Введение к работе
Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания, в частности, ишемическая болезнь сердца (ИБС), представляют собой одну из основных причин преждевременной смертности населения экономически развитых стран (Харченко ). Морфологической основой ИБС более чем в 95% случаев является атеросклероз коронарных артерий (Чазов, 1997). Согласно общепринятому мнению, в основе атерогенеза лежат воспалительные и аутоиммунные реакции, развивающиеся в стенке артерий на фоне нарушения липидного обмена и повреждения эндотелия. Воспаление сопровождается накоплением лейкоцитов в интиме и продукцией широкого спектра цитокинов и других биологически активных веществ, способствующих формированию атеросклеротического поражения. Обострение воспалительного процесса в атеросклеротической бляшке может вызвать ее повреждение и последующий тромбоз, что проявляется клинически как острый коронарный синдром. При атеросклерозе, как и при системных воспалительных заболеваниях, в кровотоке увеличивается содержание белков острой фазы и цитокинов, появляются активированные лейкоциты и тромбоциты. В клинических исследованиях у пациентов с ИБС выявлена связь между высокой концентрацией «маркеров» воспаления в крови и негативным прогнозом заболевания (Ross, 1999; Libby, 2000; Hansson, Libby, 2006).
Ключевую роль в инициировании и поддержании воспалительного процесса в стенке сосуда играют моноциты. В атероме моноциты дифференцируются в пенистые клетки, нагруженные липидами, и в макрофаги, участвующие в иммунных реакциях и продуцирующие воспалительные медиаторы. Многие из этих веществ оказывают хемотаксическое и митогенное действие на гладкомышечные клетки сосудистой стенки, повреждающее действие на эндотелий, способствуя локальной вазоконстрикции и пристеночному тромбообразованию. Помимо моноцитов в «зрелых» атеросклеротических бляшках обнаружены клетки адаптивного иммунитета, среди которых преобладают Т-хелперные клетки 1 типа. Т-лимфоциты «узнают» аутоантигены (окисленные липопротеиды низкой плотности, белки теплового шока и др.), представленные макрофагами и дендритными клетками, и продуцируют цитокины, в частности, интерферон-, которые вызывают активацию моноцитов, лимфоцитов и гладкомышечных клеток, стимулируют продукцию хемокинов и способствуют дальнейшему привлечению лейкоцитов в стенку сосуда (Andersson et al., 2010).Регуляторные Т-клетки являются основной субпопуляцией Т-лимфоцитов, угнетающих реактивность эффекторных клеток иммунной системы в отношении собственных и чужеродных антигенов (Ярилин, 2007). В ряде исследований, выполненных на животных, доказана «антиатерогенная» роль регуляторных Т-клеток (Mallat et al., 2003; et al., 2007; Ait-Oufella et al., 2006; et al., 2009). Оценка состояния данного звена клеточного иммунитета при атеросклерозе у человека и анализ терапевтического потенциала иммуномодуляторных воздействий при ИБС являются на сегодняшний день задачами исследований ведущих мировых лабораторий.
Воспаление является неотъемлемым звеном восстановления целостности ткани при ее повреждении, в том числе при ишемическом некрозе миокарда. Современные достижения в лечении больных с инфарктом миокарда связаны с разработкой способов быстрого восстановления кровотока в коронарной артерии. Клинических подходов, действующих на процесс восстановления миокарда, на сегодняшний день нет. Моноциты/макрофаги необходимы для ранозаживления. Благодаря способности к фагоцитозу эти клетки принимают участие в очищении раны от продуктов распада ткани. Основной вклад моноцитов/макрофагов в восстановление тканей заключается в продукции широкого спектра цитокинов и факторов роста; эти медиаторы вызывают хемотаксис и пролиферацию фибробластов, эндотелиальных клеток, синтез белков внеклеточного матрикса и т.о. играют триггерную роль в репарации ткани (Wahl, 1985; Barbul, 1990). Подавление воспалительной реакции в поврежденном миокарде может привести к несостоятельности рубца и образованию аневризмы. С другой стороны, чрезмерная воспалительная реакция может оказать дополнительное повреждающее действие на миокард (Matsui et al., 2010). Таким образом, модулирование воспаления дает уникальную возможность для оптимизации процесса заживления и предупреждения отрицательного ремоделирования желудочка сердца в отдаленные сроки после инфаркта.
Выход лейкоцитов из кровотока и миграция в тканях - многоступенчатый процесс, зависящий от уровня активации клеток цитокинами и особенностей их взаимодействия с другими клетками и белками межклеточного матрикса (Fabbri et al., 1999). Молекулы адгезии лейкоцитов способны связываться с лигандами эндотелиальных и гладкомышечных клеток, фибробластов, тромбоцитов, с сывороточными белками и белками внеклеточного матрикса. Наиболее значимую роль в миграции лейкоцитов в очаг воспаления/повреждения тканей играют специфические для лейкоцитов 2-интегрины, т.к. они взаимодействуют с поверхностными молекулами эндотелия и тромбоцитов, а также с фибрин(оген)ом (Hynes, 1992). Способность мигрирующих клеток преодолевать барьеры из белков внеклеточного матрикса зависит от активности протеолитических ферментов на поверхности клеток. Система активации плазминогена, которая включает плазминоген, активаторы и ингибиторы плазминогена, а также связывающие их поверхностные белки и рецепторы, играет центральную роль в клеточной инвазии (Andreasen et al., 2000). Направление движения лейкоцитов в тканях определяется градиентом концентрации хемотаксических цитокинов – хемокинов.
Семейство хемокинов объединяет ряд небольших по молекулярной массе (около 10 кДа) оснвных белков. Хемокины вырабатываются практически всеми типами клеток и контролируют миграцию лейкоцитов в условиях гомеостаза (распределение клеток в лимфоидных органах) и при воспалении. Помимо хемоаттрактантных свойств хемокины участвуют в активации клеток, сопровождающейся продукцией активных форм кислорода, цитокинов и протеолитических ферментов, влияют на апоптоз и другие клеточные процессы. Действие хемокинов опосредовано Gi-белок сопряженными рецепторами. Для стимуляции хемотаксиса клеток в условиях крово - и лимфотока необходимо создание концентрационного градиента хемокинов за счет их связывания с гликозаминогликанами (ГАГ), гепарином/гепарансульфатом, на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса. В связи с этим, молекулы, препятствующие связыванию хемокинов с ГАГ, также могут оказывать влияние на миграцию лейкоцитов in vivo (Baggiolini, 1998; Murdoch, Finn, 2000; Mackay, 2001;Handel et al., 2005).
Моноцитарный хемотаксический белок – 1 (МСР-1) является ключевым хемокином в приложении к хроническому воспалительному процессу, в частности, атерогенезу (Weber C et al., 2004; 2008). МСР-1 продуцируется в очаге воспаления различными типами клеток, основной мишенью МСР-1 являются моноциты, МСР-1 также стимулирует миграцию активированных лимфоцитов и эндотелиальных клеток (Boring et al., 1998). Ведущая роль МСР-1 в формировании атеросклеротических поражений продемонстрирована в экспериментах с использованием мышей, «нокаутированных» по генам МСР-1 или его рецептора CCR2, а также при введении животным блокирующих МСР-1 антител (Boring et al., 1997; Kuziel et al., 1997; Kurihara et al., 1997; Gu et al., 1998, Dawson et al., 1999). В ряде клинических исследований подтверждена неблагоприятная прогностическая роль высокого содержания МСР-1 в крови в развитии осложнений ИБС, показана связь повышенного уровня циркулирующего МСР-1 с «надрывом» атеросклеротической бляшки у пациентов с острым коронарным синдромом (Kang et al., 2007). Получены генетические подтверждения участия МСР-1 в обострении ИБС – гаплотип с аллелью гена МСР-1 -2518G оказался ассоциирован с увеличенным риском развития инфаркта миокарда (Tabara et al., 2003). Значительная роль МСР-1 в инициировании и поддержании воспаления стимулировала исследования по получению антагонистов МСР-1 и его рецептора ССR2 (Alegretti et al., 2012). В настоящее время ведущими научно-исследовательскими лабораториями и фармакологическими компаниями разрабатываются препараты на основе химических антагонистов рецептора МСР-1, антител к МСР-1 и его рецептору, мутантных форм МСР-1, а также пептидных фрагментов хемокина. Некоторые из них прошли или проходят клинические испытания у пациентов с системными аутоиммунными воспалительными заболеваниями, однако данные о позитивном клиническом эффекте их применения пока не опубликованы.
Цель настоящего исследования состояла в определении молекулярных мишеней для воздействия на миграцию лейкоцитов при сердечно-сосудистой патологии, в получении веществ с активирующим и ингибирующим действием на клеточную подвижность.
Задачи исследования включали следующее.
-
Анализ клеточного состава и спектра цитокинов, экспрессируемых в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека. Определение содержания хемокина МСР-1 в крови больных ишемической болезнью сердца.
-
Оценка фенотипа мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при ИБС. Идентификация циркулирующих активированных эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитов. Изучение экспрессии моноцитами крови молекул адгезии и компонентов фибринолитической системы.
-
Оценка роли молекул из семейства 2-интегринов в адгезии и миграции моноцитов в присутствии МСР-1.
-
Изучение внутриклеточных каскадов, активируемых хемокинами и участвующих в миграции моноцитов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток.
-
Тестирование пептидных фрагментов МСР-1 по их влиянию на миграцию клеток in vitro и in vivo у различных экспериментальных животных. Изучение механизма действия пептидных фрагментов на клеточную подвижность. Оценка возможности использования целевых пептидов в клинической практике.
Научная новизна и практическая значимость работы. Основные результаты исследования имеют приоритетный характер. Методами прямой иммунофлуоресценции и поточной цитометрии исследован фенотип лейкоцитов, выделенных из атеросклеротических бляшек коронарных артерий человека; с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) выполнен комплексный анализ экспрессии генов цитокинов, в том числе хемокинов, в атеросклеротических бляшках, обнаружена мРНК маркерного для регуляторных Т-клеток белка foxp3. У пациентов с ИБС показано увеличение содержания активатора плазминогена урокиназного типа (урокиназы) в крови и на мембране циркулирующих моноцитов, при нестабильной стенокардии выявлено повышение концентрации МСР-1 в плазме. Получены данные об отрицательной связи между количеством циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов и степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий. С использованием выделенных из крови доноров моноцитов, лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, эндотелиальных клеток пупочной вены человека, а также клеточных линий и их клонов, различающихся по уровню экспрессии лейкоцитарных 2-интегринов, изучены механизмы хемокин-стимулированной миграции клеток, определены «критические» участники среди молекул адгезии и внутриклеточных сигнальных молекул. Показано, что ведущую роль в МСР-1-зависимой миграции моноцитов на фибриногене играют 2-интегрины CD11c/CD18, в то время как молекулы СD11b/CD18 ответственны за прочное прикрепление клеток к данному матриксу. Обнаружено, что сигнальные каскады, участвующие в миграции клеток в присутствии МСР-1, различаются в моноцитах и эндотелиальных клетках: в хемотаксисе моноцитов задействована митоген-активируемая киназа р38 и киназы семейства src, подвижность эндотелия контролируется фосфатидилинозитол-3-киназой и митоген-активируемыми киназами р42/44 (ERK1/2). Выявлено ингибирующее действие блокатора протеинкиназы mTOR рапамицина на миграцию CD4+лимфоцитов, находящихся в стадии бласттрансформации. По действию на клеточную подвижность в культуре протестировано 15 пептидных фрагментов, соответствующих различным участками первичной структуры молекулы МСР-1; выбраны пептиды с МСР-1-ингибирующим (65-76, пептид Х) и стимулирующим (29-40, пептид IX) действием на миграцию моноцитов in vitro. Противовоспалительная активность пептида Х (Инграмона) продемонстрирована в моделях у грызунов и приматов, а также при введении пациентам с ИБС. Определен механизм подавления миграции клеток в присутствии пептида Х: он связан с вытеснением хемокинов, в частности МСР-1 и ИЛ-8, с сайтов связывания с ГАГ. Показано, что пептид IX стимулирует миграцию моноцитов in vivo, способствует ранозаживлению и обладает кардиопротекторным действием при введении в зону инфаркта у экспериментальных животных.
Результаты исследования способствуют получению новых знаний о механизмах атерогенеза. На основании данных об изменении субпопуляционного состава лимфоцитов крови при ИБС, коронарном атеросклерозе, возможна разработка диагностической системы для выявления пациентов с увеличенным риском прогрессии заболевания. Исследования механизмов миграции лейкоцитов и получение препаратов, влияющих на клеточную подвижность, могут лежать в основе новых подходов к лечению больных ИБС, связанных с регуляцией поступления клеток в очаг воспаления.
Апробация диссертационной работы состоялась 28 марта 2013г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. Диссертация рекомендована к защите.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. Получено 2 патента на изобретение. Различные разделы исследования были представлены и опубликованы в виде тезисов докладов на отечественных и зарубежных конгрессах, в том числе: International Society of Thrombosis and Hemostasis Meeting (1997), ESC (European Society of Cardiology) Congress (1997, 2004, 2010), Xth World Congress of Heart Failure (1997), 70th Congress of European atherosclerosis Society (1998), Annual Scientific Meeting of the British Society for Hematology (1998), 8th International Congress on Cardiovascular Pharmacotherapy (1999), European Meeting on Hypertension (1999, 2004a, 2004b, 2005, 2006a, 2006b, 2009a, 2009b), 16th International Congress on Thrombosis (2000), International Congress on Coronary Artery Disease (2000, 2009), Симпозиум «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза (2000), Abstracts of International Young Medics’ Conference “Young Doctors on the threshold of the third Millennium” (2001), XXXVIII European Renal Association Congress (2001), International Symposium “Biological motility: new trends in research” (2001), Российский Национальный Конгресс Кардиологов (2003), Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (2003, 2005), Bioscience (2006), Российский симпозиум “Белки и пептиды” (2007a, 2007б, 2009, 2009б, 2011, 2013), Симпозиум “Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств” (2008), 20th European Meeting on Hypertension and Cardiovascular prevention (2010), 81 EAS (European Atherosclerosis Society) Congress (2013).
Структура работы. Диссертация изложена на …… страницах, содержит 20 таблиц и 55 рисунков, состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы.
![Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс]](/i/i/4438/203060.png "Влияние способа введения холерного вибриона и его токсина на формирование и цитокиновую регуляцию местного иммунитета [Электронный ресурс] Омельченко Наталья Дмитриевна")
