по конечному систоло- и диастол ическому давлениям) показали достоверное увеличение перфузии в группе животных с трансмиокардимльной лазерной реваскуляризацией (ТМЛР) с однотипным улучшением показателей сердечной функции и в контроле, и в группе с ТМЛР. Отличительной особенностью исследования является детальный гистологический анализ мест ТМЛР, из 269 мест выполнения ТМЛР в 133 (49%), была найдена очевидность просвета, сопоставимого с делением внутримио-кардиальных артерий. Средний диаметр просвета ЛК - 0.185±0.036мм для канала, против 0.163±0.031 мм для сосудов контроля. В этом же исследовании авторы продемонстрировали увеличение плотности капилляров (Shigeyuki Ozaki et al., 2000).
В то же время, если продолжить тему открытых «каналов», то в нашем случае это крупные синусоидального типа сосуды с диаметром от 1 мм и меньше или обильно васкуляризированный рубец, в котором сосуды преимущественно ориентируются перпендикулярно воздействию лазерного луча. Более того, в нашем исследовании также получено достоверное увеличение плотности микрососудов в сочетании с достоверным увеличением показателей перфузии.
Возвращаясь к полученным нами результатам - распространенному рубцовому замещению миокарда, запустеванию и облитерации сосудистого русла, мы можем твердо утверждать, что сроки от момента моделирования инфаркта миокарда до повторной операции - более 12 недель после перевязки передней нисходящей коронарной артерии и диагональной ветви - являются показателем «полноты» моделирования, даже без учета интраопераци-онной летальности, которая осталась за рамками нашего исследования.
Широко подходя к возможностям комбинированной непрямой рева-скуляризации, следует указать, что существуют и другие комбинации воздействия на миокард, которые имеют прочную экспериментальный) основу и вероятно служат прототипами грядущих ограниченных клинических испытаний.
