Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8-26
2.1. Пролиферация клеток в процессе метаморфоза амфибий 6-18
2.2. Гистофизиология щитовидной железы амфибий 18-26
3. Материалы и методы 27-38
4. Собственные исследования 39-118
4.1. Взаимоотношения пролиферативной и функциональной активности тироцитов при естественном метаморфозе..39-78
4.2. Пролиферация клеток щитовидной железы метаморфозирующих амфибий при изменении функциональной активности тироцитов 78-107
4.3. Функциональная активность щитовидной железы метаморфозирующих амфибий при подавлении пролиферации тироцитов 108-118
5. Обсуждение 119-132
6. Выводы 133-134
Указатель литературы 135-164
- Пролиферация клеток в процессе метаморфоза амфибий
- Гистофизиология щитовидной железы амфибий
- Пролиферация клеток щитовидной железы метаморфозирующих амфибий при изменении функциональной активности тироцитов
- Функциональная активность щитовидной железы метаморфозирующих амфибий при подавлении пролиферации тироцитов
Пролиферация клеток в процессе метаморфоза амфибий
Пролиферация клеток различных органов и тканей амфибий, в частности, в процессе метаморфоза, изучена довольно подробно. Еще в 1922 году c.Ohampy детально исследовал размножение клеток некоторых органов головастиков с помощью подсчета митотичеокого индекса. В последнде годы применение метода авторадяографии позволило получить обширную информацию о пролиферации клеток в различные периоды онтогенеза хвостатых и бесхвостых амфибий.
Однако до оих пор эти данные не были сведены воедино и обсуждены с единой точки зрения, как это, например, было сделано для пролиферации клеток на различных этапах онтогенеза млекопитающих (А.К.Дондуа, 1967; А.А.Заварзин, 1967). В то же время, закономерности изменения пролиферации клеток на протяжении индивидуального развития амфибий представляют значительный интерес в связи со своеобразием онтогенеза данной группы позвоночных, в особенности, с наличием в их жизненном цикле метаморфоза. Исходя из этого, в настоящей главе предпринята попытка суммировать и обсудить имеющиеся сведения о пролиферации клеток в онтогенезе у амфибий (до метаморфоза, в процессе метаморфоза и после метаморфоза).
Описание размножения клеток у амфибий правомерно начать с предавственников половых клеток - гоноцитов. Установлено, что число гоноцитов у шпорцевых лягушек увеличивается, начиная со стадии гаотрулы до начала метаморфоза. Однако закономерности пролиферации клеток при гаметогенезе у амфибий в настоящее время практически не изучены.
Период дробления яйцеклетки и образования бластулы у амфибий протекает быстро, завершаясь обычно за 24 чаоа. На стадии ранней бластулы становятся хорошо заметными различия в интенсивности размножения клеток различных частей зародыша, значительное падение пролиферативной активности в области эктодермы. К началу гастру-ляции зародыш шпорцевой лягушки содержит уже 8000 клеток, травяной лягушки - 15000, тритона - менее 5000 клеток ( P.Vaiouch et al. , 1971).
Одной из весьма актуальных проблем эмбриологии является проблема соотношения репродукции и дифференцировки клеток. Экспериментальные исследования, выполненные на поздних зародышевых и ранних личиночных стадиях развивающихся амфибий, позволяют провести параллельное изучение диффервнцировки клеток и параметров пролиферации.
Рассмотрим взаимоотношения между дифференцировкой и размножением клеток кишечника, почки и нервной системы у амфибий в период, предшествующий метаморфозу. У испанского тритона дифференцировка эпителиоцитов кишечника осуществляется уже на ранних стадиях развития головастиков. В начале диффервнцировки пролиферирующие клетки равномерно распределены в энтодерме. На 34-37 стадиях развития по Галльену и Дюроше происходит дифференцировка клеток кишечного эпителия, появляются каемчатые и бокаловидные клетки.
По мере .диффервнцировки число делящихся клеток уменьшается вдвое: на 34 стадии число меченых %-тими.дином ядер эпителиоцитов составляет 45$, а на 36 - 21% ( G.Brugai , 1977).
Несмотря на то, что в период диффервнцировки митотический индекс уменьшается с 3% до 1%, число эпителиоцитов увеличивается в 2,6 раза. На 36-37 стадиях делящиеся клетки локализуются только в отдельных участках эпителиального пласта. В настоящее время высказаны различные гипотезы о связи пролиферации и дифференцировки клеток кишечника головастиков; выделены два кейлона, которые могут обусловливать ингибирование пролиферации эпителиоцитов кишечника ( G.Brugal » 1971а, І97ІВ, 1973; G.Brugal » J.Pelmont , 1974, 1975; G.Brugal , 1976, 1977а, І977в).
Сходные взаимоотношения между дифференцировкой и пролиферацией клеток обнаружены при развитии почки головастиков у шпорцевой лягушки. На стадиях 45-46 100$ клеток зачатка почки включают %-тимидин. На 48 стадии, когда происходит дифференцировка клеток проксимальных и дистальных отделов нефрона, менее 9% клеток способны к синтезу ДНК.
В частности, клетки нефрона, секретирующие слизь, полноотью теряют способность к пролиферации. В .дальнейшем число ДНК-синтезирующих клеток уменьшается еще более и достигает у взрослых шпорцевых лягушек 0,1$. Интересно, что при односторонней нефрэктомии у данных животных стимуляция размножения клеток наблюдается только в клетках дистальных, но не проксимальных отделов нефрона ( G.Goi-din , B.Fabian , 1975).
Уменьшение интенсивности пролиферации в процессе дифференци-ровки обнаружено также в спинном мозге и сетчатке головастиков различных видов амфибий (В.Ф.Синицина, 1975; E.D.Poiiac , 1976; D.H.Beach , M.Jacobson , 1979а, 1979в). Более сложна динамика пролйферативной активности в спинномозговых ганглиях головастиков, где наряду с пролиферацией происходит гибель значительной части клеток ( H.D.Bibb , 1977, 1978). Уменьшение интенсивности размножения клеток - также один из важных элементов формирования пальцев на более поздних стадиях метаморфоза хвостатых и бесхвостых амфибий ( J.A.Cameron , J.P.Fallon, 1977).
Таким образом, приведенные факты свидетельствуют о том, что размножение клеток амфибий находится в теснейших взаимоотношениях с их дифференцировкой. При дифференцировке клеток различных органов развивающихся головастиков наблюдается одна и та же закономерность - уменьшение интенсивности пролиферации. Тем не менее, взаимоотношения пролиферации и дифференцировки в каждом органе имеют свои опецифичеокие особенности.
Особый интерес представляет сравнительное изучение интенсивности пролиферации клеток на различных фазах метаморфоза амфибий. Это связано с тем-, что у метаморфозирующих амфибий за сравнительно короткий срок происходят значительные изменения структуры, связанные с ростом и резорбцией тех или иных органов и тканей. Под влиянием тиреоидных гормонов при метаморфозе происходят разнонаправленные изменения размножения клеток в различных органах головастиков. Так, тироксин и трииодтиронин отимулируют пролиферацию клеток сетчатки и Хрусталика головастиков. Показано, что изменение пространственной топографии образования клеток сетчатки в середине личиночного периода происходит в результате более выраженной пролиферативной реакции на тироксин в вентральном, чем в дар-сальном крае сетчатки.
Гистофизиология щитовидной железы амфибий
Щитовидная железа амфибий - парный орган, имеющий форму маленьких округлых ила удлиненных телец, расположенных вблизи подъязычного аппарата. Структура щитовидной железы различных видов амфибий описана в настоящее время довольно подробно. Однако многие вопрооы, касающиеся регуляции и функциональной роли этого органа у амфибий, до сих пор мало исследованы.
В обзоре, посвященном физиологии щитовидной железы амфибий, A.Gorbman (1964) указывает на то, что роль щитовидной железы у взрослых амфибий почти не известна. В настоящей главе обсуждаются результаты исследования гистофизиологии щитовидной железы, полученные в последние годы.
Структура щитовидной железы амфибий в основных чертах соответствует плану строения этого органа у .других классов позвоночных. Сверху она покрыта тонкой капсулой, оостоящей из соединительной ткани. Под капсулой располагаются паренхима и строма железы.
Паренхима щитовидной железы представлена тканевыми единицами - тиреоидными фолликулами. Стенка фолликулов образована одним слоем эпителиальных клеток - тироцитов. Полость фолликула заполнена коллоид-вязким раствором иодированного белка тиреоглобулина, секретируемого тироцитами. При активации железы в коллоиде обнаруживаютоя многочисленные резорбционные вакуоли.
Строма железы представлена ТОНКИМИ прослойками рыхлой соединительной ткани. Проходящие в этих прослойках сосуды образуют сеть вокруг фолликулов. В непосредственной близооти от тироцитов располагаются многочисленные нервные волокна, возможно, регулирующие функцию этих клеток ( u.Weisch , 1973).
Ультраструктура главных клеток щитовидной железы амфибий -тироцитов изучена достаточно детально. Форма тироцитов изменяется в зависимости от функционального состояния этих клеток - от уплощенной при низкой функциональной активности до высокопризматичео-кой при повышении активности клеток. Ядра тироцитов овальные, с хорошо выраженным ядрышком, располагаются в базальной зоне клетки.
Хорошо развитая шероховатая эндоплазматическая сеть находится в базальной, латеральных, а также апикальной зоне тироцита. Комплекс Гольджи локализуется около я.дра, митохондрии - повсюду в цитоплазме клетки. Многочисленные секреторные гранулы обнаруживаются в апикальной зоне тироцита. Апикальная поверхность фолликулярного тироцита покрыта микроворсинками, число которых увеличивается при активации клетки. Латеральные поверхности с помощью десмосом и других типов межклеточных соединений формируют контакты с соседними тироцитами. Базальная поверхность через посредство базальной мембраны прилегает к гемокапиллярам ( j.H.Larsen , 1965; K.V.Prahlad , 1968; V.J.Hearing , J.J.Eppig , 1969).
Секреторный цикл тироцитов амфибий включает в себя синтез тире оглобулина , иодирование тиреоглобулина и секрецию тиреоидных гормонов в кровь. Синтез молекул тиреоглобулина осуществляется на мембранах гранулярной эндоплазматической сети. Установлено, что у шпорцевых лягушек интенсивность синтеза тиреоглобулина коррелят-ет с количеством цистерн эндоплазматической сети в клетке ( E.Eegard , J.Manchamp , 1971). Иодирование тиреоглобулина осуществляется с помощью перокси-дазы, локализованной в апикальной плазмолемме тироцитов лягушек ( н.йапЪа, 1972). В результате иодирования образуются тиреоидине гормоны - трииодтиронин и тироксин. Формирование тиреоидных гормонов у амфибий происходит по схеме, общей .для всех позвоночных животных ( A.Peyrot et ai. , 1966). Накопление тиреоглобулина происходит в фолликуле. Выведение после гидролиза осуществляется путем захвата коллоида апикальной поверхностью клеток.
В дальнейшем тиреоглобулин расщепляется гидролитическими ферментами лизосом, при этом тироксин и трииодтиронин выводятся в кровь. Установлено, что концентрация тироксина в крови у амфибий значительно превышает концентрацию трииодтиронина (с.с.тьогп-ъиш , 1967).
Активность щитовидной железы различна у разных видов амфибий. Так, у хвостатых амфибий накопление радиоактивного иода щитовидной желеЗОЙ, Как ПраВйЛО, более актйвно, чєм у бесхвостых (A.Peyrot , 1971; A.Peyrot et ai., 1973). Особенно низкая функция щитовидной железы отмечена у некоторых безногих амфибий (н.КоЪауавЫ. , A.Gorbman , 1962).
Регуляция функционального состояния тироцитов осуществляется главным образом путем изменения концентраций в крови гормона, секретируемого аденогипофизом - тиротропина. Известно, что тиро-тропин существенно повышает функциональную активность щитовидной железы амфибий ( D.O.Norris» -E.Platt , 1973 ; A. Taurog , 1974;
Тиротропин вызывает значительные изменения ультраструктуры тироцитов. В цитоплазме появляются крупные коллоидные капли, которые очень редко встречаются у контрольных амфибий (R.Coleman et ai. , 1968). При удалении гипофиза функциональная актив ность тироцитов подавляется - клетки уплощаются, резко уменьшается накопление радиоактивного иода щитовидной железой амфибий ( J.N. Dent г 1966).
Однако в регуляции функционального состояния щитовидной железы амфибий заметную роль играет не только тиротропин, но и другой гормон гипофиза - пролактин ( Е. Campantico , 1968а, 1968B). При введении головастикам лягушки пролактин вызывает как уменьшение высоты тироцитов, так и уменьшение скорости накопления радиоактивного иода этими клетками (A. Gona , 1968; Е. Regard et al. , 1975).
В то же время пролактин в некоторых случаях активирует щитовидную железу взрослых амфибий ( A. Peyrot et al., 1971). Под влиянием этого гормона усиливается рост щитовидной железы и размножение тироцитов ( A. Gona , 1967). Пролактин вызывает значительное расширение кровеносных сосудов щитовидной железы амфибий ( С Vellano et al. , 1967).
Еще одним гипофизарным гормоном, активирующим щитовидную железу амфибий, является лютропин ( Н Schultheiss , 1975). Эстрогены также оказывают стимулирующее действие на щитовидную железу бесхвостых амфибий ( С. Vellano et al. , 1977). Кроме этого, ускорение развития щитовидной железы у головастиков амфибий отмечается при удалении эпифиза (с. Remy , P. Disclos , 1971).
Пролиферация клеток щитовидной железы метаморфозирующих амфибий при изменении функциональной активности тироцитов
Фолликулы щитовидной железы крупные, их средний условный объем составляет 156 тыс.мкм3, что на 108% больше, чем на третьей стадии (р 0,001) (табл. 2). Фолликулы весьма разнообразны по форме. Сре.днее значение эксцентриситета фолликулов несколько увеличивается по сравнению с предыдущими стадиями.
Состояние коллоида на пятой стадии также весьма различно в разных фолликулах. В некоторых фолликулах коллоид становится жидким и приобретает вид пенистой масоы, пронизанной многочисленными резорбционными вакуолями. Другие фолликулы (обычно меньших размеров) заполнены гомогенным коллоидом, резорбционные вакуоли в них немногочисленны или отсутствуют. Сре.днее содержание резорб-ционных вакуолей в одном фолликуле на пятой стадии метаморфоза не изменяется по сравнению с третьей стадией и составляет 13 (табл. 7).
Ядра тироцитов круглые, располагаются преимущественно в ба-зальных отделах тироцитов. По сравнению с предыдущей стадией эксцентриситет ядер существенно не изменяется (табл. 5). Большие диаметры ядер располагаются, как правило, перпендикулярно к базальної мембране фолликула, что является признаком высокой активности тироцитов. Площадь ядер достоверно увеличивается по сравнению с третьей стадией (на 18%, t = 5,62, р 0,001), что также говорит об активации тироцитов (табл. 6). На 22% по сравнению с предыдущей стадией увеличивается высота тироцитов (р 0,01) (табл. 4). Строма щитовидной железы на пятой стадии представлена тонкими прослойками соединительной ткани и многочисленными гемокапиллярами.
Таким образом, результаты морфологического и морфометричес-кого анализа структуры щитовидной железы головастиков зеленой жабы пятой стадии естественного метаморфоза позволяют сделать заключение о том, что на данной стадии функциональная активность щитовидной железы еще более повышается по сравнению с предыдущими стадиями метаморфоза.
Итак, в результате проведенных количественных исследований можно сделать вывод о динамике изменения функционального состояния щитовидной железы в процессе естественного метаморфоза головастиков зеленой жабы. Большинство изученных морфометричес-ких параметров, характеризующих состояние различных структур щитовидной железы, обладает весьма сходной динамикой.
Так, объем тиреоидных фолликулов и число тироцитов, составляющих фолликул, повышаются от стадии к стадии. Это свидетельствует о повышении суммарной функциональной активности фолликулов в процессе метаморфоза; как правило, наиболее крупные фолликулы оказываются и наиболее активными. Увеличение эксцентриситета фолликулов приводит к увеличению поверхности этих тканевых единиц щитовидной железы и тем самым также является признаком усиления функции щитовидной железы метаморфозирующих головастиков .
Несомненным критерием высокой активности щитовидной железы на третьей и пятой стадиях естественного метаморфоза можно считать большое число резорбционных вакуолей в интрафолликулярном коллоиде. Классический критерий функциональной активности щитовидной железы - высота фолликулярных тироцитов также существенно увеличивается при метаморфозе. Таким образом, проведенное исследование позволяет сделать обоснованный вывод о повышении функциональной активности щитовидной железы головастиков зеленой жабы в процессе естественного метаморфоза.
Стимуляция синтеза тиреоидных гормонов и резорбции коллоида в каждом отдельном фолликуле, однако, по-видимому, недостаточна для резкого подъема уровня тиреоидных гормонов в организме головастика, который наблюдается при метаморфозе. Поскольку щитовидная железа растет в процессе метаморфоза, следует ожидать, что тироциты в этот период не только активируются, но и активно пролиферируют.
В связи с этим значительный интерес представляет количественная оценка динамики пролиферативной активности тироцитов на различных стадиях естественного метаморфоза. Общепринятым методом количественной оценки интенсивности пролиферации клеток является подсчет митотических фигур. В щитовидной железе всех стадий можно изредка встретить тироциты, находящиеся на разных фазах митоза (рис. 5,6).
Однако в связи с тем, что щитовидная железа головастиков (особенно на разных стадиях метаморфоза) представлена немногочисленными тироцитами, подсчет митотического индекса (даже при применении колхицина) весьма затруднителен. В связи с этим наш для количественной оценки интенсивности пролиферации тироцитов применена методика дифференциального окрашивания клеточных ядер, находящихся на разных стадиях митотического цикла ( Y. Alvarez, , Y. Valladares , 1972).
Путем применения данной методики установлено, что в щитовидной железе головастиков зеленой жабы, находящихся на различных стадиях метаморфоза, можно без труда отличить ядра, находящиеся в синтетическом периоде митотического цикла. Ядра, синтезирующие ДЖ, окрашиваются в оранжевый цвет. В то же время ядра тироцитов, находящиеся в периодахGX И G2 митотического цикла, окрашиваются в светло-зеленый цвет (рис. 7, 8, 9, 10).
Функциональная активность щитовидной железы метаморфозирующих амфибий при подавлении пролиферации тироцитов
Щитовидная железа головастиков озерной лягушки пятой стадии естественного метаморфоза расположена вплотную к хрящу. Количество фолликулов на срединном горизонтальном срезе железы возрастает. Следует отметить, что функциональная активность фолликулов у головастиков пятой стадии весьма варьирует. В центре железы расположены преимущественно крупные и средние фолликулы. Форма крупных фолликулов на данной стадии чрезвычайно неправильна.
Эксцентриситет фолликулов на пятой стадии равен в среднем 35 (табл. 8). Средний условный объем фолликулов резко возрастает по сравнению с предыдущими стадиями (на 105% по сравнению со второй стадией) и составляет ИЗ тыс.мкм3 (табл. 14). Однако и на этой стадии присутствуют мелкие фолликулы, образованные немногочисленными тироцитами.
Тироциты, образующие стенки фолликулов, на пятой стадии часто имеют коническую форму. Число тироцитов в одном фолликуле от 7 до 38, в среднем - 21, что на 31% превышает этот показатель на второй стадии (табл. 16). Высота тироцитов колеблется до 7 до 17 мкм, в среднем - 8,9 мкм (табл. 17, рис. 17). Следовательно, на пятой стадии происходит значительное увеличение высоты тироцитов .
Ядра тироцитов расположены главным образом в базальных отделах этих клеток. Однако в некоторых участках фолликулов наблюдается кажущаяся многорядность фолликулярного эпителия. В углублениях стенок фолликулов располагаются многочисленные гемокапил-ляры.
В многоугольных и вытянутых тиреоидных фолликулах коллоид часто почти полностью отсутствует; противоположные стенки этих фолликулов смыкаются. Эпителий в таких фолликулах высокий, цилиндрический. В апикальных зонах тироцитов часто обнаруживаются довольно крупные капельки коллоида, что свидетельствует об активной его резорбций. Ядра тироцитов локализованы базально; как правило, они ориентированы вдоль вертикальной оси тироцита. Такое расположение ядер характерно .для активно функционирующих тироцитов.
В периферической зоне щитовидной железы располагаются фолликулы, функциональная активность которых ниже, чем у центральных. Тироциты, образующие периферические фолликулы, как правило, имеют кубическую форму, количество резорбционных вакуолей в периферических фолликулах меньше. По краю железы встречаются также весьма мелкие фолликулы с гомогенно окрашивающимся коллоидом и небольшим числом резорбционных вакуолей.
В среднем число резорбционных вакуолей в щитовидной железе головастиков пятой стадии более чем в пять раз увеличивается по сравнению с предыдущей стадией (р 0,001) (табл. 15). Форма ядер тироцитов варьирует, однако преобладают округлые ядра. Эксцентриситет ядер в среднем равен 12 (табл. 18).
Площадь ядер по сравнению со всеми предыдущими стадиями достоверно возрастает. Следует отметить, что ни на одной стадии метаморфоза нами не наблюдались явления десквамации фолликулярных тироцитов или разрывов стенки фолликулов с выходом коллоида в интерфолликулярное пространство.
Таким образом, количественные исследования, проведенные на метаморфозирующих головастиках озерной лягушки, показывают, что у этого вида амфибий последовательность изменений структуры щитовидной железы при метаморфозе, в сущности, совпадает с последовательностью перестройки щитовидной железы головастиков зеленой жабы. Результаты морфологического и морфометрического анализа позволяют сделать вывод о повышении функциональной активности щитовидной железы озерной лягушки в процессе естественного метаморфоза. Это повышение осуществляется в несколько меньшей степени, чем у зеленой жабы, и происходит с меньшей скоростью. Такой вывод можно объяснить меньшей скоростью метаморфоза у озерной лягушки.
Параллельно с оценкой функциональной активности щитовидной железы с помощью морфометрии проведено непосредственное определение интенсивности накопления радиоактивного иода щитовидными железами головастиков озерной лягушки различных стадий естественного метаморфоза. Установлено, что при естественном метаморфозе озерной лягушки накопление радиоактивного иода -J щитовидными железами в условиях инкубации резко повышается. Если щитовидные -железы головастиков первой стадии накапливают 1,1$ радиоактивного иода ( табл. 19), то на пятой стадии накопление изотопа составляет 5,6%, то есть увеличивается более чем в четыре раза по сравнению с первой стадией и более чем вдвое по сравнению со второй стадией (р 0,001).
Эти данные вполне согласуются с результатами морфометри-ческих исследований и подтверждают сделанный нами ранее вывод об активации щитовидной железы метаморфозирующих головастиков озерной лягушки. Для оценки пролиферации клеток щитовидной железы головастиков лягушки применена методика авторадиографии. Установлено, что в щитовидной железе головастиков первой стадии естественного метаморфоза довольно много ядер тироцитов включают тимидин при введении в организм меченого тимидина в течение 36 часов. Доля тироцитов с мечеными ядрами на этой стадии равна 22,2% (табл. 20, рис. 18). Меченые ядра располагаются довольно равномерно в центре и по периферии щитовидной железы. Часто можно видеть группы меченых тироцитов, располагающихся рядом друг с другом (рис. 19). Отдельные меченые ядра обнаруживаются и в клетках перифолли-кулярной стромы. Не выявлена какая-либо закономерность в расположении меченых ядер относительно кровеносных сосудов щитовидной железы.
