Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Ядерная оболочка 12
1.1.1. Строение и функция, ядерной оболочки 12
1.1.2. Ядерная оболочка и генетические заболевания человека 15
1,2 Ядерные поровые комплексы 17
1.2.1. Ультраструктура ядерных поровых комплексов 17
1.2.2. Биохимический состав ядерных пор 20
1.2.3. Механизмы транспорта молекул через ядерную пору 22
1.3. Эндоплазматический ретикулум и его связь с ядерной оболочкой 25
13.1. Структурная организация и функциональная роль эндоплазматического ретикулума в клетке 25
1.3.2. Формирование эндоплазматического ретикулума и его реорганизация при различных условиях 27
1.3.3. Миелиноподобные структуры 29
1.3.4. Пористые пластинки — компонент эндоплазматического ретикулума, содержащий цитоплазматические поры 30
1.3.4.1. Пористые пластинки- специфические органеллы высоко активных клеток....30
1.3.4.2. Взаимодействие пористых пластинок с внутриклеточными органеллами 31
1.3.4.3. Сравнительный анализ структурной организации и белкового состава пористых пластинок и ядерной оболочки 32
1.3.4.4. Возможные механизмы формирования цитошшматических пор 33
1.3.4.5. Возможная функциональная роль пористых пластинок в клетке 35
1.4. Механизмы сборки-разборки ядерных и цитоплазматических пор в митозе 36
1.4.1. Характеристика основных событий клеточного цикла 36
1.4.2. Динамика ядерной оболочки е процессе митоза 37
1.4.3. Реорганизация ядерных и цитоплазматических пор в клеточном цикле 40
1.5. Ооциты амфибий как удобная модель для изучения сборки ядерной оболочки в растущих
неделящихся клетках , 43
1.5.1. Особенности организации ооцитов амфибий и их отличие от других клеток 43
1.5.2. Характеристика различных стадий оогенезау амфибий 44
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 49
2.1. Объекты исследования и условия их содержания 49
2.2. Метод выделения ооцитов и микроинъекции в ооциты 49
2.3. Инкубация ооцитов с латруикулином '. 50
2.4. Фиксация и окраска ооцитов для флуоресцентной и конфокальной микроскопии 50
2.5. Фиксация и заливка ооцитов для электронно-микроскопического анализа 51
2.6. Модификация метода фиксации и заливки ооцитов для выявления внутриядерных актиновых филаментов на ультраструктурном уровне 52
2.7. Получение, окрашивание и исследование полутошшх и ультратонких срезов 53
2.8. Морфометрический анализ электронно-микроскопических изображений 53
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.. 56
3,1. Особенности ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях оогепеза 56
3.1.1. Сравнительный анализ ультраструктурной организации ооцитов наразных стадиях оогеиеза 56
3.1.2. Динамика эндоплазматического ретикулума в развивающихся ооцитах амфибий: электронно-микроскопический и морфометрический анализ 62
3.1.3. Структурная организация и локализация миелиноподобных структур в цитоплазме ооцитов. Последовательные стадии декомпактизации миелиноподобных структур в мембраны гладкого эндоплазматического ретикулума 66
3.1.4, Морфология и динамика пористых пластинок в цитоплазме ооцитов амфибий 74
3.2, Динамика ядерной оболочки в процессе развития ооцитов 77
3.2.1. Структурная организация ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий 77
3.2.2. Сборка ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в процессе роста ооцитов амфибий 82
3.2.2.1. Ультраструктурная характеристика процесса сборки ядерной оболочки со стороны цитоплазмы 82
3.2.2.2. Ультраструктурная характеристика процесса сборки ядерной оболочки со стороны ядра 86
3.2.2.3. Нарушение сборки ядерной оболочки при инъекции в ооциты антител к нуклеопорину рб2 90
3.3. Взаимосвязь ядерной оболочки ооцитов ксенопуса с актин-содержащими компонентами
ядерного матрикса 92
3.3.1. Выявление внутриядерных актин-содержащих филаментов с помощью флуоресцентной и просвечивающей электронной микроскопии 92
3.3.2. Исследование влияния латрункулина, разрушающего актиновые филаменты, на ультраструктуру ооцита 98
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ 103
4.1, Участие мембранных компонентов цитоплазмы ооцита амфибий в сборке ядерной оболочки 1.03
4.1.1. Реорганизация и функциональная роль эндоплазматического ретикулума в развивающемся ооците 103
4.1.2. Миелиноподобные структуры как возможный источник мембран вранных ооцитах амфибий 107
4.1.3. Возможная роль пористых пластинок в формировании ядерной оболочки и модель взаимодействия этих внутриклеточных органелл 111
4.2, Новый механизм сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках 115
4.2.1, Сходство иразличия сборки ядерной оболочки вмитотически делящихся и
растущих неделящихся клетках 115
4.2.2. Сборка ядерной оболочки в ооцитах амфибий какмоделъ формирования ее
компонентов в интерфазных ядрах соматических клеток 119
4.3, Внутриядерный актин и его взаимосвязь с ядерной оболочкой 120
Заключение 124
Глава 5. ВЫВОДЫ 126
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 127
- Ядерная оболочка
- Объекты исследования и условия их содержания
- Особенности ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях оогепеза
- Участие мембранных компонентов цитоплазмы ооцита амфибий в сборке ядерной оболочки
Введение к работе
Актуальность проблемы. Отличительной особенностью эукариот является наличие ядра и ядерной оболочки, обеспечивающей отделение генетического аппарата клетки. Ядерная оболочка является не просто структурным барьером, но и важной функциональной органеллой, дефекты организации которой приводят к серьезным заболеваниям человека (Worman, Courvalin, 2000; Somech et al., 2005). Поэтому исследование структуры, функции ядерной оболочки и ее динамики в ходе клеточного развития является одной из актуальных задач современной биологии.
Расположенные в ядерной оболочке ядерные поровые комплексы выполняют ключевую роль в обеспечении активного и пассивного транспорта различных молекул между ядром и цитоплазмой (Smythe et al., 2000; Adam, 2001; Fahrenkrog, Aebi, 2003). Процессы сборки-разборки ядерной оболочки и ядерных пор в делящихся клетках достаточно хорошо исследованы в условиях in vitro и in vivo в митозе (Zatsepina et al., 1977; Marshal, Wilson, 1997; Goldberg et al., 1997; Burke, EUenberg, 2002). Однако вопрос о том, каким образом формируются новые участки ядерной оболочки с ядерными порами на стадии интерфазы, когда в ней уже присутствуют зрелые поры и ламина, практически не исследован. Выяснение механизмов этого процесса требует детального анализа структурной организации, функции и динамики ядерной оболочки и ее составных компонентов с использованием комплекса различных методов. Одной из наиболее удобных моделей для исследования этого вопроса являются ооциты амфибий. Ядро развивающегося ооцита существенно увеличивается в размере, не претерпевая'деления, соответственно, растет и ядерная оболочка. Эта особенность, в сочетании с крупными размерами клетки, определяет преимущество ооцита как подходящего объекта для изучения механизмов формирования ядерной оболочки.
Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы исследовать механизмы сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий и определить возможное участие внутриклеточных структур в этом процессе.
Для осуществления заданной цели были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить ультраструктурную организацию ооцнтов амфибий на разных
стадиях их развития.
2. Провести морфологический и морфометрический анализ динамики
мембран эндоплазматического ретикулума в растущем ооците.
3. Оценить возможное участие пористых пластинок, содержащих
цитоплазматические поры, в процессе формирования ядерной оболочки.
4. Проанализировать ультраструктурную динамику ядерной оболочки и
ядерных пор в процессе роста ядра ооцита, в частности, определить,
изменяется ли плотность распределения пор в ядерной оболочке на разных
стадиях оогенеза*
5. Исследовать влияние инъекции антител к нуклеопорину р62, входящему в
состав центрального отдела ядерного порового комплекса, на формирование
ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий.
6, Сравнить механизм сборки ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий
и в митотически делящихся клетках синцитиальных эмбрионов дрозофилы на
стадии интерфазы. На основании полученных данных создать модель
формирования ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.
7. Определить локализацию внутриядерного актина и его взаимодействие с
ядерной оболочкой.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе проведен сравнительных анализ ультраструктурной организации растущих ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза. Установлено, что в процессе развития ооцита наблюдается перераспределение внутриклеточных органелл по цитоплазме клетки и меняется равномерность распределения пор в ядерной оболочке.
Впервые в цитоплазме ранних ооцитов обнаружены компактные миелиноподобные структуры, способные разворачиваться в мембраны гладкого эндоплазматического ретикулума. На III-IV стадиях оогенеза зарегистрировано множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и появление фрагментов ядерной оболочки, не имеющих пор, вблизи мест слияния. Гладкие мембранные пузырьки также обнаружены вблизи внутренней ядерной мембраны таких ооцитов, что позволяет предположить возможность перемещения части мембраны пузырька через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра и, во многом, доказывает участие ЭПР в сборке наружной и внутренней ядерных мембран. Впервые в ооцитах амфибий зарегистрировано слияние пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, с наружной ядерной мембраной, что доказывает причастность этих органелл к формированию новых участков ядерной оболочки в этих клетках. На уровне электронной микроскопии установлено, что сборка ядерных поровых комплексов в растущем ядре ооцита ксенопуса происходит через формирование промежуточных структур, и выявлены последовательные этапы этого процесса. Сочетание методов флуоресцентной и электронной микроскопии позволило выявить внутри ядра ооцитов актин-содержащие филаменты, которые могут быть вовлечены во внутриядерный транспорт и, возможно, в сборку ядерной оболочки. Комплексный подход позволил продемонстрировать, что формирование ядерной оболочки — это сложный процесс, в который вовлечены многие внутриклеточные структуры. Результаты проведенного исследования демонстрируют новые аспекты происходящих в ооците процессов, предшествующих оплодотворению, которые могут быть использованы в работах по изучению организации созревающих и оплодотворенных яйцеклеток, а также эмбриональных клеток.
Материалы диссертационной работы, опубликованные в обзорной статье (Морозова и др., 2005), используются при чтении лекций на Кафедре генетики и селекции в Санкт-Петербургском государственном университете и могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов других университетов.
Апробация работы. Результаты, представленные в диссертации, докладывались и обсуждались на отчетной сессии Института цитологии и генетики (2005 г.), а ткаже на российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI МНСК (Новосибирск, 2003); 3-я Международная научная конференция «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Астана, Казахстан, 2003); 7-я Пущинская школа-конференция «Биология - наука XXI века» (Россия, Пущино, 2003); Международный Симпозиум по проблемам Мейоза (Санкт-Петербург, 2003); Российско-китайский Симпозиум «Наука о жизни» (Пущино, 2004); 8-я Азиатско-Тихоокеанская Конференция по Электронной Микроскопии (Канадзава, Япония, 2004); III съезд ВОГиС (Москва, 2004); Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, Беларусь, 2004); 7-й Межнациональный Микроскопический Конгресс (Портороз, Словения, 2005); Конференция Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Структура и динамика клеточного ядра» (Гран-Мотте, Франция, 2005); XV Всероссийское Совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005); Школа-Семинар Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Молекулярный Транспорт. Каналы и Транспортеры» (Эриче, Сицилия, Италия, 2005) и «Клеточные мембраны: организация и динамика» (Бильбао, Испания, 2006); 16-й Международный Микроскопический Конгресс (Саппоро, Япония, 2006).
По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 12 тезисов в сборниках конференций и симпозиумов, 2'статьи приняты в печать.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Работа изложена на 149 страницах печатного текста, содержит одну таблицу и иллюстрирована 55 рисунками. В списке литературы приведено 270 источников,
Ядерная оболочка
Главной отличительной особенностью эукариотических клеток является наличие в них ядра. Этот внутриклеточный компартмент ограничен двойным мембранным бислоем, называемым ядерной оболочкой (ЯдО). ЯдО является одной из важнейших мембранных структур клетки, поскольку она изолирует центральные клеточные процессы - репликацию ДНК и синтез РНК - от цитоплазмы, где в ходе трансляции наследственная информация реализуется в виде синтезирующихся на рибосомах молекул белка. ЯдО состоит из наружной и внутренней мембран, перинуклеарного пространства, ядерной ламины и ядерных поровых комплексов. Наружная мембрана ЯдО в некоторых местах непосредственно продолжается в мембраны шероховатого эндоплазматического ретикулума (ЭПР), покрытые рибосомами, и сама содержит на своей поверхности рибосомы (Fricker et al., 1997; Marshal, Wilson, 1997). Белково-липидный состав наружной ядерной мембраны аналогичен составу мембран ЭПР. В частности, она содержит такие интегральные белки ЭПР как р65 и NEP-B78, белки семейства Sec и LRP (Moir et al, 1995; Marshal, Wilson, 1997; Drummond et al. 1999; Wada et al., 2004). В то же время, недавние исследования продемонстрировали, что в наружной ядерной мембране содержатся также не характерные для мембран ЭПР белки - несприны, которые взаимодействуют с цитоскелетом и отвечают за расположение ядра в цитоплазме клетки (Young, Kothary, 2005; Zhang et al., 2001). Между наружной и внутренней мембранами ядра находится перинуклеарное пространство, которое сообщается с просветом ЭПР, благодаря чему между этими компартментами осуществляется свободная диффузия ряда молекул, в частности, ионов кальция. Наружная и внутренняя мембраны ЯдО соединяются в области мембранного компонента ядерных пор, который содержит интегральные мембранные белки gp210 и РОМ121 (рис. 1).
Внутренняя ядерная мембрана отличается от наружной мембраны наличием специфических интегральных белков, содержащих сайты связывания с хроматином, и ядерной ламины, прилегающей к внутренней мембране ЯдО со стороны нуклеоплазмы (Worman, Courvalin, 2000). Ядерная ламина - плотная сеть тонких белковых фибрилл (толщиной 10-20 нм), выстилающих внутреннюю мембрану у (Stuurman et al., 1998; Hutchison, 2002). Эти филаменты - ламины, представляют собой одинаково ориентированные полимеры белков промежуточных филаментов. Как и другие промежуточные филаменты, они имеют короткий N-концевой домен, продолжающийся в а-спиральный домен и заканчивающийся длинным глобулярным хвостом. В состав ламины входят нескольких белков - ламинов. В клетках высших позвоночных экспрессируются три типа ламинов: А, В и С (Stuurman et al., 1998).
Получение, окрашивание и исследование полутонких и ультратонких срезов
Полутонкие срезы толщиной 0.5 мкм нарезали стеклянным ножом на ультратоме Ultracut (Reichert, Австрия) и переносили при помощи реснички на предметное стекло в каплю dHiO. Срезы высуишвшш на гистологической плитке при температуре 60-70С, а затем окрашивали 1%-ным раствором метиленового синего, приготовленным на 1%-ном тетраборате натрия и отфильтрованном через 0.2 ц фильтр. Избыток красителя отмывали через 3-4 мин. дистиллированной водой. Полученные препараты анализировали в световом микроскопе, выбирая нужные участки для дальнейшего ультраструктурного анализа.
Ультратонкие срезы толщиной около 50-70 им получали с помощью алмазного ножа на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Австрия), после чего их снимали на медные сеточки, покрытые формварной плёнкой.
Сеточки контрастировали последовательным окрашиванием
отцентрифугированными (5 мин., х 10000) растворами ацетата уранила и цитрата свинца по Рейнольдсу (Serva, Германия). Методика окраски:
1) окраска уранилацетатом натрия (3 мин);
2) промывка дистиллированной водой (30 секунд под струей воды);
3) окраска цитратом свинца (4 мин);
4) отмывка под струей дистиллированной воды.
Для предотвращения выпадения свинца окраску проводили на капле цитрата свинца, которую помещали на пленку Parafiim под чашку Петри и обкладывали гранулами чистого NaOH.
Окрашенные ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе LEO 910 (Zeiss, ФРГ) при ускоряющем напряжении 60 кВ и 80 кВ. Изображение снималось при помощи CCD-камеры и выводилось на монитор компьютера на увеличении 2.8-56000. Обработка изображений осуществлялась с использованием пакета программ BioVision (SofflmagingSysterns).
Особенности ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях оогепеза
Процесс развития ооцитов амфибий включает, согласно классификации Дьюри
(Duryee, 1950), шесть стадий, соответствующие профазе первого деления мейоза с зитотены по диакенез включительно (см. раздел 1.5.2). Морфологическое исследование структурной организации растущих ооцитов амфибий на разных стадиях развития, проведенное на полугонких срезах, показало, что от I к VI стадии развития диаметр клеток увеличивается со 150 мкм до 1300 мкм, а диамеїр ядра возрастает при этом со 100 мкм до 600 мкм.
Сравнительный электронно-микроскопический анализ ооцитов показал, что в процессе оогенеза структурная организация ооцита существенно усложняется, что сопровождается перераспределением органелл по цитоплазме клетки.
Рисунок 17 демонстрирует фрагмент цитоплазмы ооцита ксенопуса на разных стадиях его развития. На малом увеличении стадию оогенеза амфибий можно легко идентифицировать по присутствию или отсутствию кортикальных и желточных гранул. На І-ІІ стадиях кортикальные и желточные гранулы отсутствуют (рис. 17, а), на IllV стадиях в цитоплазме появляются первые кортикальные гранулы, и одновременно начинается формирование желточных гранул (рис. 17, б), а на V-VI стадиях в цитоплазме ооцита наблюдается большое количество желточных и кортикальных гранул, подстилающих плазматическую мембрану ооцита. Более детально ультраструктура развивающихся ооцитов описана ниже.
І-П стадии оогенеза. Для проведения сравнительного анализа ультраструктуры развивающихся ооцитов мы условно разделяли цитоплазму на три области: периферическую, околоядерную и расположенную между ними среднюю область (см. раздел «Материалы и методы»). Установлено, что ранний ооцит имеет прозрачную цитоплазму, в которой выявляются мембраны ЭПР, слабо развитый аппарат Гольджи и рибосомы. Кортикальные и желточные гранулы в цитоплазме ооцита отсутствуют. Пузырьки и цистерны гладкого и шероховатого ЭПР наблюдаются в больших количествах в периферической области клетки вблизи
Участие мембранных компонентов цитоплазмы ооцита амфибий в сборке ядерной оболочки
Исследованию особенностей ультраструктурной организации развивающихся
ооцитов посвящено большое количество работ, в которых подробно описана морфология их основных внутриклеточных органелл (Айзенштадт, 1984; Wallace, Selman, 1990; Ebner et al, 2003; Smith et al, 2004). При этом особое внимание уделялось изучению морфологии ЭПР, поскольку он выполняет ведущую роль в синтезе основных белков и липидов, необходимых для роста клетки, и их транспорте в цитоплазме.
Во многих работах было показано, что пузырьки ЭПР принимают активное участие в сборке ЯдО в митозе in vivo и необходимы для сборки ядер в условиях in vitro (Zatsepina et al, 1977; Kiseleva et al, 2001; Burke, Ellenberg, 2002). Наименее исследованным на данный момент является вопрос об участии ЭПР в сборке новых фрагментов ядерной оболочки в неделящихся растущих клетках, к которым относятся развивающиеся ооциты. К настоящему времени достаточно хорошо изучена динамика ЭПР в зрелых ооцитах на последних стадиях их созревания, а также после их оплодотворения (Henson et al., 1990; Jaffe, Terasaki, 1994). Показано, что образование кластеров ЭПР в цитоплазме ооцитов на стадии метафазы мейоза связано с подготовкой ооцитов к оплодотворению и является характерной особенностью этих клеток (Mehlmann et al.t 1995), однако механизм этого процесса еще слабо изучен. Установлено, что после оплодотворения ооцитов амфибий в их цитоплазме также наблюдаются большие скопления (кластеры) мембранных компонентов ЭПР (Terasaki, 2000), что связывают с активацией синтеза различных белков, необходимых для развивающегося эмбриона. Данных о характере распределения ЭПР в ооцитах на ранних стадиях оогенеза очень мало, хотя это представляет большой интерес, поскольку именно ранние стадии являются наиболее активными по интенсивности процессов амплификации генов, а также транскрипции (Дэвидсон, 1972; Roger et al., 2002), Установлено, что в течение оогенеза диаметр яйцеклетки амфибий и ее ядра увеличиваются примерно в 10 раз, соответственно (раздел З.1.1.). Это должно сопровождаться увеличением количества различных органелл в клетке и ростом ядерной оболочки, в формировании которой, как было сказано выше, ЭПР может принимать активное участие. Это позволило предположить, что площадь поверхности мембран ЭПР, его объем, а также расположение компонентов ЭПР по цитоплазме клеток должно при этом существенно изменяться.
Мы использовали сочетание электрон но-микроскопического и морфометрического подходов для исследования развивающихся ооцитов амфибий и установили, что, в ходе оогенеза, параллельно с ростом ооцита, наблюдается увеличение общей площади поверхности мембран ЭПР и общего объема ЭПР в цитоплазме ооцита, причем этот процесс происходит в клетке неравномерно. Обнаружено, что в ходе оогенеза в цитоплазме ооцита имеет место динамическое изменение и перераспределение внутриклеточных органелл, в том числе и составных компонентов ЭПР, по различным областям цитоплазмы.
Согласно нашим данным, на 1-Й стадиях оогенеза компоненты ЭПР накапливаются в периферических отделах цитоплазмы ооцита, вблизи плазматической мембраны клетки. Известно, что начальные стадии оогенеза характеризуются низким уровнем белкового синтеза (Дэвидсон, 1972), поэтому возникает вопрос о том, чем обеспечивается накопление мембранных компонентов ЭПР на периферии ранних ооцитов. Источники и механизмы формирования ЭПР in vivo остаются до сих пор слабо изученными, хотя при исследовании этого процесса в условиях in vitro было показано, что сначала формируются пузырьковидные элементы ЭПР, которые затем сливаются в трубочки и цистерны (Dreier, Rapoport, 2000). Многими авторами была продемонстрирована возможность прямого контакта между ЭПР и плазматической мембраной клеток при выделении или поглощении клетками различных веществ (Gupta, Golding, 1996; Gagnon et al,, 2002). Можно предположить, что на ранних стадиях оогенеза, одновременно с поступлением в ооцит питательных веществ из окружающих фолликулярных клеток, в клетку перемещается большое количество мембран, отделяющихся от плазматической мембраны. Мы установили, что с плазматической мембраной ооцита могут контактировать миелиноподобные структуры, при этом цитоплазматические области, расположенные вблизи таких контактов, содержат увеличенное количество различных компонентов ЭПР (раздел 3.1.3). Возможно, эти миелиноподобные структуры служат в раннем оогенезе в качестве запаса мембран, используемых как для увеличения площади поверхности плазматической мембраны растущего ооцита, так и для формирования новых компонентов ЭПР (см. раздел 4.1.2,).
