Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Трансформация клеток и приобретение ими опухолевого фенотипа 8
1.1.1. Молекулярные аспекты иммортализации 1. 10
1.1.2. Контактное торможение 15
1.1.3. Рост в неприкрепленном состоянии, анойкис .19
1.2. Реверсия опухолеродных клеток к неопухолеродному фенотипу 23
1.2.1. Индуцированные реверсии 24
1.2.2. Спонтанные реверсии : 29
1.2.3. Спонтанные реверсии как источник дремлющих метастазов 30
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Клеточные линии и культуры 35
2.1.1. Оценка роста клеток в сингенных животных 35
2.1.2. Оценка контактного торможения клеток по включению Н-тимидина 36
2.1.3. Оценка способности клеток к росту в неприкрепленном состоянии 37
2.2. Выделение суммарной РНК из клеток 37
2.3. ДНКазная обработка и анализ выделенной РНК'. 38
2.4. Обратная транскрипция 38
2.5. Определение относительных концентраций полученной кДНК методом полуколичественного ПЦР: 39
2.6. Сравнение уровней экспрессии исследованных генов в различных клетках методом полуколичественного ПЦР 39
2.7. Математическая обработка полученных данных. 41
2.8. Проточная цитофлюорометрия 42
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 44
3.1. Сравнение ростовых характеристик злокачественных и ревертантных линий и клонов in vitro и in vivo 44
3.1.1. Оценка опухолеродности клеток по росту опухолей в сингенных животных.44
3.1.2. Оценка опухолеродности клеток по основным параметрам роста in vitro. 46
3.2. Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантных линиях и клонах in vitro и in vivo 50
3.2.1. Оценка уровней синтеза мРНК основных ростовых факторов клетками in vitroSO
3.2.2. Оценка уровней синтеза мРНК рецепторов ростовых факторов клетками in vitro и in vivo 55
3.2.3. Оценка уровней синтеза мРНК Гепатоцитарного Ростового Фактора (HGF) опухолевыми и псевдонормальными клетками in vitro и in vivo 61
3.3. Сравнение злокачественных и псевдонормальных клеток по содержанию белковых продуктов исследованных генов 70
3.3.1. Сравнение опухолевых и псевдонормальных клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, по содержанию белковых продуктов HGF, HGFR и EGFR 71
3.3.2. Сравнение количества белкового продукта HGF в псевдонормальных клетках, находящихся в логарифмической фазе роста и в GO, обусловленной контактным торможением (конфлюэнтные клетки) 74
3.4. Реакция клеток на HGF, EGF и PDGF АА 79
3.4.1. Эффективность спасения клеток от апоптоза в присутствии HGF, EGF и PDGF
АА 79
3.4.2. Влияние антител против рецептора HGF на пролиферацию и аполтоз клеток80
Заключение 81
Выводы 85
Список цитированной литературы 86
- Реверсия опухолеродных клеток к неопухолеродному фенотипу
- Выделение суммарной РНК из клеток
- Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантных линиях и клонах in vitro и in vivo
- Сравнение злокачественных и псевдонормальных клеток по содержанию белковых продуктов исследованных генов
Введение к работе
Актуальность исследования. Одной из наиболее серьезных проблем клинической онкологии является метастазирование опухолей и, особенно, молчащее метастазирование. Молчащие (дремлющие) метастазы практически не поддаются ранней диагностике, а клетки таких метастазов отличаются повышенной резистентностью к различным типам противоопухолевой терапии. Указанные проблемы являются следствием того, что метастазировавпше клетки очень долгое время способны находиться в состоянии покоя (GO). Данный феномен представляется труднообъяснимым в рамках классической теории канцерогенеза, которая гласит, что трансформированная клетка теряет все основные механизмы негативного контроля клеточного цикла и, соответственно," не способна прекращать деление. Однако, более поздние трактовки данной теории говорят о том, что -злокачественность является количественным признаком и, соответственно, клетки могут не только прогрессировать по данному признаку, но и самопроизвольно возвращаться (ревертировать) к исходному фенотипу. Первые работы относительно возможности таких реверсий появились около 25 лет назад, однако, только в начале 90-х годов прошлого века было показано, что способность к спонтанной реверсии является универсальным свойством практически всех опухолевых линий in vitro. Более того, было показано, что спонтанные реверсии являются скорее результатом эпигенетических изменений, чем изменений на уровне генома. В пользу данного утверждения свидетельствуют высокие (в некоторых случаях до 50%), не сопоставимые с мутационными, частоты появления таких ревертантов.
Реверсия злокачественных клеток к неопухолевому фенотипу сопровождается і восстановлением основных механизмов, регулирующих пролиферацию нормальных клеток, таких как: контактное торможение, зависимость от ростовых факторов и внеклеточного матрикса, апоптоз. Однако, такие ревертанты обладают неустойчивым
фенотипом и способны вторично трансформироваться через различные промежутки времени, а их прививка сингенным животным приводит, с определенной вероятностью, к возникновению опухолей через достаточно длительный латентный период (сопоставимый с таковым при молчащем метастазировании). Поэтому, в случае ревертантов говорят не о нормальном, а о псевдонормальном фенотипе. Таким образом, источником дремлющих метастазов, по-видимому, являются опухолевые клетки, временно ревертировавшие к псевдонормальному фенотипу.
На данный момент времени практически ничего не известно о механизмах таких реверсий, и исследования в этой области могут дать ключ не только к пониманию неких фундаментальных законов клеточной биологии, но и дать толчок к развитию новых методов прогнозирования, диагностики и эффективной терапии молчащих метастазов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование эпигенетических изменений, сопровождающих процесс реверсии клеток in vitro, что и определило следующие задачи:
Разработать метод оценки степени трансформации клеток для: последующего использования при определении фенотипа исследованных клеток.
Проследить изменения в интенсивности синтеза мРНК наиболее универсальных ростовых факторов и их рецепторов, как основного инициирующего звена в формировании лролиферативных характеристик клеток, при изменении степени трансформированности как в сторону увеличения (опухолевая прогрессия), так и в сторону уменьшения (реверсия).
Сравнить профили содержания белковых продуктов генов, экспрессия которых наиболее достоверно коррелирует с тем или иным фенотипом, в; клетках, различающихся как по степени трансформации, так и по ростовым характеристикам.
Научная новизна. Представляемая работа является первой попыткой выяснить, как изменяется экспрессия ростовых факторов и их рецепторов при спонтанной реверсии
опухолевых клеток к псевдонормальному фенотипу с использованием наиболее адекватной для поставленных задач экспериментальной клеточной модели, которая на данный момент является уникальной.
Теоретическая значимость. Выявлены эпигенетические изменения, сопровождающие процесс реверсии опухолевых клеток фибробластического происхождения к псевдонормальному фенотипу. Даны оценки закономерностей между интенсивностью синтеза мРНК и белкового продукта гена HGF и формированием определенного фенотипа исследованных клеток, который оценивался по таким параметрам, как контактное торможение роста и зависимость от внеклеточного матрикса.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов прогнозирования, ранней диагностики, а возможно и эффективной терапии молчащих метастазов.
Реверсия опухолеродных клеток к неопухолеродному фенотипу
В молекулярной: генетике термин "реверсия" используется для того, чтобы определить процесс возвращения мутантного организма к. исходному фенотипу в результате обратной или компенсирующей мутаций,
В онкогенетике же этот термин используется, главным образом, как определение процесса возвращения трансформированных клеток к неопухолеродному фенотипу. При этом реверсия не означает обязательное наличие изменений в нуклеотидной последовательности. О реверсии обычно говорят на основании чисто морфологических изменений, происходящих с клетками, а именно: приобретение ими плоского фенотипа, контактного торможения, неспособности расти в округлом или неприкрепленном состоянии и образовывать опухоли у сингенных или бестимусных животных [Noda, 1993].Реверсии трансформированных клеток к неопухолеродному фенотипу и обратно in vitro описаны достаточно давно [Pollack et ah, 1970; Brouty-Boye et al, 1979; Ossowski, Reich, 1983]. В некоторых работах авторы говорят о снижении злокачественности [Rabinowitz, Sachs, 1968; Beer et о/., 1983], в частности Mondal с сотрудниками показалинижение злокачественности более чем в 100 раз по сравнению с высокомалигнизированным исходным клоном [Mondal et о/., 1971].Однако, несмотря на это, пристальный интерес к феномену реверсии возник в последнее десятилетие. С одной стороны это связано с быстроразвивающимися и удобными для изучения реверсий моделями, представленными клетками, искусственно трансформированными различными онкогенами, а с другой - в связи с поиском новых генов-супрессоров [Noda, 1993].
В случае клеток искусственно трансформированных теми или иными онкогенами вызвать реверсию достаточно просто. Для этого необходимо лишь "выключить" соответствующие онкогены или ослабить сигналы, идущие от них к ниженаходящимся мишеням. Достичь этого можно трансфекцией клеток векторами, экспрессирующими; доминантно-негативную форму искомого онкогена, его антисмысловую мРНК или антитела к его белковому продукту. То есть, клетки -ревертанты, точно так же, как и трансформированные клетки, можно получать, воздействуя практически на любые элементы сигнальных путей (от рецепторов до ядерных транскрипционных факторов),отвечающих за регуляцию клеточного цикла. Кроме того, поскольку к злокачественной трансформации могут приводить не только изменения в протоонкогенах, но и в генах -супрессорах опухолевого роста, то и клетки-ревертанты можно получать, восстанавливая активность этих генов замещением мутантных аллелей интактными.
На данный момент опубликовано великое множество работ, авторы которых показали возможность подавления опухолевого фенотипа тех или иных клеток через направленное воздействие на всевозможные элементы регуляторного механизма клетки.По классификации, предложенной Hunter в 1991 году [Hunter, 1991], первым, так сказать инициирующим звеном в сигнальных путях являются ростовые факторы. Высокийуровень экспрессии того или иного ростового фактора в иммортализованных клетках типа ЗТЗ приводит, как правило, к формированию опухолевого фенотипа [Heldin, Westermark, 1989], что является следствием аутокринной стимуляции: клеток. Соответственно искусственное подавление экспрессии или активности таких ростовых факторов может привести к снижению или полному исчезновению опухолевого фенотипа. Так, например, было показано, что клетки BALB/c ЗТЗ, искусственно трансформированные PDGF-A или PDGF-B, ревертировали к нормальному фенотипу под влиянием доминантно-негативных мутантов (ДНМ) PDGF, причем реверсия была ген-специфической, поскольку такие мутанты не вызывали реверсий клеток, трансформированных Ha-ras или v-src [Shamah et at, 1993]. В похожей работе PDGF-0 мутантний белок, не связывающийся с рецептором, будучи трансфецированным в c-sis трансформированные ЗТЗ клетки, вызывал реверсию: последних [Vassbotn et at, 1993]. В некоторых случаях подавление тех или иных ростовых факторов приводит к реверсии не только искусственно трансформированных клеток, но и клеток спонтанно возникших опухолей. Трансфекция клеток NS2T2A1 (спонтанно трансформированные клетки эпителия молочной железы человека) вектором, экспрессируюшим антисмысловую мРНК амфирегулина (ростовой фактор из семейства EGF) приводила к тому, что эти клетки теряли способность к росту в неприкрепленном состоянии и образованию опухолей у бестимусных мышей [Ma et al., 1999].
Следующей группой онкогенов по классификации Hunter являются мембранные тирозиновые протеинкиназы, большая часть которых функционирует как рецепторы ростовых факторов. В силу того, что рецепторы являются звеном, передающим сигнал от ростовых факторов в цитоплазму, подавление их активности может вызывать реверсию не только клеток, трансформированных тем или иным рецептором, но и клеток, трансформированных соответствующим ростовым фактором. Доказательством такой концепции может служить работа, в которой показана реверсия клеток NIH ЗТЗ, трансформированных FGF-4, вызванная трансфекцией этих клеток мутантными формамигенов FGFR-1 и FGFR-2 [Li et a/., 1994]. При трансформации NIH ЗТЗ клеток активированным EGFR/ErbB2 реверсию вызывали трансфекцией другим мутантом ЕгЬВ2, у которого был испорчен киназный домен [Messerle et al, 1994]. Весьма оригинальный способ получить ревертанты этих клеток был описан в работе Hynes с сотрудниками. В клетки вводили ретровирусный вектор, экспрессирующий антитела против ЕгЪВ2 белка [Beerli et al, 1994], Позже, те же авторы, показали аналогичные результаты для антител против EGFRVErbBl [Jannot et at, 1996]. Реверсию клеток спонтанно возникшей опухоли (человеческой глиобластомы) наблюдали при подавлении экспрессии генов HGF и его рецептора c-met [Abounader et al. ,1999].
На следующей ступени иерархии согласно Hunter находятся ассоциированные с мембраной GTP-связывающие ОТРазы (G-белки), к которым, в том числе, относятся и белки семейства Ras. G-белки обеспечивают передачу сигнала с рецепторних тирозин-киназ на цитоплазматические протеин-киназы, которые, в свою очередь, регулируют активность ядерных транскрипционных факторов. Активация самих G-белков зависит от конкурентного действия GTPase-активирующих белков (GAP) и гуанин нуклеотид обменных факторов (GEF) [Cabrera-Vera et al., 2003]. Находясь практически на главном перекрестке сигнальных путей, G-белки являются очень удобными мишенями- для воздействий, направленных на подавление злокачественности. При этом воздействовать можно не только непосредственно на G-белки [Greulich, Hanafusa, 1996], но и на различные компоненты сигнальных путей, отвечающие за регуляцию их" активности, Alberghina с сотрудниками добились реверсии Л-гаж-трансформированньгх фибробластов за счет повышенной экспрессии ДНМ GEFW1056E, которая приводила к значительному снижению внутриклеточного уровня комплексов Ras-GTP [Bossu et al, 2000]. Другая группа авторов показала, что мышиные эмбриональные клетки, трансформированные рецептором инсулиноподобного ростового фактора, ревертируют после трансфекции их
Выделение суммарной РНК из клеток
Клетки наращивали до количества 10-20x106. Далее клетки снимали с пластиковой, поверхности обработкой 0.05% раствором NaiEDTA, преципитировали, промывали бессьгеороточной средой и снова преципитировали. Осадок клеток лизировали 0.9 мл р-ра D (4М гуанидин изотиоцианат (BRL), 25мМ NaCitr (Sigma), 0.5% Sarcosyl (Fluka), 1% (}-меркаптоэтанол (Merk)), добавляли 0.1 мл 2M NaOAc, рН 4.0 (Sigma). Смесь тщательно перемешивали и добавляли 0.5 мл насыщенного водой фенола. После перемешивания добавляли 100 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали и выдерживали -15 мин при - 20С. Далее смесь центрифугировали и переносили водную фазу в новую пробирку. Еще 1-2 раза экстрагировали хлороформом, каждый раз перенося водную фазу в новую пробирку, и преципитировали РНК равным объемом изопропанола. После преципитации осадок растворяли в 450 мкл р-ра D, добавляли 50 мкл 2М NaOAc, рН 4.0 и 0,5 млнасыщенного водой фенола, 2-3 раза экстрагировали хлороформом и опять преципитировали 2.5 объемами 96% EtOH. Осадок промывали 70% EtOH и растворяли в буфере, содержащем 1 мМ NaCitr (Sigma), рН 6.35 и lx "RNA Secure Reagent" (Ambion.Inc, Cat# 7006).
Для удаления остатков геномной ДНК раствор РНК ( 1мкг/мкл) обрабатывали RQ1 RNase-free DNase (Promega, Cat#M6101) 1 ел/10 мкг РНК при t 37С в течение 30 мин. ДНКазу инактивировали прогреванием реакционной смеси до 75С в течение 5 мин. После ДНКазной обработки часть РНК анализировали электрофорезом в 1.2% агарозном геле, 1х MOPS буфер (20мМ MOPS (3-(N-morpholino) propansulfonic acid), 5мМ NaOAc, ІмМ EDTA, рН 5.5-7.0), 0.22M формальдегид. Гель окрашивали бромистым этидием и сканировали на УФ трансиллюминаторе специализированной системой обработки изображений "BIOTEST" (Институт Эпидемиологии, Москва).
К раствору, содержащему 2-5 мкг суммарной РНК, добавляли 2 мклЛООмкМ р-ра олиго dT(6, прогревали смесь при 75 С 5 мин с последующим отжигом при 4 С в течение 5 мин. Далее к реакционной смеси добавляли "Master-Mix", содержащий буфер для обратной транскриптазы, DTT, MgCb, МпСЦ, dNTP, RNase Inhibitor (Ambion.Inc, Cat#2684) и MMLV РНК-зависимую ДНК-полимеразу (Биосан), до конечного объема 40 мкл. При этом конечные концентрации реагентов в реакционной смеси составляли: 2.5мкМ олиго dTi6, ЮмМ Tris-HCl, рН 8.0, 75мМ КС1, ЮмМ DTT, 1.25мМ MgCl2 и МпС12, 1мМ каждого из dNTP, 1ед/мкл RNase inhibitor, 2.5ед/мкл MMLV РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Реакционную смесь инкубировали при 38 С в течение 1 часа/ Далее смесь прогревали при 95 С 5 мин: для инактивации ферментов. Полученную кДНКпреципитяровали 96% ЕЮН, осадок промывали 70% EtOH и растворяли в 2х ТЕ (20мМ Tris-HCl, рН 7.4,0.2мМ EDTA).
Часть полученной кДНК разбавляли в 10 и 30 раз. После этого проводили ПЦР с праймерами, специфичными к гену Р-Актина (5 -GACGGGGTCACCCACACTGT и 5-GAGTACTTGCGCTCAGGAGGAG). ПЦР проводили в 20мкл реакционной смеси, содержащей 67мМ Tris-HCl, рН 8.9, 16мМ (NH4)2S04) 1.5мМ MgCl2, 0.01% Tween20, 250мкМ каждого dNTP, 1.5-2.5мкМ каждого праймера и 1ед/мкл Taq ДНК-полимеразы, на амплификаторе "Mastercycler Personal" (Eppendorf). Условия амплификации:1-й цикл: 95С - 3 мин, 67С - 40 сек, 72С - 40 сек2-27-й циклы: 95С - 40 сек, 67С - 40 сек, 72С - 40 сек.
В качестве стандарта использовали кДНК нормальных фибробластов мышей линии СВА. Продукты ПНР анализировали в 1.5% агарозном геле, lx ТАЕ. Гель окрашивали бромистым этидием и сканировали как описано в п.2.3. Интенсивность полос, соответствующих продукту амплификации гена Р-Актина, определяли с помощью программы "Intelligent Quantifier" (Bio Image Systems Corporation). После этого полученную кДНК разводили до концентрации, соответствующей стандарту.кДНК, полученную из различных клеток нашей модели и выровненную по концентрации как описано выше, использовали для сравнения уровней экспрессии различных генов, Для этого брали по 1мкл каждой пробы кДНК и проводили ПЦР с использованием специфических праймеров. Условия ПЦР варьировали в зависимости от tплавления каждой пары праимеров и концентрации кДНК исследуемого гена. Количество циклов амплификации подбирали эмпирически так, чтобы увеличение количества ПЦР продукта находилось в линейной области. Продукты ПЦР анализировали в 1.5% агарозном геле, їх ТАЕ. Гель окрашивали бромистым этидием и сканировали как описано в п.2.3. Интенсивность полос, соответствующих продукту амплификации исследуемого
Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантных линиях и клонах in vitro и in vivo
Известно, что в процессе трансформации многие клетки приобретают такое свойство, как самодостаточность в митогенных сигналах, что позволяет им поддерживать высокий уровень пролиферации в независимости от окружающей среды [Hanahan, Weinberg, 2000]. Как правило, это обеспечивается за счет повышенного синтеза такими клетками различных ростовых факторов [Spom, Roberts, 1985; Lang, Burgess, 1990]. С другой стороны, направленное подавление экспрессии в злокачественных клетках тех или иных ростовых факторов во многих случаях приводит к реверсии опухолевого фенотипа [Zhang, Serrero, 1998; Ma etai, 1999; Lu, Serrero, 2000]. Исходя из приведенных данных, нами была сформулирована рабочая гипотеза, согласно которой спонтанная реверсия опухолевых клеток может являться следствием эпигенетических изменений, приводящих к снижению уровня экспрессии ростовых факторов этими клетками. Поскольку известно, что основным механизмом, регулирующим количество того или иного белка в клетке, является контроль на уровне транскрипции соответствующего гена, мы решили на начальном этапе работы сравнить количество мРНК девяти ростовых факторов (PDGF-A, PDGF-B, FGF-1, FGF-2, HGF, IGF-1, IGF-2, TGFa и TGFP) в злокачественных и ревертантных клетках нашей модели. Для работы мы взяли несколько злокачественных клеточных линий и клонов трех, независимо полученных сарком (FCBA2V40, FC3H3V7 и FC3H4V8), оті до 2 соответствующих ревертантов, а также нормальные эмбриональные фибробласты мышей СВА и клетки гепатомы МН22а.
В результате панель клеток выглядела следующим образом: 1, FCBA2V40 (V40) - неклонированная матричная культура злокачественных клеток; 2. FCBA2V10.23.2 (23.2) - неопухолевый ревертантный клон, полученный из матричной культуры FCBA2VI0; 3. FCBA2V10.23.2.5 (23.2.5) - неопухолевый ревертантный клон, полученный из 23.2; 4. FC3H3V7.33.7 (33.7) - злокачественный клон, полученный из матричной культуры FC3H3V7; 5. FC3H3V7.29.1 (29.1) — злокачественный клон, полученный из матричной культуры FC3H3V7; 6. FC3H3V7.20.2.4 (20.2.4) - неопухолевый ревертантный клон, полученный из матричной культуры FC3H3V7; 7. FC3H3V7J0.H (10.Н) - неопухолевый ревертантный клон, полученный из матричной культуры FC3H3V7; 8. FC3H4V8.5.5.3 (5.5.3) - злокачественный клон, полученный из промежуточного клона FC3H4V8.5; 9. FC3H4V8.5.6.4 (5.6.4) - неопухолевый ревертантный клон, полученный из промежуточного клона FC3H4V8.5; 10. FCBA0 - культура нормальных эмбриональных фибробластов мышей СВА; 11. МН22а — некпонированная матричная культура гепатомы мышей СЗН. Приведенные на рисунке 3.2 результаты экспериментов (номера дорожек соответствуют номерам указанных клеточных линий) показывают, что в целом транскрипция исследованных ростовых факторов в злокачественных и ревертантных клетках носит случайный характер и практически не коррелирует с определенным фенотипом. Для таких факторов, как FGF-1, PDGF-A, PDGF-B, TGFa, IGF-1 и IGF-2 характерно полное отсутствие каких-либо закономерностей, и даже более того, в некоторых случаях ревертантные клетки характеризуются более высоким уровнем экспрессии данных факторов по сравнению с их злокачественными предшественниками. В случае FGF-2 и TGFp наблюдалось достоверное снижение количества соответствующей мРНК в ревертантных клетках линии FCBA2 (23.2 и 23.2.5) по сравнению со злокачественной линией V40, но при этом такие различия практически отсутствовали у клеток линий FC3H3 и FC3H4. FGF-1 Единственным ростовым фактором, характер экспрессии которого более или менее укладывался в рамки нашей гипотезы, оказался гепатоцитарный ростовой фактор (HGF). Экспрессия HGF была значительно снижена в ревертантных клонах линий FCBA2 и FC3H3 по сравнению с их злокачественными аналогами.
Отсутствие мРНК HGF в злокачественных клетках МН22а объясняется, по-видимому, их эпителиальным происхождением, а практически неопределяемый уровень этой MPFDC В клетках клонов 29.1 и 5.5.3 - недостаточной концентрацией кДНК. Полученные результаты, а именно практически полное отсутствие каких-либо корреляций, вызвали у нас определенные сомнения в адекватности используемого метода. Для разрешения данной проблемы мы решили попробовать воспроизвести результаты, полученные другим методом. Ранее методом Northern-гибридизации мы показали, что реверсия опухолевых клеток сопровождается значительным снижением уровня транскрипции такого важнейшего транскрипционного фактора, каким является гомодимер c-Jun/c-Jun (одна из мажорных форм транскрипционного фактора АР-1) [Lavrovsky et ai, 1994]. Соответственно, мы решили, используя метод R.T-PCR, проверить, как изменяется экспрессия c-jun в клетках данной = панели. Действительно, для злокачественных и ревертантных клеток линий FCBA2 и FC3H3 ранее полученные данные полностью подтвердились, однако, в случае клеток линии FC3H4 и МН22а достоверных различий показано не было. Более того, количество мРНК c-jun в этих клетках было сравнимо с таковым в нормальных фибробластах. По-видимому, уровень экспрессии c-jun определяет скорее: скорость пролиферации клеток, а не их трансформированный фенотип (т.е. отсутствие контактного торможения и способность роста в неприкрепленном состоянии). Это подтверждается и данными, полученными при анализе ростовых характеристик этих клеток: клетки клона 5.5.3 и МН22а росли значительно медленнее, чем клетки V40,33.7 и 29.1 как in vitro, так и in vivo. Таким образом, по завершении этого этапа работы мы могли с уверенностью сказать, что использованный нами метод RT-PCR вполне адекватен поставленной задаче.
Однако, результаты экспериментов с HGF и EGF показали, что хотя концентрация кДНК, использованной нами на этом этапе работы, и была достаточна для эффективной амплификации большинства из исследованных генов, тем не менее в некоторых случаях мы работали на грани чувствительности метода, как в случае HGF, когдау эффективная наработка специфического ПЦР продукта наблюдалась только в пробах с очень высоким содержанием матрицы, и, особенно, EGF, кДНК которого практически не амллифицировалась вообще. Поэтому в дальнейшем мы использовали пробы кДНК со значительно более высокой общей концентрацией. Основываясь на полученных по ростовым факторам данных, мы спланировали дальнейшую работу следующим образом: 1. Расширить используемую панель клеток;
Сравнение злокачественных и псевдонормальных клеток по содержанию белковых продуктов исследованных генов
Кроме HGF и его рецептора мы исследовали еще рецептор для эпидермадьного ростового фактора. Как было показано ранее (п.3.2.2), мРНК этого рецептора достоверно снижалась в неопухолевых клетках линии FCBA2, и нам было интересно проверить, сохраняется ли эта тенденция для белка, Для анализа белковых продуктов HGF, HGFR и EGFR мы выбрали несколько клеточных линий и клонов так, чтобы в полученной выборке были представлены как злокачественные, так и ревертантные клетки FCBA2 и FC3H3. В результате панели клеток выглядели следующим образом: Результаты экспериментов в виде диаграмм приведены на рисунках 3.6 и 3.7, при J этом для удобства мы привели данные, как по белку, так и по мРНК. Полученные результаты показали, что разницы по содержанию белка в исследованных клетках крайне незначительны (не более 2-х раз). Принимая во внимание то, что использованный нами метод позволяет определять только общее содержание определенного белка на клетку, а не его концентрацию, мы предположили, что указанные различия могут быть связаны с размером клеток. Так, например, при визуальном анализе клетки клона 31.6.4 выглядят раза в 1.5-2 крупнее, чем клетки 20.2.4 или 10.Н, что приблизительно соответствует разнице в количестве белка. Исходя из этого, мы предположили, что концентрация HGF в исследованных клетках практически одинакова и не коррелирует с количеством мРНК. Аналогичные результаты мы. получили и для рецептора HGF. Как видно из рисунков, профили этих двух белков (HGF и HGFR) практически полностью совпадают при почти полном отсутствии какой-либо корреляции с количеством мРНК. Совсем труднообъяснимую картину мы получили при анализе белкового продукта EGFR.
В этом случае отсутствовали не только корреляции с количеством мРНК, но и с фенотипом и размером клеток. И если в случае клеток FC3H3 можно было говорить о положительной корреляции между количеством; EGFR и степени контактного торможения, то в случае клеток FCBA2 картину "портили" клетки клона V40.1.2. Для разъяснения указанной картины требовались дополнительные исследования, которые не были проведены в силу известных финансовых проблем. Таким образом, полученные данные показали, что активно делящиеся клетки, как злокачественные, так и незлокачественные, практически не отличаются между собой по концентрациям белковых продуктов HGF и его рецептора, а концентрации белкового продукта EGFR нельзя связать с каким-либо признаком. 3.3.2. Сравнение количества белкового продукта HGF в псевдонормальных клетках, находящихся в логарифмической фазе роста и в GO, обусловленной контактным торможением (конфлюэнтные клетки) Ранее (п.3.2.3) мы говорили о корреляции между количеством мРНК HGF и способностью клеток к контактному торможению. Соответственно, мы решили проверить, как изменяется количество белка в псевдонормальных клетках при переходе в фазу GO, обусловленную контактным торможением. Для этого мы взяли два клона- 23.2 и V40.1.2, характеризующиеся высокой степенью контактного торможения (С = 11,29 и 9,97 соответственно). Клетки этих клонов были исследованы в двух состояниях: 1. Состояние активного деления (предконфлюэнтный монослой); Состояние покоя (2 суток в конфлюэнтном I. Значительная часть популяции (до 70%) практически полностью теряет соответствующий белок; 1. Оставшаяся часть популяции содержит на -25% меньше указанного белка. Интересно отметить, что в популяции активно делящихся клеток клона 23.2 также присутствует субпопуляпия, не содержащая белка HGF, хотя процент таких клеток несравненно ниже. Очевидно, это связано с некоторой неравномерностью распределения растущих клеток в монослое, т.е., несмотря на то, что клетки. заняли еще не всю доступную поверхность культуральнои посуды и продолжают делиться,, в некоторых местах, тем не менее, монослой уже конфлюэнтный, и клетки перешли в GO. Для рационального объяснения полученных результатов мы предложили несколько гипотез. Согласно первой гипотезе, клетки при контактном торможении теряют HGF, что позволяет им спокойно перейти в состояние покоя. Наличие двух субпопуляций — окрашенной и неокрашенной, отражает лишь динамику процесса, т.е. часть клеток, которые остановились раньше, полностью потеряли белок, а оставшаяся часть еще не успела, но находится в процессе. Вторая гипотеза также предполагает необходимость потери HGF клетками для остановки в GO, но при этом мы рассматриваем окрашенную субпопуляцию не как часть клеток, не успевших потерять белок, а как некий источник того минимального количества HGF, которое необходимо для поддержания нормального существования популяции. Несмотря на некоторые различия, обе эти гипотезы предполагают необходимость подавления синтеза HGF для перехода клеток в GO.
Соответственно у нас возник вопрос, почему при приблизительно одинаковом содержании белкового продукта HGF у ревертантов и трансформированных клеток первые, тем не менее, способны к контактному торможению, а вторые — нет. Мы предположили, что основной причиной этого являются различия в количестве соответствующей мРНК. По-видимому,. того количества мРНК, которое имеется у ревертантов, вполне достаточно для эффективного синтеза необходимого количества HGF в делящихся клетках, которое приблизительно одинаково и для ревертантов, и для трансформированных клеток. Далее, по достижении конфлюэнтного монослоя в клетках запускаются некие механизмы, подавляющие эффективность синтеза соответствующих белков. В результате, синтез HGF в ревертантах практически полностью подавляется, в то время, как у трансформированных клеток, за счет несравненно более высокого уровня мРНК, данный белок продолжает нарабатываться в количествах, достаточных для пролиферации даже в условиях конфлюэнтности. Для того, чтобы как-то проверить данную гипотезу, мы сравнили уровни мРНК а субъединицы эукариотического фактора инициации трансляции eIF2 в делящихся и конфлюэнтных клетках. Для экспериментов мы взяли несколько линий и клонов из обеих групп (СВА и СЗН). Результаты экспериментов приведены ниже, на рисунке 3.9. Клетки FC3H
