Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Распределение митохондрий связано с их функциями в клетках... 9
1.2 Роль микротрубочек и актина в распределении митохондрий 11
1.2.1. Общие черты микротрубочек и актиновых микрофиламентов 11
1.2.2. Особенности системы микротрубочек 11
1.2.3. Особенности актинового цитоскелета 12
1.2.4. Транспорт митохондрий вдоль микротрубочек; роль кинезиновых и динеиновых моторов в этом процессе 13
1.2.5. Актин - зависимый транспорт митохондрий с участием моторных белков 15
1.2.6. Актин - зависимое движение митохондрий без участия моторных белков в дрожжах 16
1.2.7. Прикрепление митохондрий к микротрубочкам и актиновым микрофиламентам 18
1.2.7.1. Роль микротрубочек ассоциированных с ними белков (MAPs) 19
1.2.7.2. Прикрепление митохондрий к фибриллярному актину 20
1.3. Роль промежуточных филаментов в распределении митохондрий в клетках 22
1.3.1. Особенности промежуточных филаментов 22
1.3.2. Сборка виментиновых промежуточных филаментов в клетках 23
1.3.3, Взаимодействие промежуточных филаментов с митохондриями 25
1.3.4. Плектин - белок ассоциированный с промежуточными филаментами 26
1.4. Фибронектин - регулятор внутриклеточных процессов 28
1.5. Роль протеинкиназы С в регуляции перестроек цитоскелета 29
1.6. Регуляция распределения митохондрий ростовыми факторами 31
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1. Культивирование клеток 33
2.2. Иммунофлюоресценция 34
2.2.1. Фиксация клеток 34
2.2.2. Иммунофлюоресцентное окрашивание 34
2.2.3. Антитела 35
2.2.4. Окрашивание актина 35
2.2.5. Окрашивание митохондрий 35
2.2.6. ДНК конструкции 35
2.2.7. Трансфекция клеток 36
2.2.8. Получение покровных стекол, покрытых фибронектином или его фрагментами 36
2.2.8.1. Получение фибронектина и его фрагментов 36
2.2.8.2. Пришивка фибронектина и его фрагментов к покровным стеклам 38
2.2.9. Посадка клеток на стекла, покрытые фибронектином или его фрагментами 39
2.3. Электрофорез и иммуноблотинг 39
2.4. Видеомикроскопия 40
2.5. Обработка данных 41
Глава 3. Результаты 43
3.1. Роль фибронектина, в регуляции формы и внутриклеточного распределения митохондрий в клетке 43
3.1.1. Прикрепление клеток к фибронектину 43
3.1.2. Влияние фибронектина на формирование стресс-фибрилл в клетках 45
3.1.3. Влияние фибронектина на форму митохондрий 46
3.1.4. Процесс удлинения и распределения митохондрий на периферии клетки зависит от взаимодействия их с микротрубочками 48
3.1.5. Локализация митохондрий на периферии клетки 49
3.2. Роль промежуточных филаментов в распределении митохондрий 50
3.2.1. Отсутствие промежуточных филаментов приводит к увеличению подвижности митохондрий в клетке 51
3.2.2. Роль промежуточных филаментов во взаимодействии митохондрий с актиновым цитоскелетом 59
3.3. Протеинкиназа С регулирует подвижность митохондрий 61
3.3.1. Подвижность митохондрий зависит от активности протеинкиназы С 61
3.3.2. Протеинкиназа С регулирует связь митохондрий с промежуточными филаментами 63
Глава 4. Обсуждение результатов 66
Выводы 72
Список литературы 73
- Роль микротрубочек и актина в распределении митохондрий
- Прикрепление митохондрий к микротрубочкам и актиновым микрофиламентам
- Получение покровных стекол, покрытых фибронектином или его фрагментами
- Процесс удлинения и распределения митохондрий на периферии клетки зависит от взаимодействия их с микротрубочками
Введение к работе
Митохондрии занимают особое место среди других органелл клетки, благодаря способности синтезировать АТФ, участвовать в регуляции уровня внутриклеточного кальция, и контролировать процесс регулируемой клеточной гибели, апоптоз. Для нормального функционирования митохондрий большое значение имеет их внутриклеточное распределение. Во многих клетках митохондрии локализуются вблизи мест высокого потребления энергии. Локализация митохондрий находится под контролем внешних и внутренних факторов и достигается при помощи транспорта этих органелл вдоль микротрубочек и актиновых филаментов моторными белками.
Считается, что транспорт митохондрий и других органелл происходит в две стадии: на большие расстояния они переносятся по микротрубочкам, а по актиновым филаментам происходит их перемещение на небольшие расстояния и локализация (Chada and HoUenbeck, 2004; Kuznetsov et al., 1992; Morris and HoUenbeck, 1995). При этом скорость движения вдоль микротрубочек намного выше, чем вдоль микрофиламентов (Morris and HoUenbeck, 1995). Недавно в нашей лаборатории было показано, что фибриллярный актин (F - актин)1, полимеризующийся в результате действия белков семейства форминов, специфически взаимодействует с митохондриями и ограничивает их транспорт (Кулик и др., 2006). Однако оставалось не ясным, какие белки или структуры обеспечивают это взаимодействие.
Мы обнаружили, что если убрать промежуточные филаменты (ПФ) к ядру подвижность митохондрий на периферии клеток возрастает. Это может говорить о роли ПФ, как одного из элементов, удерживающих митохондрии в определенных местах. ПФ это третий компонент цитоскелета клетки. В клетках соединительной ткани они состоят из виментина и являются наименее динамичной структурой цитоскелета (Lodish et al., 1997). Во многих работах представлены данные о том, что митохондрии взаимодействуют с ПФ (Collier et al., 1993; Hirokawa, 1982; Leterrier et al, 1994; Reipert et al., 1999). И хотя к настоящему времени связь ПФ с митохондриями, и ее роль в функционировании последних не вызывает сомнения, детали их взаимодействия остаются все еще мало изученными.
Целью настоящей работы было изучить, как ПФ участвуют в регуляции подвижности митохондрий в клетке. Другой целью было определить роль белка внеклеточного матрикса фибронектина, в прикреплении митохондрий к цитоскелету.
Мы показали, что форма и распределение митохондрий в клетке зависит от фибронектина, который находится в растворенном состоянии, а точнее его гепарин-связывающего домена. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что ПФ участвуют в заякоривании митохондрий на периферии клеток. Они играют важную роль во взаимодействии митохондрий со специфическими структурами актинового цитоскелета. Связь митохондрий с ПФ находится под контролем протеинкиназы С (РКС).
Роль микротрубочек и актина в распределении митохондрий
Микротрубочки и актиновые филаменты представляют собой фибриллы, состоящие из глобулярных белков, тубулина и актина, соответственно. Как микротрубочки, так и актиновые филаменты являются динамичными структурами и постоянно находятся в процессе полимеризации-деполимеризации, причем обмен субъединиц происходит на концах полимеров.
Другим важнейшим свойством обеих цитоскелетных структур является их полярность. Противоположные концы обоих полимеров отличаются не только по структуре, но и по скоростям полимеризации и деполимеризации (Hotani and Horio, 1988; Wegner, 1976). В связи с этим быстрорастущие назвали плюс-концами, а медленнорастущие - минус-концами. Полярность микротрубочек и актиновых филаментов имеет важнейшее значение для их транспортной функции, потому что все моторные белки могут передвигаться вдоль цитоскелетных структур только в определенном направлении.
Микротрубочки представляют собой замкнутые цилиндрические поверхности с диаметром около 20 нм, образованные продольными протофиламентами (Wade et al.,1990). От организации микротрубочек в клетках зависят многие протекающие в них процессы, и в значительной степени их свойства в целом. Во-первых, их специфическая ориентация внутри клеток определяет основные направления транспортных путей. В большинстве клеток микротрубочки ориентированы так, что их минус-концы расположены в центре, а плюс-концы - на периферии клетки, образуя радиальную систему. Весь транспорт в таких клетках организован также радиально. Во-вторых, динамические свойства микротрубочек позволяют быстро перестраиваться их системе в ответ на внешние сигналы, что в свою очередь приводит к изменению формы клетки (Schulze and Kirshner, 1988).
Актиновый цитоскелет представляет собой довольно сложную систему филаментов, соединенных между собой, и образующих, как трехмерные сети, так и параллельные пучки. Актиновые филаменты имеют форму двойной спирали толщиной 8 нм (Pollard, 1990). В клетках различают такие структуры, состоящие из актиновых филаментов, как стресс-фибриллы, кортикальный слой, ламеллоподии, филоподии и некоторые другие (Small, 1988). В культивируемых животных клетках все актиновые структуры можно разделить на две основные группы в соответствии с тем, полярно ли в них располагаются отдельные филаменты. Филоподии, или микроспайки, представляют собой тонкие (около 0,2 мкм толщиной) параллельные пучки актиновых филаментов, которые могут в разной степени выступать на поверхности клетки. Ламеллоподии - это плоские выступы на периферии клетки, актиновые филаменты в которых образуют сеть. Актиновые филаменты как в филоподиях, так и в ламеллоподиях располагаются полярно, их быстрорастущие плюс-концы ориентированы к краю клетки. Степень экспрессии и тех и других может сильно варьировать в зависимости от типа клеток, а также внешних условий. Эти цитоскелетные образования являются очень динамичными и принимают участие в таких процессах как распластывание клеток на субстрате, движение, а также фагоцитоз (Small et al., 1999). Примером актиновых структур со смешанной полярностью могут служить миофибриллы, стресс-фибриллы и кольцевые пучки. Они состоят из пучков биполярных филаментов, в состав которых входят актин и миозин II (Herman et al., 1981; Svitkina et al., 1995), обладают способностью сокращаться и при формировании требуют прикрепления клетки к субстрату (Nobes and Hall, 1995).
Первой убедительной цитологической демонстрацией зависимости транспорта митохондрий от микротрубочек была одновременная иммуно-локализация в культивированных клетках (Heggeness et al.,1978). Прямое доказательство участия микротрубочек в транспорте митохондрий было получено позже в клетках дрожжей (Yaffe et al.,1996) и в млекопитающих (Nangaku et al., 1994; Pereira et al., 1997; Tanaka et al., 1998). К настоящему времени накоплено много данных, свидетельствующих о том, что быстрое движение митохондрий в клетках происходит вдоль микротрубочек (Grafstein andForman, 1980; Hollenbeck, 1996).
Центробежный транспорт митохондрий и других органелл происходит с участием белков семейства кинезина, которые являются плюс-концевыми моторами, т.е. движение идет по направлению к плюс-концам микротрубочек (Brady, 1991; Schroer and Sheetz, 1991; Vale et al., 1986). Из шести известных типов кинезинов, участвующих в транспорте органелл, движение митохондрий в клетке обеспечивают представители семейства кинезина-1 и кинезина-3. Кинезин-1 (или KIF5A) был обнаружен не только на поверхности митохондрий (Jellali et al., 1994; Khodjakov et al, 1998; Leopold et al., 1992), но и других органелл, например, малых везикул (Horiuchi et al., 2005; Inomata et al., 2003; Kamal et al., 2000; Kamal et al., 2001; Matsuda et al., 2003; Verhey et al., 2001). Его ингибирование приводило к остановке транспорта митохондрий в моторном аксоне Drosophila melanogaster (Pilling, 2005) и вызывало частичный коллапс митохондрий в соматических клетках (Tanaka et al., 1998; Wu et al., 1998). Другой моторный белок, кинезин-3 или KIFlBp, также участвует в движении митохондрий вдоль микротрубочек, что было показано в экспериментах на мышиных нейронах (Nangaku et al., 1994).
Прикрепление митохондрий к микротрубочкам и актиновым микрофиламентам
Многими авторами было замечено, что особенностью поведения митохондрий является то, что большую часть времени они пребывают в состоянии относительного покоя (Trinczek et al., 1999; De Vos et al., 2003). Вместе с быстрым транспортом вдоль микротрубочек это позволяет митохондриям локализоваться в местах, где их функции наиболее востребованы. Каким образом обеспечивается закрепление этих органелл на цитоскелете? Возможны два основных механизма: 1) подавление активности моторных белков, осуществляющих транспорт митохондрий; 2) образование связей митохондрий с цитоскелетными структурами (заякоревание) при помощи немоторных белков.
Поскольку многие известные молекулярные моторы являются фосфопротеинами, их фосфорилирование/дефосфорилирование может регулировать их активность. При этом может изменяться не только их активность (Matthies et al., 1993; Mcllvain et al., 1994; Chilcote and Johnson, 1990; Hamasaki et al., 1991; Barkalow et al., 1994), но также и их способность связывать транспортируемые органеллы (SatoYoshitake et al., 1992; Lee and Hollenbeck, 1995; Dillman and Pfister, 1994). Так, было показано, что опухолевый фактор некроза (TNF) ингибирует кинезин-1, осуществляющий транспорт митохондрий в направлении плюс-конца микротрубочек, активируя киназу, которая фосфорилирует его легкие цепи (De Vos et al., 2000). Понятно, что при нарушенной связи кинезина с митохондриями моторный белок не может исполнять роль прикрепляющей молекулы. Но, если связь сохраняется, а моторный белок не активен, митохондрии могут быть иммобилизованы на микротрубочках. К настоящему времени накоплено довольно много работ, в которых показано участие в прикреплении митохондрий к цитоскелету при помощи других механизмов (Leterrier et al., 1990, 1991; Krendel et al, 1998; Chada and Hollenbeck, 2004).
В ранних работах была обнаружена группа белков, связь которых с митохондриями приводит к ограничению их подвижности. Структурные белки, ассоциированные с микротрубочками, известны в литературе как MAPs (microtubule-assciated proteins). Это фибриллярные белки, которые обратимо связываются с микротрубочками и способствуют их полимеризации, придают им устойчивость против деполимеризующих агентов, а также вызывают образование пучков (Mandelkow and Mandelkow, 1995). Большинство этих белков, как например МАР2 и Таи, обнаружены в нейронах, в то время как МАР4 встречается почти во всех остальных тканях (Nguyen et al., 1999). В ряде работ было показано, что MAPs специфически взаимодействует с поверхностью митохондрий (Linden et al., 1989а; Linden et al., 1989b; Letemer et al., 1994a; Letemer et al., 1994b) и тем самым, подавляют их транспорт (Heins et al., 1991; Trinczek et al., 1999; Lopez et al., 1993). Интересно, что за связь с митохондриями, MAPs конкурируют, с ПФ. Присутствие очищенных субъединиц нейрофиламентов NF-H и NF-M ингибировало связывание МАР-2 с митохондриями in vitro (Leterrier et al., 1990, 1991). Связывание MAPs с микротрубочками регулируется при помощи фосфорилирования специфической протеинкиназой (Lopez et al., 1993). В первичной культуре сенсорных нейронов фосфорилирование одного из MAPs, Таи коррелировало со стимуляцией транспорта крупных органелл в аксонах под действием цАМФ (Sato-Harada et al., 1996). Таким образом, ингибирующее действие МАР на транспорт органелл обратимо и зависит от фосфорилирования.
Другим регулятором сродства MAPs к микротрубочкам является МАРмодулин. Этот белок взаимодействует с МАР2, МАР4 и Таи и вызывает их диссоциацию с микротрубочек, что приводит к увеличению подвижности органелл (Itin et al., 1999). МАРмодулин также стимулировал транспорт,между эндосомами и транс-Гольджи в то время как MAPs его ингибировали (Ulitzur et al., 1998).
Многие данные указывают на то, что полимерный актин препятствует транспорту митохондрий in vivo. Так было показано, что митохондрии собираются в областях богатых актином, но практически лишенных микротрубочек и промежуточных филаментов, например, в пре-синаптической зоне и конусах роста, в нервных клетках (Peters et al., 1991). Разборка актиновых филаментов в клетке приводила к увеличению скорости движения митохондрий вдоль микротрубочек в теломоцитах морского ежа (Krendel et al., 1998). Наконец, участие актиновых микрофиламентов в регуляции движения митохондрий было показано при изучении быстрого аксонального транспорта и подвижности их в фибробластах (Chada and Hollenbeck, 2003; Chada and Hollenbeck, 2004; Minin et al., 2006).
Стимуляция аксона ростовым фактором нейронов (NGF), прикрепленным к латексным шарикам, приводила к тому, что митохондрии скапливались вблизи стимулируемых участков клетки и переставали двигаться. Этот эффект был специфичен для митохондрий, поскольку NGF никак не влиял на транспорт и распределение других органелл в клетке. Такое скапливание митохондрий полностью нарушалось после деполимеризации актиновых филаментов латрункулином Б (Chada and Hollenbeck, 2004).
Другим примером участия F-актина в регуляции подвижности митохондрий могут служить данные, полученные в нашей лаборатории (Minin et al, 2006). Как известно, в клетке существует, по крайней мере, два механизма образования новых актиновых филаментов. Первый механизм связан с участием белкового комплекса Агр2/3, когда образуется разветвленная сеть микрофиламентов (Pollard et al., 2000; Pollard et al.,2002; Evangelista et al, 2003; Mullins et al, 1998). По другому механизму белки из семейства форминов индуцируют полимеризацию неразветвленных актиновых филаментов (Evangelista et al, 1997; Watanabe et al., 1999; Pruyne et al., 2002; Copeland et al., 2002).
Получение покровных стекол, покрытых фибронектином или его фрагментами
Фибронектин очищали из замороженной плазмы крови человека, которую предварительно размораживали при температуре 37С. К плазме добавляли 9 частей буфера А (10 мМ трис рН 7.5, 150 мМ NaCl) и дальнейшие процедуры проводили при комнатной температуре. Полученный раствор наносили на колонку (2,6 см х 15 см) с желатин-сефарозой (Sigma, США), после чего колонку промывали шестью объемами буфера А, а затем элюировали фибронектин 4 М раствором мочевины в буфере А, собирали фракции с оптической плотностью больше 0.2 О.Е. при 280нм. Объединенные фракции два раза диализовали при 4С против 50 объемов буфера А. Полученный фибронектин лиофильно высушивали и использовали для получения фрагментов фибронектина.
Фрагменты фибронектина получали после его гидролиза а-химотрипсином (Sigma, США). К раствору фибронектина в концентрации около 1 мг/мл в буфере А добавляли сухой а-химотрипсин в соотношении 1:100 к количеству белка фибронектина. Инкубировали смесь при 37С около 1-2 часов. Время протеолиза контролировали при помощи SDS-электрофореза по исчезновению полноразмерного фибронектина. Останавливали реакцию добавлением PMSF. Гидролизат наносили на колонку с желатин-сефарозой для связывания коллаген-связывающих фрагментов фибронектина. Смесь фрагментов, не связавшихся с желатин-сефарозой, наносили на колонку (1,6 см х 9 см) с гепарин-сефарозой (Sigma, США), которую промывали пятью объемами буфера 10 мМ трис рН 7.5 с 200 мМ NaCl, а затем связавшиеся белки элюировали буфером 10 мМ трис рН 7.5c500MMNaCl.
Собранные фракции, содержащие гепарин-связывающие фрагменты фибронектина, осаждали сухим сульфатом аммония из расчета его концентрации 80% насыщения, собирали осадок центрифугированием, растворяли в минимальном объеме 50 мМ цитрата натрия рН 7.5 (буфера Б) и хроматографировали на колонке с сефакрилом S-200, уравновешенной буфером Б. Фракции, содержащие три основных компонента с молекулярными массами 30 - 40 кДа, объединяли и лиофильно высушивали.
Не связавшимся с гепарин-сефарозой оказывался фрагмент фибронектина с молекулярной массой 120 кДа. Для его очистки смесь белков осаждали сухим сульфатом аммония в концентрации 80% насыщения, осадок собирали центрифугированием, растворяли в минимальном объеме буфера Б и хроматографировали на колонке с сефакрилом S-200 высотой 100 см, уравновешенной буфером Б. Собранные фракции анализировали при помощи SDS-электрофореза, содержащие фрагмент 120 кДа объединяли и белок лиофильно высушивали.
Для освобождения гидроксильных групп на поверхности стекла (активации стекла), использовали 1М раствор КОН и обработку ультразвуком в течение 15 минут. После этого стекла промывали в деионизованной воде. Промытые водой стекла переносили в ацетон, а затем в раствор APTS в ацетоне (1 мл APTS в 75 мл ацетона) и оставляли на 5 минут. После этого промывали их в ацетоне и в деионизованной воде. Затем стекла, несущие на поверхности ЫНг-группы, высушивали и хранили в защищенном от света и пыли месте.
Для активации стекла 2 часа инкубировали с 1 % раствором глутарового диальдегида в 0,1 М ЫаНСОз. Затем их промывали несколько раз водой и 0,1 М №НСОз. Таким образом, получались стекла, поверхность которых несла альдегидные группы, способные реагировать с аминогруппами различных белков. Для проверки равномерности активации стекол использовали суспензию латексных шариков диаметром 0.5 цм с NH2-rpynnaMH на поверхности. Латексные шарики покрывали поверхность стекол сплошным и равномерным слоем.
Раствор фибронектина (1мг/ мл) (или его фрагментов: 40 кДа и 120 кДа) перед использованием центрифугировали 40 000 об/мин при температуре 25С. На каждое стекло наносили раствор белка и инкубировали во влажной камере 16-20 часов при + 4С, после чего промывали водой и 0,1 M NaHCCb. Оставшиеся свободные альдегидные группы забивали раствором 0,1 М глутаминовой кислоты в 0,1 М NaHCCb, в течение 4 часов во влажной камере при + 20С и промывали несколько раз водой и сушили.
Процесс удлинения и распределения митохондрий на периферии клетки зависит от взаимодействия их с микротрубочками
Таким образом, изменение формы и локализации митохондрий в клетках происходит при добавлении в среду целого фибронектина или его фрагмента, содержащего гепарин-связывающий домен. Можно предположить, что действие фибронектина, по-видимому, направлено на регуляцию взаимодействия митохондрий с актиновыми структурами в клетке. 1,4. Процесс удлинения и распределения митохондрий на периферии клетки зависит от взаимодействия их с микротрубочками. Поскольку транспорт и локализация митохондрий в клетках зависит от микротрубочек, мы решили проверить, зависит ли от них и изменение формы этих органелл при добавлении фибронектина в среду. Для этого, в клетках, прикрепленных к фибронектину, перед добавлением фибронектина в среду, микротрубочки деполимеризовали холодом, а затем перед нагреванием до 37С к ним добавляли нокодазол. В качестве контроля были использованы 49 клетки, которые инкубировали на холоде, а затем нагревали, не добавляя нокодазол. На рис.8 полученные данные представлены в виде гистограмм, показывающих распределение митохондрий по форме. Видно, что в контрольных клетках после добавления фибронектина в среду длина митохондрий увеличивалась, в то время как, в клетках, к которым был добавлен нокодазол, форма митохондрий не изменялась. Рис. 8. Удлинение митохондрий при добавлении фибронектина зависит от микротрубочек. Перед добавлением фибронектина микротрубочки разрушат холодом, а затем нагревали до 37Х? без добавления (контроль) или при добавлении 10 мкМ нокодазвла Таким образом, изменение формы митохондрий в клетках, распластанных на стеклах с фибронектином в бессывороточной среде, в ответ на добавление фибронектина в среду зависит от микротрубочек. 1.5. Локализация митохондрий па периферии клетки.
Одним из известных ростовых факторов, стимулирующих образование актиновых стресс-фибрилл и фокальных контактов, является ЛФК (Ridley and Hail, 1992). В клетках, культивируемых в среде, содержащей сыворотку, ЛФК вызывает заякоривание митохондрий на периферии (рис. 9 а). При добавлении ЛФК к клеткам, прикрепленным к стеклам, покрытым фибронектином, не происходило удлинение митохондрий, и они располагались ближе к ядру (рис. 9 б). После добавления фибронектина в среду митохондрии удлинялись, и под действием ЛФК происходило их заякоревание на периферии клетки (рис. 9 в). Таким образом, ЛФК не оказывает влияние на локализацию и морфологию митохондрий в клетках при отсутствии растворенного фибронектина в бессывороточной среде. В целом наши данные свидетельствуют о том, что для взаимодействия митохондрий с цитоскелетом необходимо наличие фибронектина, который оказывает большое влияние на формирование цитоскелета в клетке, и тем самым, является внеклеточным регулятором распределения митохондрий. 2. Роль промежуточных филамеитов в распределении митохондрий. Ранее в нашей лаборатории было показано, что F-актин, который образуется в результате действия белка mDial из семейства форминов, специфически взаимодействует с митохондриями и ограничивает их
