Содержание к диссертации
Введение
Апоптоз б
Понятие апоптоза 6
Функции апоптоза 7
Модели изучения апоптоза 8
Морфология, биохимия и генетика апоптоза 9
Индукция апоптоза 11
Внутриклеточное развитие программы апоптоза 12
Завершение апоптоза 16
Защита от ПКС п
Некроз и апоптоз 19
Циклогєксимид 20
Анеуплоидия 22
Получение анеуплоидных клеток 22
Многополюсные митозы и анеуплоидные клетки 23
Распространенность в природе 24
Анеуплоидия и апоптоз 25
Материалы и методы 26
Культивирование клеток 26
Индукция апоптоза 27
Выявление апоптотических клеток 27
Получение патологических МИТОЗОВ 28
Электронная микроскопия 28
Иммунофлуоресцентные исследования 28
Постановка экспериментов 29
Статистика 31
Результаты 32
ЦГИ индуцирует апоптоз и блокирует пролиферацию 32
Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ 35
Ультраструктура апоптотических клеток 37
Изменения митохондрий в культуре СПЭВ 40
Действие колцемида 41
Накопление К-митозов 41
Получение многополюсных митозов 43
Прижизненные наблюдения за клетками, возникшими путем многополюсного митоза 44
Контроль 1 45
Контроль 2 47
Опыт 48
Обсуждение 53
ЦГИ индуцирует апоптоз и блокирует пролиферацию 53
Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ 57
Ультраструктура апоптотических клеток 60
Действие колцемида 63
Накопление К-митозов 63
Получение многополюсных митозов 65
Прижизненные наблюдения за клетками, возникшими путем многополюсного митоза 66
ВЫВОДЫ 75
- Морфология, биохимия и генетика апоптоза
- Многополюсные митозы и анеуплоидные клетки
- Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ
- Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ
Введение к работе
В ходе эволюции у клеток многоклеточных организмов возникли механизмы самоуничтожения - программированной клеточной смерти (ПКС) (Hale et al., 1996; Jacobson et al., 1997). Эти механизмы координируются на генетическом уровне и контролируются как внепшими, так и внутренними факторами. Одним из видов ПКС является апоптоз. Апоптоз сопровождает организм в течение всей его жизни, наряду с пролиферацией и дифференцировкой. Исследования апоптоза имеют важное прикладное значение. Они могут помочь в разработке методов лечения опухолевых, аутоиммунных, дистрофических, нейродегенеративных заболеваний.
Любые нарушения в процессе апоптоза, его избыток или недостаток приводят к возникновению различных заболеваний (Thompson et al., 1995). В частности, сбой программы апоптоза в генетически дефектных клетках становится причиной развития злокачественных опухолей (Wright, McMaster, 2002). Многие способы лечения опухолей направлены на то, чтобы запустить в раковых клетках сбившуюся программу самоуничтожения (Kim et al., 2002). Однако эффективность такого лечения оказывается неодинаковой для различных видов рака. И очень часто повышенной устойчивостью к противоопухолевым агентам обладают вторичные опухоли, развивающиеся после лечения первичных новообразований.
Мы высказываем предположение, что такая устойчивость вторичных опухолей к ранее действенным препаратам может быть связана с изменившейся структурой генома их клеток. Известно, что клетки опухолевой ткани активно пролиферируют. А поскольку контроль над целостностью генома в этих клетках нарушен, то делящиеся клетки нередко демонстрируют аномалии митоза, количество которых прогрессирует со временем (Алов, 1972; Онищенко, 1993). В результате подобных патологических митозов могут
возникнуть клетки с таким хромосомным составом, что они оказываются неспособными вступить в апоптоз (например, в силу утраты каких-то генов, ответственных за развитие программы гибели). Поэтому, в то время как основная масса клеток первичной опухоли успешно элиминируется в ходе химиотерапии, данные клетки, устойчивые к индукции апоптоза, выживают. Клон такой клетки впоследствии дает новую опухоль, мало чувствительную к ранее действенным препаратам.
Целью данной работы было проверить, возможно ли действительно в ходе аномального митоза получить клетку, устойчивую к индукции апоптоза.
Морфология, биохимия и генетика апоптоза
Изменения, происходящие с клетками во время апоптоза, сходны в большинстве типов клеток (некоторые отличия присутствуют в апоптозе нейронов, дрожжей). В апоптотической клетке на той или иной стадии можно зарегистрировать следующие явления: Разобщение с соседними клетками и субстратом. Изменение липидного состава плазматической мембраны. Фосфатидилсерин в норме присутствует в основном на цитоплазматической стороне бислоя, а при апоптозе перемещается на наружную сторону. Повышение экспрессии некоторых генов. Однако это происходит не во всех случаях ПКС. Увеличение уровня кальция в цитоплазме. Каскад каспаз, активация ими друг друга и прочих разрушающих клетку ферментов. Конденсация цитоплазмы за счет возникновения большого количества поперечных сшивок между белками. Конденсация хроматина. Расщепление ядерной ДНК на олигомеры из (180 п) пар нуклеотидов. Нарушение электронно-транспортной цепи в митохондриях и прекращение синтеза АТР. Разрушение ядерной ламины. Сжатие и фрагментация ядра. Появление специфических маркёров на поверхности клетки. Реорганизация цитоскелета. Фрагментация клетки на апоптотические тельца. Поглощение апоптотических телец макрофагами или соседними клетками. Специфичность апоптоза нейронов — в отсутствии конденсации хроматина и повышенного уровня кальция в цитоплазме (Ellis et al., 1991 b). Кроме того, у нейронов отмечают заметные поломки в структуре митохондрий, тогда как у остальных клеток и митохондрии, и другие органеллы не разрушаются до самого конца. Такое единообразие картины апоптоза позволяет выделить общие для всех типов клеток фазы апоптоза: 1. Индукция 2. Инициация 3. Эффекторная фаза 4. Образование и поглощение апоптотических телец Индукция апоптоза
Побудить клетку вступить в апоптоз могут как внешние стимулы, так и внутриклеточные сигналы. Кроме того, стимулом к смерти могут быть не только прямые сигналы к началу апоптоза, но также и отсутствие сигналов выживания. Доказано, что большинство клеток высших животных нуждается в сигналах других клеток, чтобы избежать ПКС (Raff et al., 1993; Elshamy et al., 1998). Исключение — бластомеры, которые выживают и в отсутствие сигналов выживания от других клеток. Некоторые клетки способны вырабатывать сигналы выживания сами для себя. Это характерно для тканей, образованных одним типом клеток — хрусталик, хрящ (Jacobson et al., 1997). Возможно, что гибель клеток может быть связана с неспособностью улавливать эти сигналы. Например, так происходит при развитии нервной системы (Raff et al., 1993): первоначально образуется избыток нейронов, каждый из которых стремится иннервировать свою мишень; сигналы выживания дают клетки-мишени (иннервируемые), и выживают только те нейроны, которым удалось достигнуть клетки-мишени. Помимо отсутствия сигналов выживания, ПКС может вызываться наличием собственно апоптотических сигналов. Сейчас известно множество химических соединений, обработка которыми побуждает клетку вступить в апоптоз. Это: 2-хлораденозин (Rufini et al., 1997), фарнезол (Miquel et al., 1996), геранилгераниол (Miquel et al., 1996), циклогексимид (Alessenko et и al.,1994, 1997), этопозид (Song et al., 1997) и многие другие. Однако все эти вещества являются чужеродными для живого организма. А в естественных условиях такими сигналами могут быть TNFa, Fas (Wallach et al., 1997), изменение уровня гормонов (Ellis et al., 1991b), а также вещества, которые в иных ситуациях являются индукторами дифференцировки и пролиферации (Hale et al., 1996; Ellis et al., 1991b, Kroemer et al., 1995), например, протеинкиназа с, церамид, р53, c-myc. Механизм действия всех этих химических соединений изучался и изучается многими группами ученых. Для некоторых веществ (TNFa, Fas) механизм уже детально установлен (Ashkenazi, Dixit, 1998), для других — еще недостаточно изучен.
Помимо внеклеточных сигналов, есть еще внутриклеточная индукция, например, при значительных повреждениях ядерной ДНК Искусственным индуктором в этом случае может быть у-облучение или ультрафиолет (Thompson, 1995), а естественным — вирусная инфекция. Итак, с одной стороны, ПКС может быть запущена путем рецептор-опосредованных физиологических стимулов (таких как принятие сигнала гибели, отсутствие сигналов выживания, комбинация противоречивых сигналов). С другой стороны, апоптоз может быть результатом генетических нарушений и других изменений, произошедших в самой клетке. Так, апоптоз может вызываться вирусной инфекцией, тепловым шоком, повышением уровня свободных радикалов (Thompson, 1995). Внутриклеточное развитие программы апоптоза В зависимости от индуктора возможны два способа инициации программы гибели - рецепторный и митохондриальный. Рецепторный апоптоз осуществляется через рецепторы на плазматической мембране, специально предназначенные для включения / программы апоптоза. Этот путь хорошо изучен на примере белков TNF-семейства. Одним из белков этого семейства, индуцирующих ПКС, является Fas-лиганд. Fas-лиганд (FasL) соединяется с Fas-рецептором (CD95) на поверхности клетки. Структура FasL такова, что одновременно он связывает и сближает три рецептора. Fas-рецептор — трансмембранный белок, который на цитоплазматической стороне имеет участок DD (death domain). Цитоплазматический белок FADD (Fas-Associated Death Domain Protein) состоит из такого же участка DD и участка DED (death effector domain). В прокаспазе-8 тоже есть DED. Все эти белки способны ассоциировать посредством одноимённых доменов, т.е. Fas взаимодействует с FADD через DD, a FADD взаимодействует с прокаспазой-8 через DED. Таким образом, на мембране оказывается целый комплекс белков: Fas/ FADD/ прокаспаза-8. А поскольку FasL сближает сразу три рецептора Fas, то сближенными оказываются три прокаспазы. Такое тесное соседство вызывает автокатализ и образование активной формы каспазы-8. Активная каспаза-8 запускает последующий каскад каспаз, ведущий к гибели клетки. Fas принадлежит семейству TNF-рецепторов. Помимо Fas и TNFR, сюда входят DR3, DR4, DR5 (Ashkenazi, Dixit, 1998). Механизм запуска апоптоза через эти рецепторы в целом схож, отличаются только детали. Например, TNFR ассоциирует не напрямую с FADD, а через посредника — TRADD. Если апоптоз не связан с рецепторами смерти, то пути инициации могут начинаться по-разному, но все в итоге приводят к митохондриальному запуску программы гибели.
Митохондрия приводит клетку к апоптозу по крайней мере тремя способами, возможно — взаимосвязанными. Это: нарушения в электронно-транспортной цепи и прекращение синтеза АТФ; изменение окислительно-восстановительного потенциала клетки; выход в цитоплазму молекул, активирующих каспазы (Green, Reed, 1998). Через нарушение энергетического метаболизма (прекращение синтеза АТФ) действует такой индуктор, как церамид (Garcia-Ruiz et al., 1997). Нарушения в окислительно-восстановительном потенциале клетки связаны с чрезмерной продукцией 0{ при некоторых видах ПКС (Bredesen, 1995). Однако, возможно, эти два события являются лишь поздними следствиями развивающегося апоптоза. А истинная индукция ПКС с участием митохондрий связана с высвобождением из межмембранного пространства митохондрий цитохрома С. Цитохром С взаимодействует с цитоплазматическим фактором Apaf-1 (Apoptosis protease activating factor-1), играющем роль арматуры, на которой происходит аутокаталитическии процессинг прокаспазы-9 (Li et al., 1997). Весь процесс требует присутствия АТФ. Предполагается, что в результате АТФ-зависимого конформационного изменения Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром С. Связав цитохром С, Apaf-І претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ для прокаспазы-9. Подобная конструкция, содержащая АТФ, цитохром С, Apaf-1 и прокаспазу-9 (не менее 8 молекул) называется апоптосомой. Затем активная каспаза-9 запускает каскад каспаз, ведущий к гибели клетки. Несмотря на огромное разнообразие сигналов ПКС и то, что апоптоз начинается по-разному в разных случаях, вполне возможно, что механизм эффекторной фазы апоптоза (то есть, собственно гибели) в клетке один или их очень немного (Ellis et al., 1991а), и главную роль в этом/этих механизмах играют одни и те же (или близкородственные) виды молекул-эффекторов. Это прежде всего каспазы.
Многополюсные митозы и анеуплоидные клетки
Многополюсные митозы возникают спонтанно или в результате различных физических и химических воздействий (Кегуег, 1984; Hotchkiss, Sisken, 1980). Как правило, источником многополюсного митоза служат либо полиплоидные клетки, в которых число центриолей увеличено, либо клетки, в которых в результате разобщения хромосомного и центросомного циклов сформировались дополнительные центросомы, организующие полюса веретена. Так, например, К-митотическая задержка приводит к блокированию или удлинению хромосомного цикла. Центриолярный цикл при этом продолжается. Проявлением этого является разъединение центриолей и отхождение их друг от друга на значительное расстояние (Онищенко, 1993). Такие одиночные центриоли могут формировать самостоятельные полюса веретена деления. Кроме того, из-за нарушения фибриллярного материала с центриолями возможно появление и бесцентриолярных полюсов (Ходяков и др., 1986). Показано, что в трехполюсном митозе бесцентриолярными могут быть один или два полюса (Кегуег et al., 1984; Ходяков и др., 1986). Механизм возникновения многополюсных митозов с бесцентриолярными полюсами остается неясным. В диплоидных клетках многополюсные, и в частности — трехполюсные, митозы могут завершаться эуплоидным или анеуплоидным распределением хромосом по дочерним клеткам. Эуплоидное распределение возможно в том случае, когда форма метафазной хромосомной пластинки является V-образной. Тогда в случае образования трех дочерних ядер в них может содержаться In, 2n, In (Ходяков и др., 1986). При Y-образной форме метафазной пластинки всегда идет образование анеуплоидных дочерних ядер.
Распространенность в природе Многополюсные митозы (а, следовательно, и появление анеуплоидных клеток) описаны в кишечном эпителии аскариды (Анисимов и др., 1974), в печени мышей (Бродский, Урываева, 1981), в эндометрии крысы (Зыбина, Грищенко, 1970). Однако у человека, в нормальных тканях и в физиологических условиях, патологические митозы встречаются очень редко, поэтому и анеуплоидных клеток в норме в организме человека нет. В случае же их возникновения такие клетки с аномальным хромосомным набором быстро элиминируются. Однако различные патологические процессы, такие как реакция воспаления, вирусная инфекция, опухолевый рост способны значительно повысить вероятность повреждения митотического аппарата и образование аномальных по хромосомному составу клеток (Алов, 1972; Онищенко, 1993). Кроме того, некоторое количество анеуплоидных клеток может возникать при гаметогенезе, причем вероятность этого события увеличивается с возрастом. Отсутствие в гамете человека одной из 23 хромосом или же избыток одной или нескольких хромосом, как правило, не сказывается на жизнеспособности самой гаметы, но приводит к образованию зиготы, которая не может развиться в полноценный организм и погибает (Qumsiyeh et al., 2000). Но в некоторых случаях анеуплоидный зародыш оказывается жизнеспособным и тогда развивается организм с различными аномалиями. Например, трисомия по 21 хромосоме вызывает болезнь Дауна, моносомия по Х-хромосоме - синдром Шерешевского-Тернера, избыток Х-хромосом — синдром Клейнфельтера, трисомии по 13, 14, 15 хромосомам приводят к развитию "волчьей пасти", "заячьей губы", полидактилии. Еще один часто встречаемый вариант, при котором можно встретить анеуплоидные клетки, это опухоли. В опухолях, которые всегда отличаются ослабленным контролем за целостностью клеточного генома, аномальные митозы возникают значительно чаще, чем в нормальной ткани. Однако остается неясным, является ли патология митоза результатом озлакачествления клеток или патологические митозы являются одной из причин этого явления.
Во всяком случае известно, что образующиеся в результате полиплоидные клетки, анеуплоидные клетки, клетки с хромосомными аномалиями не устраняются и, в свою очередь, демонстрируют патологии в последующих митозах, так что количество аномалий увеличивается прогрессивно (Алов, 1972). Анеуплоидия и апоптоз У анеуплоидных организмов уровень апоптоза в отдельных органах в несколько раз выше, чем у диплоидных. Так, моносомия по Х-хромосоме у человека приводит к 70%-ной гибели ооцитов, с чем и связывают бесплодие у женщин с синдромом Тернера (Modi et al., 2003), а трисомия по 8 хромосоме повышает уровень апоптоза в стволовых клетках крови (Sloand et al., 2002). Даже в опухолях, где апоптоз в поврежденных клетках запускается далеко не всегда (Kerr et al., 1994; Reed, 1999), все же отмечено, что если эта опухоль является анеуплоидной, то это сопровождается повышенным уровнем апоптоза (Lipponen, 1999; Abdel-Moneim et al., 2000). С другой стороны известны также и случаи, когда анеуплоидная опухоль оказывается более устойчива к противоопухолевым агентам, вызывающим апоптоз, чем подобные же диплоидные опухоли (Bobkova et al., 2000). Вообще, есть гипотеза, что повышение уровня анеуплоидии (путем увеличения числа центросом и появления многополюсных митозов) в опухоли служит своего рода способом повысить жизнеспособность опухоли (Онищенко, 1993; Brinkley, 2001) в ответ на противоопухолевую терапию. Однако в анеуплоидной опухоли неизбежно повышается уровень спонтанного апоптоза и чтобы поддержать ее жизнеспособность и снизить уровень апоптоза в клетках затем должны восстановиться биполярные митозы (Brinkley, 2001) Таким образом, к настоящему времени известно, что хромосомный состав играет важную роль в жизнедеятельности клеток. Отсутствие одной или нескольких хромосом в диплоидном наборе или избыток хромосом, как правило, приводит со временем к клеточной смерти. Однако, поскольку апоптоз является генетически обусловленной программой, возникает вопрос о том, может ли отсутствие некоторых генов не позволить клетке запускать данную программу? Ответ на этот вопрос может иметь большое значение в терапии опухолей, однако исследования в этом направлении не проводились.
В связи с этим в настоящей работе были поставлены следующие задачи: 1. Отработать метод индукции апоптоза с помощью такого агента, действие которого напрямую связано с активацией генов апоптоза в клетке. 2. Индуцировать в клеточной популяции патологические митозы, вызывающие появление клеток с аномальным хромосомным составом. 3. Исследовать возможность индукции апоптоза в полученных анеуплоидных клетках выбранным агентом. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование клеток В работе использовались пересеваемые культуры клеток СПЭВ (эпителий почки эмбриона свиньи) и FAF28 (фибробласты яичника китайского хомячка). Клетки выращивали на среде 199 с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина в концентрации 80 мкг/мл. Для проведения экспериментов клетки сажали на покровные стекла в пластиковые чашки Петри и культивировали при 37С в атмосфере, насыщенной СО2. Начальная концентрация клеток в суспензии составляла приблизительно 150 тыс/мл. Для экспериментальной работы использовали клетки в логарифмической фазе роста (через 2 суток после посадки). Индукция апоптоза В качестве индуктора апоптоза использовался водный раствор циклогексимида (Sigma, С 7698) в конечной концентрации 10 М. Выявление апоптотических клеток На разных этапах работы применялись различные методы выявления клеток, подвергшихся апоптозу: а) На препаратах, фиксированных для световой микроскопии и окрашенных гематоксилином и эозином, апоптотические клетки выявлялись по наличию ядерных изменений: конденсированный хроматин, формирующий "полулуния" в ядре, или полная фрагментация ядер на плотные, ярко окрашенные глыбки (Рис. 1). б) На нефиксированных препаратах апоптоз выявлялся с использованием фазово-контрастной оптики по характерному для апоптотической клетки блеббингу (пузырению) поверхности клетки: по всей поверхности появляются достаточно крупные выпячивания цитоплазмы, хорошо заметные на фазовом контрасте (Рис. 2). в) На нефиксированных препаратах также использовалась прижизненная окраска аннексином V, конъюгированным с флюоресцентным красителем Су3.18 (Sigma, А 4963) или с FITC (Sigma, А 9210).
Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ
Клетки в контроле (Рис. 8), не подвергавшиеся обработке ЦГИ, на ультраструктурном уровне имеют одно ядро с преимущественно диффузным хроматином и небольшим количеством конденсированного хроматина. Имеются одно-два ядрышка, крупные, с хорошо выраженными гранулярным и фибриллярным компонентами. Вакуолярная система представлена цистернами гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума, лизосомами, аппаратом Гольджи. Эндоплазматический ретикулум и лизосомы встречаются во всех зонах цитоплазмы. Аппарат Гольджи располагается несколькими группами вблизи ядра; как правило, цистерны в составе диктиосомы несколько расширены. В цитоплазме в большом количестве содержатся митохондрии округлой или вытянутой формы, не несущие морфологических нарушений: наружная митохондриальная мембрана не повреждена, матрикс просветлён и кристы хорошо различимы. В клеточном центре, располагающемся вблизи ядра и зоны аппарата Гольджи, находятся центриоли (как правило, пара), наблюдается схождение микротрубочек к перицентриолярному материалу. Цитоплазма богата цитоскелетными элементами — микротрубочками, актином, промежуточными филаментами. В клетках, обработанных ЦГИ (Рис. 9), имеется незначительное повышение конденсации ядерного хроматина. Из элементов вакуолярной системы заметные изменения претерпевает аппарат Гольджи — его цистерны сильно раздуты; лизосомы и эндоплазматический ретикулум структурно не изменены, однако можно отметить утрату цистернами шероховатого ретикулума части рибосом. Наряду с нормальными, неповрежденными митохондриями появляются митохондрии с уплотнённым матриксом, а также часто встречаются аномальные митохондрии: с повреждённой наружной мембраной или локальным расширением межмембранного. Элементы цитоскелета в цитоплазме изучаемых клеток образуют визуально менее густую сеть, чем в контроле, клеточный центр при этом видимых изменений не несет и имеет ту же структуру, что и в контроле. спэв Клетки СПЭВ на ультраструктурном уровне имеют одно ядро с диффузным хроматином и двумя-четырьмя крупными активными ядрышками с хорошо различимыми гранулярным и фибриллярным компонентами.
Вакуолярная система представлена цистернами гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума, лизосомами, аппаратом Гольджи (Рис. 10). Эндоплазматический ретикулум хорошо развит и содержит на своей поверхности большое количество рибосом. Аппарат Гольджи представлен одной-тремя группами, расположенными вблизи ядра и состоящими из стопок чуть расширенных цистерн. В цитоплазме имеется множество митохондрий, в основном нормальной морфологии, округлой или вытянутой формы, встречаются ветвящиеся. В клеточном центре, располагающемся вблизи ядра и аппарата Гольджи, находится пара центриолей, на которых имеются центры схождения микротрубочек. Цитоскелет в цитоплазме очень мощно развит, особенно хорошо заметны пучки актина и промежуточных филаментов, соседние клетки могут быть связаны десмосомами. После семичасовой обработки ЦГИ структура ядра и клеточного центра видимых изменений не претерпевают. Эндоплазматический ретикулум теряет значительное количество рибосом, а цистерны аппарата Гольджи заметно набухают (Рис. 11). Митохондрии по-прежнему содержатся в цитоплазме в большом количестве, однако они имеют более плотный матрикс и иногда встречаются митохондрии с локальным расширением межмембранного пространства. Кроме того, наряду с мелкими округлой формы митохондриями появляется большое количество сильно вытянутых, иногда ветвящихся, митохондрий. В цитоплазме все еще сохраняется очень мощно развитый цитоскелет, представленный микротрубочками, а также пучками актина и промежуточных филаментов. Ультраструктура апоптотических клеток Помимо обычных клеток на ультраструктурном уровне изучалась структура апоптотических клеток. Эти клетки по сравнению с неапоптотическими имеют меньшие размеры, более плотную цитоплазму и конденсированный хроматин. FAF28 В культуре FAF28 было обнаружено несколько вариантов апоптотических клеток: с большей или меньшей плотностью цитоплазмы, с разрушенной или не разрушенной ядерной оболочкой, с различимыми или неразличимыми органеллами. Опираясь на различия в состоянии органелл, мы выделяем три типа апоптотических клеток. Первый тип. Как правило, целые, хорошо различимые органеллы, встречаются в клетках с ещё не разрушенной ядерной оболочкой и менее плотной цитоплазмой (по сравнению с другими типами апоптотических клеток) (Рис. 12). В таких клетках помимо нефрагментированного ядра с сильно конденсированным хроматином можно наблюдать почти все органеллы вакуолярной системы: эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, лизосомы. Цистерны ЭПР часто расширены и не содержат на поверхности рибосом. Аппарат Гольджи встречается очень редко и во всех зарегистрированных случаях ясно видно, что он находится в процессе разборки на вакуоли. Митохондрии мелкие, округлой формы. Часто это митохондрии с нарушенной морфологией, например - с уплотненным матриксом, но много и морфологически нормальных. Цитоскелет представлен пучками актиновых микрофиламентов различной длины и толщины.
Надо отметить, что наблюдаемые пучки являются новообразованием в апоптотической клетке, так как в неапоптотических клетках FAF28 подобных упорядоченных пучков актина не наблюдается. Микротрубочек в уплотненной цитоплазме увидеть не удалось, центриоль была обнаружена лишь в одной из просмотренных клеток. Второй тип. В апоптотических клетках с частично поврежденной ядерной оболочкой (с разрывами или заметно расширенным перинуклеарным пространством) картина несколько иная (Рис. 13). В уплотнённой цитоплазме остается не так много чётко идентифицируемых структур — это митохондрии округлой формы и лизосомы. Среди митохондрий встречаются разные варианты: как морфологически нормальные, так и конденсированные либо, наоборот, набухшие. Но помимо митохондрий и лизосом, других идентифицируемых мембранных органелл не обнаруживается: ни аппарата Гольджи, ни эндоплазматического ретикулума. Однако в цитоплазме содержится много вакуолей с гомогенным содержимым. Из элементов цитоскелета в небольшом количестве присутствуют слабо выраженные пучки актиновых микрофиламентов. Микротрубочек и центриолей не найдено. Третий тип. Достаточно редко наблюдался такой тип апоптотических клеток, когда у ядер или их фрагментов ядерная оболочка полностью отсутствует. Интересно, что фрагменты ядерной оболочки находятся при этом в цитоплазме и имеют достаточно сохраненную структуру (в частности, ядерные поры выглядят неповрежденными) (Рис. 14). Но помимо фрагментов ядерной оболочки в цитоплазме таких апоптотических клеток практически нет чётко идентифицируемых структур — ни митохондрий, ни лизосом, ни эндоплазматического ретикулума, ни аппарата Гольджи. Только набор везикул неясного происхождения. Таким образом, в этом типе клеток наблюдается полная реорганизация всех мембранных структур. Результат — появление набора неидентифицируемых по происхождению везикул. Центриолей и элементов цитоскелета также не найдено. Помимо целых клеток, на ультраструктурном уровне в межклеточном пространстве обнаруживаются апоптотические тельца различного состава: хроматиновое тельце, тельце с элементами вакуолярной системы, тельце с пучком актиновых филаментов (Рис. 15а,б,в). Хроматиновые апоптотические тельца также четко идентифицируются в составе фагоцитозных вакуолей в нормальных, неапоптотических, клетках (Рис. 15г). Зафиксирован процесс фагоцитоза апоптотического тельца неапоптотической клеткой (Рис. 15д). Можно обратить внимание, что хроматиновые апоптотические тельца могут содержать или не содержать ядерную оболочку вокруг фрагментов хроматина (Рис. 15а,г,д). СПЭВ В культуре СПЭВ были обнаружены апоптотические клетки на очень ранней стадии апоптоза (Рис. 16). В таких клетках в ядре еще слабо развита конденсация и примембранное отложение хроматина, однако эти клетки уже можно отнести к разряду апоптотических, основываясь на уплотненной цитоплазме и наличию блеббинга поверхности (одна из достаточно ранних стадий апоптоза).
Морфологические изменения клеток при действии ЦГИ
В обеих культурах семичасовая обработка ЦГИ вызывает заметные изменения в структуре аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума, регистрируемые на ультраструктурном уровне. На клетках СПЭВ особенно хорошо видно, что цистерны эндоплазматического ретикулума теряют значительную часть рибосом. И в обеих культурах заметно сильное набухание цистерн аппарата Гольджи. Полагают, такая реакция данных органелл обусловлена нарушением их функций в связи с сильным ингибированием белкового синтеза, вызванного ЦГИ (Струве, Ченцов, 1977). Рибосомы, в которых не начата трансляция, не могут заякориться на мембране ретикулума, поэтому их количество на цистернах падает. Но в то же время, другая часть рибосом не может диссоциировать от эндоплазматического ретикулума, не закончив начавшийся синтез, поэтому некоторое количество рибосом на ретикулуме присутствует. Не следует также забывать, что к 7 ч присутствия ЦГИ белковый синтез уже частично восстанавливается (Филиппова и др., 1989), чему также должно соответствовать присутствие некоторого количества функционирующих рибосом. Подобные изменения в структуре гранулярного эндоплазматического ретикулума описаны в клетках поджелудочной железы и печени крыс при длительном введении ЦГИ (Harris et al., 1968). Набухание цистерн аппарата Гольджи, возможно, связано с накоплением в них ранее синтезированных белков, дальнейший транспорт которых оказывается нарушен из-за недостатка транспортных белков. Другое значительное изменение, обнаруженное в клетках, обработанных ЦГИ — это нарушения в структуре митохондрий. Морфологические изменения, такие как конденсированный матрикс или расширение межмембранного пространства, свидетельствуют о нарушении функции этих важнейших для клетки органелл. Хотя ЦГИ не влияет непосредственно на митохондриальную трансляцию, но значительная часть белков митохондрий (в том числе и факторы транскрипции и трансляции) имеет цитоплазматическое происхождение.
Прекращение их поступления из цитоплазмы может привести к снижению синтеза митохондриальных РНК и белка (Галкин и др., 1975). В итоге возникают структурные нарушения, а затем и нарушения в работе дыхательной цепи (Hwang et al., 1974). Однако следует отметить, что, несмотря на серьезные нарушения, отмеченные на ультраструктурном уровне, митохондрии к 7 ч действия ЦГИ сохраняют жизнеспособность. Это следует из светооптических прижизненных наблюдений за клетками СПЭВ: митохондрии в клетках, обработанных ЦГИ, окрашиваются родамином 123, что возможно только при сохранении разности потенциалов на внутренней митохондриальной мембране. Помимо демонстрации жизнеспособности митохондрий в культуре СПЭВ в условиях действия ЦГИ, окраска родамином 123 выявила также значительное увеличение длины митохондрий — в 2-3 раза по сравнению с контролем. Возможно только два способа увеличения размеров митохондрий — их рост или же слияние отдельных митохондрий. Но поскольку визуально общее число митохондрий в контрольных клетках и в ЦГИ-обработанных клетках сопоставимо, то можно предположить, что в данном случае речь идет именно о росте. В любой клетке (кроме некоторых высокоспециализированных) постоянно происходят процессы роста, деления, слияния митохондрий, которые важны для нормального функционирования этих органелл и клетки в целом (Bereiter-Hahn, Voth, 1994), и форма и размер митохондрий зависят от соотношения этих процессов (Shaw, Nunnari, 2002). Очевидно, что если деление митохондрий заблокировать, их длина будет возрастать. По-видимому, ЦГИ каким-то образом нарушает процесс деления митохондрий. Каким образом он это делает, пока остается неясным. Возможно, это связано с недостатком белков: известно, что для деления митохондриям требуется динамин-подобная ГТФаза Drpl (Smirnova et al., 1998, 2001) и белок-адаптер Fisl (Mozdy et al., 2000), которые имеют цитоплазматическое происхождение. Однако есть данные, что блокирование цитоплазматического белкового синтеза не отражается на делении митохондрий, зато образование мегамитохондрий отмечается в случае оксидативного crpecca(Karbowski et al., 1997). Нужно отметить, что в культуре СПЭВ после обработки ЦГИ наряду с клетками, имеющими длинные митохондрии, в небольших количествах присутствуют клетки с мелкими, фрагментированными митохондриями. Мы предполагаем, что это могут быть клетки на ранних стадиях индукции апоптоза (еще до появления явных признаков, таких как ядерные изменения или блеббинг клеточной поверхности). Многие исследователи показывают, что в процессе апоптоза митохондрии претерпевают фрагментацию и утрату мембранного потенциала с последующим выходом из межмембранного пространства в цитоплазму эффекторов апоптоза (Mancini et al., 1997; Bossy-Wetzelz et al., 2003; Skulachev et al., 2003).
Пока не известно, идет ли апоптотическая фрагментация митохондрий аналогично нормальному физиологическому делению митохондрий, или же здесь действуют другие молекулярные механизмы (Bossy-Wetzelz et al., 2003). Наши результаты косвенно свидетельствуют о том, что эти механизмы должны отличаться: если ЦГИ действительно подавляет механизм нормального деления митохондрий, то при совпадении механизмов не происходило бы деления митохондрий и в апоптотических клетках. Однако на ультраструктурном уровне мы видим, что апоптотическая клетка содержит мелкие округлые митохондрии. Возвращаясь к прижизненной окраске митохондрий родамином 123, надо заметить, что в апоптотических клетках (с блеббингом поверхности) митохондрии не окрашиваются, то есть они уже деэнергйзованы. Исходя из этого и из того, что клетки с мелкими, родамин-окрашенными митохондриями, еще не демонстрируют блеббинга поверхности, можно предположить, что фрагментация митохондрий предшествует их деэнергезации в процессе развития апоптоза. В культуре СПЭВ, окрашенной родамином 123, как в контроле, так и после обработки ЦГИ есть подразделение на две популяции клеток - с ярко окрашенными митохондриями и со слабо окрашенными митохондриями. Полагают, что различия в степени окраски митохондрий разных клеток связаны с различиями в уровне дыхания в клетках (Almeida, 1994). Слабо окрашиваемые родамином 123 клетки обладают повышенным уровнем дыхания и производства энергии. Это не хроническое состояние клеток и в разные моменты времени интенсивность дыхания (а значит, и окраски) одной и той же клетки может сильно различаться.
Похожие диссертации на Индукция апоптоза в анеуплоидных клетках
