Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Гематологический гомеостаз 16
1.2. Гепарин в защитно-приспособительных реакциях организма 33
1.3. Современные методы экспериментального (доклинического) изучения новых фармакологических веществ 46
1.4. Фармакологическая регуляция психических процессов 60
1.5. Заключение 64
Глава 2. Материалы и методы 67
2.1. Биохимические методы 70
2.2. Препаративно аналитический метод 76
2.3. Физиологические методы 76
2.4. Психофизиологические методы 77
2.5. Гистологические методы.. 88
2.6. Морфометрические методы 88
2.7 Культуральный метод 90
2.8. Хроматографические методы 90
2.9. Электрофоретический метод 92
2.10. Статистические методы 92
Глава 3. Результаты собственных исследований 93
3.1. Изучение в динамике курсового воздействия высокомолекулярного гепарина на систему гемостаза у крыс Вистар ,. 93
3.2. Определение в динамике курсового воздействия высокомолекулярного гепарина на цитометрические параметры крови крыс Вистар 112
3.3. Выявление последствий однократного и хронического введения высокомолекулярного гепарина на скорость мозгового кровотока у крыс Вистар 125
3.4. Определение влияния высокомолекулярного гепарина на функциональную активность нейтрофилов периферической крови крыс Вистар 131
3.5. Изучение механизмов взаимодействия дефенсина (лизосомального неферментного катионного белка из нейтрофилов) с эндогенным и экзогенным гепарином 140
3.6. Воздействие курсового введения высокомолекулярного гепарина и дефенсина на процессы заживления асептической кожной раны 144
3.7. Влияние курсового введения высокомолекулярного гепарина и дефенсина на ангиоархитектонику скелетной мышцы 147
3.8. Действие высокомолекулярного гепарина и дефенсина на клетки культуры СПЭВ 150
3.9. Морфофункциональная характеристика тимуса при курсовом введении высокомолекулярного гепарина 154
3.10. Морфофункциональная характеристика селезенки при курсовом введении высокомолекулярного гепарина 164
3.11. Влияние высокомолекулярного гепарина на цитофизиологическое состояние тучных клеток соединительной ткани крыс Вистар 172
3.12. Антиноцицептивные эффекты высокомолекулярного гепарина при tail-flick тестировании 181
3.13. Эффекты высокомолекулярного гепарина при выработке у крыс Вистар пищедобывательного поведения в условиях радиального и многоальтернативного лабиринтов 190
3.14. Определение уровня кортикостерона в плазме крови крыс Вистар после курсового введения высокомолекулярного 218
3.15. Исследование влияния курсового введения высокомолекулярного гепарина на содержание моноаминов в структурах головного мозга крыс Вистар 225
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 248
Практические рекомендации 274
Выводы 275
Список литературы
- Гепарин в защитно-приспособительных реакциях организма
- Физиологические методы
- Определение в динамике курсового воздействия высокомолекулярного гепарина на цитометрические параметры крови крыс Вистар
- Влияние высокомолекулярного гепарина на цитофизиологическое состояние тучных клеток соединительной ткани крыс Вистар
Введение к работе
Ускорение темпа жизни современного человека резко усилило, психоэмоциональные перегрузки. В ответ на эмоциональное напряжение наиболее быстро реагирует система гемостаза. Одним из проявлений реакции этой системы является усиление прокоагулянтнои активности крови, которая обычно сопровождается приспособительной реакцией со стороны противосвертывающей системы - системы фибринолиза. Однако, у 25 % людей функциональная активность фибринолиза весьма слаба, или даже наблюдается ее угнетение, что приводит к образованию тромбов в сосудистом русле различных органов с развитием ишемии, инфарктов, тромбоэмболии (Баркаган З.С., 2000; Бокарев И.Н., 2000). В указанных ситуациях в клинической практике широко используются фармакологические препараты, препятствующие тромбообразованию -антикоагулянты (Балуда В.П. с соавт., 1995; Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Баркаган З.С., 2000; Бокарев И.Н., 2000,2003; Bick R.L. et al., 2005; Bobek V. etal.,2005).
Высокомолекулярный гепарин до настоящего времени является наиболее часто применяемым антикоагулянтом в клинике лечения заболеваний, связанных с тромбозами или угрозой тромбообразования (Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Бокарев И.Н., 2000, 2003). Коммерческие препараты гепарина для клинического применения получают из естественных источников - из кишечника свиней, либо из лёгких крупного рогатого скота - из тканей, содержащих в большом количестве тучные клетки. В организме животных и человека высокомолекулярный гепарин синтезируется и депонируется в основном в тучных клетках (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Straus А.Н. 1982). Физиологические свойства тучных клеток и вещества, с которыми гепарин соседствует в гранулах тучных клетках, в конечном счете, определяют эффекты гепарина (Stevens R.L. et al, 1986; Bick R.L. et al., 2005).
Впервые антикоагулянтные эффекты гепарина наблюдал J. McLean в 1916 году. С тех пор сложилась достаточно парадоксальная ситуация, когда постоянно углубляются знания о механизмах действия и множестве других, кроме антикоагулянтных, фармакологических свойствах гепарина, но явно отстают представления о возможности его применения по другому назначению.
Кроме влияния на гемостаз, высокомолекулярный гепарин оказывает весьма разнообразные регуляторные воздействия, т.к. благодаря полианионной структуре, гепарин способен образовывать комплексы с белками и связывать биогенные амины. На этом основана инактивация ряда ферментов гепарином, его антитоксическое и антигистаминное действие (Серов В.В. , Шехтер А.Б., 1981). Как известно гистамин, кроме тканевых провоспалительных и ноцицептивных (болевых) функций, выполняет роль нейромодулятора и нейромедиатора в центральной нервной системе (ЦНС) (Ашмарин И.П., 1999; Судаков К.В., 2000). Наличие антигистаминных свойств позволяет предполагать, что гепарин обладает регуляторными свойствами в отношении указанных эффектов гистамина.
Очень важна роль гепарина в регуляции каталитического потенциала фосфолипазы Аг - регулятора текучести клеточных мембран, определяющего поведение клеток (состояние цитоскелета, метаболизма, ионного транспорта). Этот фермент гидролизует мембранные фосфолипиды до жирных кислот и лизофосфолипидов, которые могут быть метаболизированы до сильнодействующих медиаторов воспаления (эйкозаноиды, фактор активации тромбоцитов). В экспериментах на крысах было установлено, что при повышении уровня жирных кислот наблюдается стимуляция симпатической и кардиальной автономной нервной системы (Paolisso G. et al., 2000). Многие авторы отмечали важную роль метаболизма липидов в поддержании нормального функционирования нейронов (Bessesesn D.H. et al., 1993; Oscarsson J. et al., 1999). Farooqui А.А. с соавторами (1999) обнаружили повышение активности внутриклеточной фосфолипазы Аг при неврологических расстройствах, связанных с воспалительным и окислительным стрессами (ишемия, повреждения спинного мозга, болезнь Альцгеймера), Степень ингибирования фосфолипазы Аг гепарином обратно пропорциональна ионной силе и зависит от комплексообразования между этими веществами (Diccianni М.В. et al., 1990).
Кроме того, гепарин регулирует каталитический потенциал фосфолипазы С, участвующей в процессе АТФ-зависимого выделения внутриклеточного Са2+, посредником которого является инозитол-1,4,5-трифосфат (Salter М. W. и Hicks J.L., 1995). Судя по работам Kato N. (1993), Salter М. W. и Hicks J.L. (1995), основные трансформации возбудимости клеток ЦНС осуществляются посредством изменения концентрации ионов кальция как внутри, так и вне клеток. Kato N. доказал, что индуктором продолжительной депрессии, отражающейся на механизмах памяти и обучении, могут являться ионы кальция, появляющиеся в большой концентрации в постсинаптическом пространстве ЦНС в результате активации инозитол-1,4,5-трифосфата. Активность последнего также регулируется гепарином через ингибирование самого инозитол-1,4,5-трифосфата и его рецепторов (Kato N., 1993; Salter М. W., 1995; Broad L.M. et al, 2001).
Свойство гепарина блокировать выделение кальция из внутриклеточных источников, являющихся одной из важных причин появления болевых ощущений, и регуляция гепарином каталитического потенциала фосфолипазы С, участвующей в проявлении противоболевых свойств (Galeotti N. et al, 2004), могут служить поводом для исследования аналитических эффектов гепарина. Возможность влияния гепарина на концентрацию ионов кальция является также важным механизмом действия этого препарата на иммунофизиологические процессы (Tellam R.L., Parish C.R., 1987). Имеются сведения о действии гепарина на неспецифическую резистентность через влияние на кинетические процессы и процессы дегрануляции нейтрофилов (Freischlag J.A. et al, 1992).
Среди эффектов гепарина, выходящих за рамки антикоагулятного действия, Cen Y. с соавт. (2000) отмечали ускорение заживления ожоговой раны при подкожном введении гепарина. В этом случае наиболее вероятным механизмом действия, является регуляция гепарином биоактивного состояния рецепторов, секреции и активации факторов роста фибробластов, выделяющихся в месте повреждения любых тканей (Kinsella M.G. et al., 2004). Эти же факторы роста участвуют в инициации процессов роста микрососудов (Conklin B.S. et al., 2004; Brill A. et al., 2004). За последние 30 лет из тканей млекопитающих выделено более 30-ти факторов роста и трофических факторов, имеющих одно общее свойство - высокое сродство к гепарину. Действие многих факторов роста направлено на преодоление последствий стресса (Rhoads D.N. et al., 2000).
Учитывая вышеизложенное, и то, что гепарин способен проходить через гематоэнцефалический барьер (Ляпина Л.А. с соавт., 1981), большой теоретический и практический интерес представляет исследование антистрессорного, аналгетического действия ВМГ, его влияния на когнитивные (познавательные) процессы, психо-эмоциональное состояние млекопитающих, на иммунную систему, на рост микрососудов, на процессы репарации. Это является важным, с одной стороны для объяснения действия эндогенного гепарина, с другой стороны вопрос о выяснении эффектов гепарина существенен, так как гепарин вводят большому контингенту больных. Полученные результаты в дальнейшем позволят расширить область применения гепарина в клинической практике.
Цель исследования
Морфофункциональное и психофизиологическое исследование антистрессорного и аналгетического эффектов высокомолекулярного гепарина у экспериментальных животных, не подвергавшихся и подвергавшихся воздействию информационной нагрузки.
Задачи исследования:
1. Выявить в динамике влияние курсового введения различных доз высокомолекулярного гепарина на гематологический гомеостаз (гемостаз, клеточный состав крови, скорость мозгового кровотока) крыс Вистар при различных способах введения животным, подвергавшимся и не подвергавшимся воздействию длительной информационной нагрузки.
2. Исследовать цитофизиологическое состояние популяции тучных клеток соединительной ткани при курсовом введении различных доз высокомолекулярного гепарина крысам после обучения в лабиринтных средах и без такового.
Оценить функциональную активность нейтрофилов периферической крови после введения различных доз высокомолекулярного гепарина экспериментальным животным, проходившим обучение и без такового.
Изучить механизмы взаимовлияния высокомолекулярного гепарина (экзогенного и эндогенного) и дефенсина - катионного пептида нейтрофилов.
Определить влияние различных доз высокомолекулярного гепарина на скорость репаративных процессов и микроциркуляцию.
Провести морфологическое и морфометрическое исследование тимуса и селезенки после курсового введения различных доз высокомолекулярного гепарина экспериментальным животным, подвергавшимся и не подвергавшимся воздействию информационной нагрузки.
7. Оценить методом tail-flick тестирования влияние различных доз высокомолекулярного гепарина на формирование ответа при болевом воздействии.
8. Исследовать влияние курсового введения различных доз высокомолекулярного гепарина на когнитивные (познавательные), поведенческие и психоэмоциональные характеристики крыс Вистар, используя модели, максимально приближенные к условиям интеллектуальной деятельности человека (радиальный и многоальтернативный лабиринты).
9. Определить содержание кортикостерона в крови и уровень моноаминов в мозге крыс Вистар после курсового введения различных доз высокомолекулярного гепарина животным, подвергавшимся и не подвергавшимся воздействию информационной нагрузки.
Во всех задачах в качестве групп сравнения использованы интактные животные, а также грызуны, которым вводили растворитель высокомолекулярного гепарина - физиологический раствор (0,9 NaCl). В качестве референтного вещества использован пирацетам в дозах 40 и 260 мг/кг.
Основные положения, выносимые на защиту
1.Курсовое введение высокомолекулярного гепарина в низкой и средней дозах оказывает антистрессорное действие, выражающееся в сохранении на уровне контроля содержания кортикостерона в крови, цитометрических показателей крови, морфофункционального состояния тимуса, цитофизиологического состояния популяции тучных клеток. Антистрессорное действие высокомолекулярного гепарина в низкой дозе характеризуется, кроме того, устранением нарушения поведения животных в лабиринтной среде.
Курсовое введение высокомолекулярного гепарина вызывает дозозависимое повышение скорости кровотока в головном мозге и разнонаправленное изменение уровня моноаминов, оказывает дозозависимое аналгетическое действие (tail-flick метод).
2.Высокомолекулярный гепарин при курсовом введении в низкой дозе способствует устранению нарушения поведения животных при информационной нагрузке, активирует когнитивные процессы, улучшает способность к ориентации в пространстве. По выраженности этих эффектов, высокомолекулярный гепарин превосходит пирацетам.
3.Курсовое введение высокомолекулярного гепарина в низкой дозе, в отличие от пирацетама и физиологического раствора, вызывает функциональную активацию нейтрофилов периферической крови.
4.Высокомолекулярный гепарин в разных дозах взаимодействует с дефенсином - лизосомальным катионным белком из нейтрофилов. Курсовое введение высокомолекулярного гепарина и дефенсина в низких дозах ускоряет течение репаративных процессов, улучшает микроциркуляцию скелетной мышцы.
5.Информационная нагрузка пролонгирует и усиливает действие высокомолекулярного гепарина, пирацетама, физиологического раствора. б.Многократное введение физиологического раствора, в отличие от однократного, может служить моделью устойчивого стрессорного состояния экспериментальных животных.
Научная новизна
Впервые установлено, что высокомолекулярный гепарин в обеих дозах (64 и 640 МЕ/кг) оказывает антистрессорное действие, что подтверждается сохранением на уровне контроля содержания кортикостерона в крови, цитометрических показателей крови, морфофункционального состояния тимуса и популяции тучных клеток соединительной ткани. Антистрессорное действие высокомолекулярного гепарина в низкой дозе (64 МЕ/кг) характеризуется также устранением нарушения поведения животных в лабиринтной среде.
Впервые показано, что курсовое внутримышечное введение крысам Вистар высокомолекулярного гепарина в дозе 64 МЕ/кг приводит к активации когнитивных процессов, улучшает способность к ориентации в пространстве. Эти эффекты значительно превосходят свойства пирацетама - известного ноотропа, применяемого в соответствующих дозах (40 и 260 мг/кг).
Получены новые данные о биохимической основе активации когнитивных процессов под действием курсового введения высокомолекулярного гепарина. Показано, что курсовое введение высокомолекулярного гепарина в дозе 64 МЕ/кг сопровождается повышением уровня дофамина в стриатуме. Применение гепарина при аналогичной схеме введения, но в более высокой дозе (640 МЕ/кг), а также пирацетама в обеих дозах и физиологического раствора вызывает менее выраженную активацию когнитивных процессов, которая сочетается со снижением содержания дофамина в структурах головного мозга (гипоталамусе, гиппокампе и коре головного мозга).
Новым является установление факта дозозависимого аналгетического действия высокомолекулярного гепарина на экспериментальных животных при болевом воздействии теплового луча света (tail-flick тестирование). В отличие от гепарина, пирацетам в обеих дозах, а также физиологический раствор вызывают повышение ноцицептивной (болевой) чувствительности.
Получены новые данные о том, что курсовое внутримышечное введение крысам Вистар высокомолекулярного гепарина в низкой дозе улучшает кровоснабжение скелетной мышцы, ускоряет течение репаративных процессов.
Впервые показано, что высокомолекулярный гепарин в разных дозах взаимодействует с дефенсином (лизосомальным катионным белком из нейтрофилов) путем образования комплексного соединения, что объясняет взаимовлияние медиаторов тучных клеток и нейтрофилов в организме животных и человека.
Использование сложной модели многоальтернативного лабиринта с компьютерной программой "Labirint" позволило впервые установить, что пирацетам в дозах 40 и 260 мг/кг, вводимый крысам Вистар до обучения, вызывает снижение концентрации внимания, затруднение процессов элиминации ошибочной деятельности, проявляя негативное действие на особей с исходно высоким уровнем когнитивных способностей.
Впервые установлено, что курсовое введение физиологического раствора вызывает развитие устойчивого стрессорного состояния экспериментальных животных. Однократное введение физиологического раствора не обладает негативными эффектами, присущими курсовому введению.
Научно-практическая значимость
Важное теоретическое и практическое значение полученных результатов заключается в том, что в модельных психофизиологических экспериментах, приближенных к условиям интеллектуальной деятельности человека, установлено, что высокомолекулярный гепарин в низкой дозе (64 МЕ/кг) приводит к активации когнитивных процессов, улучшению способности к ориентации в пространстве. Эти эффекты значительно превосходят свойства известного ноотропа -пирацетама, применяемого в дозах 40 и 260 мг/кг.
Результаты настоящих исследований являются основанием для рекомендаций по использованию высокомолекулярного гепарина в низкой дозе, как субстанции для создания лекарственной формы с целью профилактической, лечебной и восстановительной коррекции когнитивных нарушений, а также для профилактики отрицательных воздействий на человека неблагоприятных эколого-профессиональных и информационно-семантических условий.
Практическое значение имеют данные об улучшении состояния микроциркуляции в головном мозге и скелетных мышцах, ускорении репаративных процессов после курсового введения высокомолекулярного гепарина в низкой дозе.
Практическое значение имеют данные о снижении концентрации внимания и затруднении процессов торможения ошибочной деятельности у особей с исходно высоким уровнем когнитивных способностей после курсового введения пирацетама в дозах 40 и 260 мг/кг.
Экспериментальные данные о том, что дефенсин ингибирует неферментативный фибринолиз, обусловленный комплексными соединениями гепарина, могут служить обоснованием для создания лекарственной формы с антигеморрагическими и гемостатическими свойствами.
Практическое значение имеют данные о том, что с помощью информационной нагрузки можно усиливать действие фармакологических веществ. У экспериментальных животных, подвергавшихся информационной нагрузке после курсового введения высокомолекулярного гепарина, наблюдалась значительная пролонгация антикоагулянтного эффекта и антистрессорного действия гепарина, а после курсового введения физиологического раствора -усиление выраженности стрессорной реакции.
Практическое значение имеют данные о том, что курсовое введение физиологического раствора вызывает развитие устойчивого стрессорного состояния экспериментальных животных, что может быть использовано в качестве модели стрессорного состояния.
Гепарин в защитно-приспособительных реакциях организма
В медицинской практике натриевая соль гепарина занимает особое место в связи с немедленным антикоагулянтным эффектом, существованием антидота, легкостью управления дозой, отсутствием тератогенного и эмбриотоксического действий. Гепарин - эффективный, легко доступный и относительно недорогой препарат (Бицадзе В.О., Макацария А.Д., 2000; Бокарев И.Н., 2003; Bick R.L. et al., 2005).
Гепарин известен более 80 лет, он был открыт J. McLean в 1916 году. Гепарины - это гликозаминогликаны, состоящие из сульфатированных остатков Д-глюкозамина, Д-глюкуроновой, кетуроновой и идуроновой кислот, подверженных различной степени сульфатирования и повторяющихся в разной последовательности (рис. 3). В молекуле гепарина на тетрасахаратную единицу приходится по 5—6 сульфатных групп. Остатки серной кислоты присоединены к ОН-группам глюкозамина. Высокое содержание сульфогрупп обусловливает значительный отрицательный заряд всей молекулы и, следовательно, большую подвижность в электрическом поле. Около 10% аминогрупп гепарина находится в свободном состоянии, остальные сульфатированны. Десульфирование гепарина, происходящее в результате мягкого гидролиза, сопровождается уменьшением его антикоагулянтной активности (Wan J.G. et al., 2002). Это же явление наблюдается и при появления в молекуле гепарина свободных аминогрупп. Полная инактивация происходит, когда более половины азота присутствуют в форме свободных NH2-rpynn (Бокарев И.Н., 2003; Wan J.G. et al., 2002).
Коммерческие препараты для клинического применения получают из естественных источников - либо из тканей кишечника свиней, либо из лёгких крупного рогатого скота. Эти препараты очень гетерогенны как по молекулярной массе (от 1 000 до 42 000 дальтон), так и по антикоагулянтным и антитромботическим свойствам. В клинике применяют как высокомолекулярные, нефракционированные виды гепарина (ВМГ), так и низкомолекулярные гепарины (НМГ). Для приготовления НМГ производят деполимеризацию ВМГ химическим, H2COSO, COO H2COS03 H2COS03
Взаимодействие антитромбина III (AT III) с факторами Па, Ха и ІХа без гепарина и с гепарином. Не представлен фактор ХПа, который также инактивируется AT III (по Фред Дж. Шиффман, 2001). ферментным или радиохимическим методами (Бицадзе В.О., Макацария А.Д., 2000; Bick R.L. et al., 2005). Образующиеся НМГ проявляют значительные различия по физико-химическим и клиническим свойствам, по фармакологическому профилю. Данные, полученные по действию одного НМГ, не могут быть перенесены на другой НМГ (Bick R.L. et al., 2005). Молекулярная масса НМГ колеблется в зависимости от способа получения от 2000 до 6000 дальтон. Активность гепарина определяется по способности замедлять время свертывания крови и выражается в единицах действия, чаще в международных единицах - ME (Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Бокарев И.Н., 2003; Hirsh J., 1991; Bick R.L. et al., 2005).
Суточная доза гепарина не должна превышать 60-80 тыс ME. В профилактических целях для предупреждения тромбозов гепарин вводят под кожу живота по 5 тыс ME 2 раза/сут (Баркаган З.С., 2000; Бокарев И.Н., 2003). Режимы введения определяются целью лечения. Терапевтический эффект ВМГ достигается при увеличении активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) в 1,5-2,5 раза, по сравнению с нормой (Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1999; Бокарев И.Н., 2003; Bick R.L. et al., 2005).
Описана эффективность применения гепарина практически любыми существующими способами. В настоящее время имеются два общепринятых пути введения гепарина - внутривенное (постоянно капельно или прерывисто) и подкожное (Бокарев И.Н., 2003; Briant L, et al., 1989; Bick R.L. et al., 2005). He так давно стали применять пероральное введение и ингаляции (Евграфов В.Ю., 1999; Ceyhan В.В., 1997; Bick R.L. et al., 2005). Эффективно действие гепарина при внутримышечном и внутрибрюшинном введении (Bick R.L. et al., 2005).
Экзогенный гепарин достаточно быстро выводится из организма. Метаболизм НМГ и ВМГ происходит одинаково - под действием фермента (гепариназы) они подвергаются деполимеризации и десульфатированию. После деградации в печени, НМГ и ВМГ выводятся через почки (Frydman А., 1996; Samma М.М., Gerotziafas G.T., 2000). В отличие от ВМГ, клиренс НМГ не изменяется в зависимости от вводимой дозы. Различия в фармакокинетике между ВМГ и НМГ объясняются меньшей склонностью НМГ связываться с белками плазмы, а также с поверхностью эндотелиальных клеток (Баркаган З.С., 2000; Бокарев И.Н., 2003; Bick R.L. et al., 2005). Значительная часть вводимого ВМГ связывается с клетками крови, фибриногеном, фактором Виллебранда, фибронектином. Связывание ВМГ с эндотелиальными клетками сосудистой стенки повышает их отрицательный заряд и тромборезистентность (Баркаган З.С., 2000; Бокарев И.Н., 2003). Период полувыведения ВМГ из плазмы составляет 30-60 минут (Бокарев И.Н., 2003; Bick R.L. et al., 2005). В связи с этим, требуется частое введение препарата - не менее 2-х раз в сутки (Бицадзе В.О., Макацария А.Д., 2000; Бокарев И.Н., 2003). В сходных условиях НМГ находится в кровотоке гораздо длительнее. (Баркаган З.С., 2000; Бокарев И.Н., 2003).
Основная антикоагулянтная функция ВМГ заключается в том, что он ингибирует ферменты свёртывания в присутствии антитромбина III (рис. 4), а также ингибирует активацию протромбина и в отсутствие антитромбина III. Комплекс ВМГ с антитромбином III, фиксируясь на эндотелиальных клетках сосудов, стимулирует поступление в кровь тканевого тромбоцитарного фактора (TFPI) - ингибитора внешнего пути свертывания крови, содержание которого в кровотоке увеличивается на 20-40 % (Баркаган З.С., 2000). Введение ВМГ и НМГ действует и на функцию тромбоцитов - в терапевтических дозах ингибирует их агрегацию. Кроме того, ВМГ препятствует полимеризации фибрин-мономеров, воздействуя на фактор ХШа, а также облегчает выделение активатора плазминогена из эндотелиальных клеток, что в результате приводит к фибринолитическому эффекту. НМГ способны ингибировать функцию фактора Ха (Бокарев И.Н., 2003).
Физиологические методы
Автоматические методы исследования системы крови являются наиболее точными и менее трудоемкими. В настоящей работе использовали автоматический гематологический анализатор фирмы "Cobas-Argos" (Швейцария) с проточной системой, идентифицирующей различные виды клеток крови по размерам и особенностям окрашивания. Используя программу для исследования показателей крови крыс, определяли гематокрит, концентрацию гемоглобина в единице объема крови и среднее содержание гемоглобина в эритроците, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, средний объем эритроцитов и тромбоцитов. Кровь была защищена от свертывания добавлением антикоагулянта - калиевой соли ЭДТА (этилендиаминтетраацетат) (Кузник Б.И., 2004).
Для измерения локального кровотока в сенсомоторной коре мозга крыс наркотизировали эфиром. Измерение осуществляли с помощью платиновых микроэлектродов, методом водородного клиренса, заключающемся в регистрации кривой очищения ткани от водорода. Водород вводили ингаляционно (на морду крысы надевали специальную маску, с помощью которой подавалась смесь из 1,5 воздух + 0,5 водород л/мин). Платиновые электроды имели следующие параметры: толщина проволоки ОД мм, диаметр кончика 2-Ю мкм, изолированы по всей длине винифлексным лаком. Индифферентный электрод размещали в области хвоста.
Микроэлектроды устанавливали в отверстие теменной кости черепа диаметром 0,9 мм с координатами A3 L3 (Буреш Я. с соавт., 1962; Буреш Я. с соавт., 1991) вплоть до Dura-Mater и погружали на глубину 0,5-0,8 мм в сенсомоторную область коры (Демченко И.Т., 1976; Буреш Я. с соавт., 1991). Контроль за качеством установки микроэлектрода осуществляли по регистрации спайковой активности нейронов коры. Затем электрод закрепляли на черепе животного с помощью зубных пластмасс. Полярографическая установка LP7e (Чехия) включала усилитель с R входа 1 Гом, с коэффициентом усиления по постоянному току до 100, с коэффициентом по переменному току до 105 , графопостроитель со скоростью перемещения по оси X 1 мм/с. Определение кровотока по кривой клиренса производили по формуле f=M093xl00]/T1/2 мл/100 г/мин, где X - парциальный коэффициент распределений ткань-кровь (А, = 1), Т л-время, в течение которого начальное значение клиренса уменьшается в 2 раза (Демченко И.Т. 1976; Буреш Я. с соавт., 1991).
Порог болевой чувствительности определяли в полуавтоматическом режиме по латентному периоду (ЛП) ноцицептивной (болевой) реакции отдергивания хвоста при термическом раздражении кожи пучком света. Данный тест является наиболее излюбленным методом при определении аналгетических эффектов различных фармакологических веществ (Калюжный Л.В., 1984; Hole К, Tjolsen А.. 1993). Идея метода принадлежит D Amour F.E. и Smith D.L. (1941).
Крысу помещали в специальный светонепроницаемый бокс так, чтобы хвост находился вне этого бокса. Тестирование болевой чувствительности, производили анальгезиметром "Analgesiaest" фирмы "Hugo Sachs Elektronik" (Германия) при интенсивности светового луча, соответствующей 6 по шкале установки, который направляли на хвост крысы, на расстоянии 1/3 от корня хвоста. Время отдергивания хвоста автоматически фиксировалось. Температура теплового раздражения была 54С. После проведения экспериментов животные не испытывали дискомфорта, кожа в месте термического раздражения не отличалась от других участков кожи хвоста, так как абсолютные пороги возбуждения рецепторов меньше тех, которые вызывают субъективно переживаемые ощущения.
Для оценки действия высокомолекулярного гепарина (64 и 640 МЕ/кг), пирацетама (40 и 260 мг/кг) и физиологического раствора (0,3 мл) использовали модифицированную методику tail-flick. Видоизменение теста "tail-flick", заключалось в выработке у каждого животного стабильной реакции отдергивания хвоста в ответ на болевое воздействие. С этой целью, до начала введения изучаемых препаратов, утром, в 10 ч, и вечером, в 17 ч. определяли ЛП реакции отдергивания хвоста, проводя по 10 последовательных термических раздражений, предъявляемых каждому животному в группе с периодичностью 60 секунд.
При устойчивости ответа в течение трех дней проводили 5-кратное введение исследуемых веществ в течение 5 дней, 1 раз в день. После инъекций физиологического раствора, гепарина или пирацетама измерения ЛП реакции отдергивания хвоста производили через 1, 7 и 24 ч. После окончания введения изучаемых агентов наблюдения проводили утром в 10 ч и вечером в 17 ч, в течение 5 дней. Тестирование осуществляли на фоне пищевой депривации. Пищевая депривация (лишение пищи) составляла 23 ч, доступ к воде был свободным.
Выработка пищедобывательного условного рефлекса в радиальном лабиринте Использовали 12-ти лучевой радиальный лабиринт в модификации Буреш Дж. с соавт. (1991). Радиальный лабиринт состоял из открытого поля -пластмассовой платформы (диам. 1,5 м), приподнятой над полом (на 90 см) и огороженной пластмассовой перегородкой (высотой 50 см). В середине открытого поля расположена меньшая, внутренняя платформа (диам. 42 см), в центре которой имеется отверстие. По окружности внутренняя платформа огорожена от открытого поля пластмассовой перегородкой высотой 50 см. Перегородка имеет 12 плоскостей, в каждой из которых имеется круглое отверстие. От каждого из 12-ти отверстий начинается один из каналов (лучей, рукавов) лабиринта, которые изготовлены из непрозрачной черной пластмассы. В канал можно войти только из внутреннего поля лабиринта, поскольку на входе канала подвешены дверцы, открывающиеся только в одну сторону - внутрь канала. Выходная дверь канала открывается только наружу - в открытое поле лабиринта. Выход из внутреннего поля лабиринта может быть осуществлён по любому из 12-ти каналов. Выйдя из канала, животное может свободно передвигаться в открытом поле. Чтобы вновь попасть во внутреннее поле, ко входам в каналы, крыса должна пройти в центр и подняться через внутреннее отверстие центральной платформы. Затем она могла вновь попасть в любой из каналов лабиринта. Открытое, внешнее поле лабиринта не связано с пищевым подкреплением. Крысы могли получать пищу только в каналах. Семечки подсолнуха раскладывали для каждого животного по каналам-рукавам непосредственно перед опытом. В течение опыта семечки не подкладывали (рис. 5) (Буреш Дж. с соавт., 1991).
Определение в динамике курсового воздействия высокомолекулярного гепарина на цитометрические параметры крови крыс Вистар
Целью данного раздела работы было изучение в динамике воздействия курсового введения высокомолекулярного гепарина (ВМГ, в дозах 64 и 640 МЕ/кг) на гематологические параметры крови экспериментальных животных, не подвергавшихся воздействию информационной нагрузки, и после обучения в радиальном и многоальтернативном лабиринтах, а также сравнение эффектов ВМГ с эффектами растворителя - физиологического раствора (ФР) и пирацетама (в дозах 40 и 260 мг/кг).
Количественный состав и морфология клеток крови у теплокровных животных и человека в норме характеризуются достаточно высокой стабильностью, которая связана с постоянством действия регуляторных механизмов (Шиффман Ф.Дж., 2001). У половозрелой крысы, так же, как и у человека, форменные элементы крови занимают 36-48 %, а плазма- 64-52 %. Это соотношение получило название гематокрита. Для характеристики гематокрита указывают объем плотной части (клеток) крови (Гольдберг Д.И., Гольдберг Е.Д., 1975; Судаков К.В., 2000).
Основные функции эритроцитов связаны с наличием в их составе белка -гемоглобина (хромопротеид). Во многих клиниках определяют не только цветовой показатель (общий гемоглобин), но и среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците (Козинец Г.И., Макарова В.А., 1997; Шиффман Ф.Дж., 2001; Кузник Б.И., 2004).
Использовали те же группы экспериментальных животных, что и в предыдущем разделе. Различие состояло в том, что в данном и во всех последующих разделах работы все инъекции производили только внутримышечно. В каждой группе было по 20 крыс, содержащихся в отдельных клетках по 10 особей.
Оценивали следующие основные цитометрические показатели: число лейкоцитов, число эритроцитов, число тромбоцитов, гематокрит, общий гемоглобин, среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците, средний объем эритроцита, средний объем тромбоцита.
Цитометрические параметры крови регистрировали в динамике - через 10 и 60 мин, 1 и 20 сут после последнего, пятого введения препаратов у крыс, не подвергавшихся обучению и через 10 мин после окончания двадцатидневного обучения в радиальном и многоальтернативном лабиринтах.
Как видно из таблиц 14-19, после курсового введения ФР, у крыс, не подвергавшихся обучению, наблюдались следующие изменения цитометрических параметров крови:
Через 10 мин - достоверное повышение содержания гемоглобина в 1 эритроците на 37%, среднего объема эритроцита на 15% и среднего объема тромбоцита на 10%, по сравнению с группой интактных крыс (табл. 14).
Через 60 мин - кроме указанных выше изменений, отмечалось_снижение числа эритроцитов на 13%, а соответственно и гематокрита на 11% (Р 0,05) (табл. 15).
Через 1 сут наблюдалось достоверное повышение содержания гемоглобина в 1 эритроците на 29%, среднего объема эритроцита на 10% и среднего объема тромбоцита на 7% (табл. 16).
Через 20 сут ни один из гематологических показателей автоматического гематологического анализа не отличался от значений группы интактных крыс (Р 0,05) (табл. 17). В те же сроки, но после обучения в многоальтернативном лабиринте крыс, получавших инъекции ФР, отмечено достоверное повышение числа тромбоцитов на 20%, гематокрита на 5%, а также среднего содержания гемоглобина в одном эритроците на 51%, среднего объема эритроцита на 20% и среднего объема тромбоцита на 20%, по сравнению с группой интактных крыс (табл. 18). При обучении в радиальном лабиринте грызунов, которым вводили ФР, кроме увеличения среднего содержания гемоглобина в одном эритроците, среднего объема эритроцита и среднего объема тромбоцита, в отличие от группы животных, обучавшихся в многоальтернативном лабиринте, отмечено достоверное снижение числа эритроцитов на 15%, числа тромбоцитов на 20% (Р 0,05) (табл. 19).
После курсового введения ВМГ в дозах 64 и 640 МЕ/кг, у крыс, не подвергавшихся обучению, наблюдались следующие изменения цитометрических параметров крови:
Через 10 мин обе дозы ВМГ вызывали лишь достоверное повышение числа лейкоцитов на 18 и 16% (64 и 640 МЕ/кг соответственно), остальные гематологические показатели не отличались от значений группы интактных крыс (табл. 14).
Через 60 мин отмечались те же изменения, что и в предыдущем случае (табл. 15).
Через 1 и 20 сут не отмечалось отличий гематологических параметров от значений группы интактных крыс (Р 0,05) (табл. 16,17).
Через 20 сут, при обучении в радиальном и многоальтернативном лабиринтах животных, которым вводили ВМГ в дозах 64 и 640 МЕ/кг, все гематологические показатели были сходны со значениями группы интактных крыс (Р 0,05) (табл. 18,19).
После курсового введения пирацетама в дозах 40 и 260 мг/кг, у крыс, не подвергавшихся обучению, наблюдались следующие изменения цитометрических параметров крови:
Через 10 мин после инъекций пирацетама в дозе 40 мг/кг, ни один из гематологических показателей не отличался от значений группы интактных крыс. Тогда как у крыс, получавших инъекции пирацетама в дозе 260 мг/кг наблюдалось небольшое, но достоверное снижение числа эритроцитов на 6% (табл. 14).
Через 60 мин отмечено дозозависимое снижение числа эритроцитов на 8 и 9% (40 и 260 мг/кг соответственно), по сравнению с группой интактных крыс (Р 0,05) (табл. 15).
Через 1 сут после инъекций пирацетама в дозе 40 мг/кг, ни один из гематологических показателей не отличался от значений группы интактных крыс. Тогда как у крыс, получавших инъекции пирацетама в дозе 260 мг/кг наблюдалось небольшое, но достоверное снижение числа эритроцитов на 6% (Р 0,05) (табл. 16).
Влияние высокомолекулярного гепарина на цитофизиологическое состояние тучных клеток соединительной ткани крыс Вистар
В настоящем исследовании установлено, что вследствие внутривенного введения тканевого тромбопластина (0,5-0,6 мл) и ответной лавинообразной генерации тромбина происходила активация функции противосвертывающей системы, о чем свидетельствовало повышение суммарной (на 79%) и неферментативной (на 138%) фибринолитической активности плазмы крови, снижение уровня фибриногена (на 65%) (табл. 22). Введение дефенсина в дозах 125 мкг/кг и 1,25 мг/кг на фоне активации функции противосвертывающей системы, способствовало достоверному снижению суммарной (в 1,5 и 2,5 раза соответственно) и неферментативной (в 1,7 и 3,9 раза соответственно) фибринолитической активности плазмы (табл. 22). Повышение концентрации свертываемого тромбином фибриногена (в 3,7-3,9 раза соответственно) в этот период указывало на блокирующий эффект дефенсина в отношении комплексов гепарина с белками крови и, в частности, с фибриногеном вследствие чего исчезало присущее комплексам гепарина антиполимеризационное действие и концентрация фибриногена, свертываемого тромбином, увеличивалась (Ляпина Л. А. с соавт., 1979). Следовательно, дефенсин оказывал влияние на неферментативный фибринолиз и антикоагулянтные свойства плазмы крови, обусловленные комплексными соединениями эндогенного гепарина.
О характере взаимодействия дефенсина и гепарина судили по результатам перекрестного электрофореза ВМГ в концентрациях 0,032 и 0,064 МЕ/мл и дефенсина в концентрациях 10 7 и 10"9 М. В месте пересечения этих веществ отмечено исчезновение окраски на кислые группы ВМГ, что свидетельствовало об образовании устойчивого комплекса ВМГ-дефенсин (рис. 10). Следовательно, есть все основания предполагать, что процесс комплексообразования гепарин-дефенсин происходит в организме животных.
Таким образом, на основании данных этой серии опытов можно считать, что при депрессии функции противосвертывающей системы дефенсин не усугубляет это состояние, влияя лишь на гепарин и его комплексные соединения. Уровень гепарина уменьшался, по-видимому, вследствие взаимодействия дефенсина с гепарином, который освобождался из его неферментативных комплексов с белками и аминами. Доказательством взаимодействия высокомолекулярного гепарина с дефенсином послужили эксперименты, проведенные методом перекрестного электрофореза. Дефенсин, наряду с противомикробными свойствами, ингибирует неферментативный фибринолиз, что позволяет считать его перспективным средством для создания лекарственной формы для борьбы с кровотечениями.
Подводя итог данному разделу работы, следует отметить, что: Дефенсин, вводимый экзогенно, влияет на гепарин и его комплексные соединения в организме экспериментальных животных. В условиях in vitro, высокомолекулярный гепарин образует комплексные соединения с дефенсином. Воздействие курсового введения высокомолекулярного гепарина и дефенсина на процессы репарации асептической кожной раны
Цель исследования - определение влияния курсового внутримышечного введения высокомолекулярного гепарина (ВМГ, 64 и 640 МЕ/кг) и дефенсина (125 мкг/кг) на процессы репарации асептической кожной раны у крыс Вистар; сравнение эффектов ВМГ и дефенсина с эффектами растворителя -физиологического раствора (ФР)
Через 24 ч после последнего введения ВМГ, пирацетама и ФР, в стерильных условиях производили нанесение полнослойной кожной раны в области спины. Длина раны составляла 10 мм, рану покрывали коллодием. Длина и месторасположения раны были всегда постоянны. О скорости репаративного
После курсового введения ВМГ в дозе 64 МЕ/кг, начиная с третьих суток, процесс заживления полнослойной кожной раны происходил наиболее быстро, по сравнению со всеми остальными группами, тогда как после курсового введения физиологического раствора - наиболее медленно (Р 0,5). Скорость заживления асептической кожной раны после курсового введения гепарина в дозе 640 МЕ/кг во все изучаемые сроки достоверно не отличалась от таковой у группы интактных крыс. Дефенсин в дозе 125 мкг/кг стимулировал процесс заживления полнослойной кожной раны, начиная с 5-х сут (Р 0,5), совпадая в дальнейшие сроки со скоростью репаративных процессов, наблюдавшихся после введения ВМГ в дозе 64 МЕ/кг (табл. 23).
Таким образом, скорость процессов репарации под действием курсового введения высокомолекулярного гепарина в дозе 64 МЕ/кг и дефенсина в дозе 125 мкг/кг была сходной. Представляется возможным использование высокомолекулярного гепарина в дозе 64 МЕ/кг и дефенсина в дозе 125 мкг/кг для создания лекарственных форм для ускорения заживления ран.
