Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Перенос генетического материала у прокариот 10
1.2 Агробактериальный перенос ДНК 12
1.2.1 Распознавание растительной клетки-реципиента 14
1 1.2.2 Трансформация и ядерный транспорт Т-ДНК 16
1.2.3. Биологическое значение агробактериальной трансформации 21
1.3. Горизонтальный перенос генов от прокариот в эукариотические клетки, возможно, имеет эволюционное значение 22
1.4. Эмбриональное развитие морских ежей 25
1.4.1. Бластуляция морских ежей 25
1.4.2. Процесс гаструляции 26
1.4.3. Появление и развитие мезенхимного паттерна 28
1.4.4. Клеточные взаимодействия, определяющие дифференцировку и развитие t 29
1.4.5. Молекулярная регуляция событий, происходящих на ранних эмбриональных стадиях 30
1.4.6. Использование универсального активатора транскрипции дрожжей геяа gal4 34
ГЛАВА 2. Материал и методика 36
2.1. Животные 36
2.2. Трансформация оплодотворенных яйцеклеток 36
2.2.1. Бактериальные штаммы иплазмиды 36
2.2.2. Выделение плазмиды 37
2.2.3. Трансформация плазмидой, содержащей ген универсального активатора транскрипции gal4 37
2.2.4. Агробактериальная трансформация эмбрионов 37
2.3. Измерение числа агробактерий в ходе совместного культивирования с эмбрионами морских ежей 39
2.4. Измерение рН морской воды в ходе совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей 40
2.5. Световая и трансмиссионная электронная микроскопия 41
2.6. ДНК- и РНК-анализ 41
2.6.1.Пцриотпцр 41
2.6.2. «TAIL» ПЦР 44
2.6.3. Клонирование и секвенирование 45
2.7. Выявление включения 5-бромо-2'-дезоксиуридина в эмбрионах морских ежей 46
2.7. Статистический анализ 47
ГЛАВА 3. Результаты 48
3.1. Жизнеспособность агробактерий в морской воде 48
3.2. Прикрепление агробактерий к клеткам эмбрионов морских ежей 50
3.3.1. Наличие и экспрессия генов rol в трансформированных эмбрионах ... 52
3.3.2. Доказательство встройки Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей 53
3.4. Появление и возможные причины формирования опухолеподобных
структур (ОПС) у эмбрионов морских ежей 55
3.4.1. Процент ОПС при трансформации геном gal4 и растительными онкогенами rolB и rolC 55
3.4.2. Уменьшение числа ОПС при использовании конструкций, несущих мутантные гены vir 59
3.4.3. Изменение рН морской воды в ходе совместного культивирования агробактерий и эмбрионов морских ежей 60
3.5. Строение эмбрионов с опухолеподобными структурами 63
3.5.1. Внешний вид эмбрионов с опухолеподобными структурами 63
3.5.2. Строение и ультраструктура эмбрионов с ОПС 65
3.5.2.1 Строение и структура эмбрионов, трансформированных плазмидой рМА563 66
3.5.2.2 Строение и структура эмбрионов с ОПС после агробактериальной трансформации 69
4 3.5.2.3 Включение 5-бромо-2'-дезоксиуридина в эмбрионах с ОПС после агробактериальной трансформации 73
ГЛАВА 4. Обсуждение 74
4.1. Жизнеспособность и способность к трансформации Agrobacterium tumefaciens в морской воде 74
4.2. Встройка Т-ДНК агробактерий и экспрессия генов rolB и rolC при совместном культивировании с эмбрионами морских ежей 76
4.3. Появление опухолеподобных структур у эмбрионов обусловлено переносом Т-ДНК агробактерий 78
4.4. Возможное влияние изменения рН морской воды при совместном культивировании A. tumefaciens и эмбрионов морских ежей 79
4.5. Опухолеподобные структуры эмбрионов морских ежей: строение и возможные причины возникновения в результате изменения нормального хода эмбриогенеза 81
4.5.1. Внешний вид и строение опухолеподобных структур 81
Выводы 86
Список литературы
- Распознавание растительной клетки-реципиента
- Трансформация плазмидой, содержащей ген универсального активатора транскрипции gal4
- Наличие и экспрессия генов rol в трансформированных эмбрионах
- Встройка Т-ДНК агробактерий и экспрессия генов rolB и rolC при совместном культивировании с эмбрионами морских ежей
Введение к работе
Актуальность
На сегодняшний день агробактериальная трансформация растений является самым изученным примером горизонтального переноса генов от бактерий к эукариотам in vivo. В ходе эволюции бактерии рода Agrobacterium (в соответствии с новой классификацией большинство видов реклассифицировано в род Rhizobium, однако большинство ученых, изучающих агробактериальную трансформацию растительных клеток, используют старое название) приспособились к переходу от сапротрофного типа питания к своеобразному паразитическому типу путем переноса в растительные клетки генов синтеза, опинов (продуктов реакции кетосахаров и аминокислот) и генов, вызывающих неопластическую трансформацию клеток растений. В результате такой трансформации у растений появляются быстро делящиеся клетки, синтезирующие опины, которые служат для агробактерий источником углерода и азота. Агробактериальная трансформация нашла широкое применение в генной инженерии растений и на сегодняшний день относится к наиболее распространенным методам генетической трансформации растений. ,
Наличие у ряда представителей некоторых групп морских беспозвоночных (кольчатые черви, моллюски, ракообразные, иглокожие) ферментов опинового синтеза позволило сделать предположение о возможном переносе генов опинсинтетаз от агробактерий к морским беспозвоночным. Долгое время вопрос о возможной агробактериальной трансформации животных клеток оставался открытым, пока в 2001 году не было показано, на культуре клеток человека HeLa, что агробактерий могут трансформировать клетки млекопитающих (Kunik et al., 2001). Несколькими годами ранее было показано, что агробактерий могут трансформировать клетки грибов (Bundock, Hooykaas, 1996; Piers et al., 1996). Необходимым условием для формирования первичных контактов при взаимодействии между агробактериями и клетками-хозяевами является наличие белка внеклеточного матрикса животных —
7 витронектина (Wagner, Matthisse, 1992) или витронектин-подобного белка растений (Zhu etaL, 1994).
На сегодняшний день известно, активация генов под контролем растительных промоторов (nos и 35S) в животных клетках возможна благодаря распознаванию их регуляторными элементами клетки-реципиента (Ballas et al., 1989; Zahm et al., 1989). Эти промоторы имеют либо вирусную природу (35S, вирус мозаики цветной капусты), либо агробактериальную (nos, бактерии рода Agrobacterium). Однако информации о функционировании регуляторных генов растений в клетках животных нет. Это особенно касается функционирования растительных онкогенов rol в связи с возможностью агробактериальной трансформации клеток животных.
В наших экспериментах мы показали, что в условиях морской среды in vitro может происходить агробактериальная трансформация при совместном культивировании эмбрионов морских ежей с агробактериями Agrobacterium tumefaciens {Rhizobium radiobacter), которые несут растительные онкогены rolB' и rolC. У части эмбрионов нарушается ход эмбриогенеза с образованием опухолеподобных структур (ОПС). Такие структуры формируются на поверхности эмбрионов и получили свое название из-за внешнего вида. Подобное нарушение эмбриогенеза было описано ранее после трансформации генетическими конструкциями, несущими ген универсального активатора транскрипции gal4 (Bulgakov et al., 2002). В наших исследованиях мы изучали строение эмбрионов с опухолеподобными структурами после трансформации плазмидной ДНК, несущей ген gal4, и после агробактериальной трансформации генами rolB и rolC. Это позволило выявить различия в строении эмбрионов с опухолеподобными структурами и в строении самих ОПС, а на основании этого установить, что возникновение опухолеподобных структур является следствием действия разных механизмов.
Цели и задачи исследования
При выполнении работы мы преследовали две цели. Во-первых, изучить явление агробактериального переноса Т-ДНК (transferred DNA, переносимая
8 одноцепочечная ДНК) в геномную ДНК эмбрионов морских ежей, доказать встройку чужеродной ДНК и активность перенесенных генов rolB и rolC. Во-вторых, изучить влияние растительных онкогенов rolB и rolC на ход эмбриогенеза морских ежей.
Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Подобрать и оптимизировать условия агробактериальной
трансформации эмбрионов морских ежей в процессе их совместного
культивирования со штаммами A. tumefaciens GV3101, которые несут бинарный
вектор: pMP90RK (vzr-хелперная плазмида) и pPCV002, содержащую в составе
Т-ДНК один из генов rol (rolB или rolC). Определить возможные механизмы
трансформации.
2. Оценить эффективность агробактериальной трансформации в
сравнении с ПЭГ^опосредованной трансформацией плазмидными
конструкциями, несущими чужеродные гены.
3. Доказать встройку Т-ДНК в геномную ДНК эмбрионов морских ежей,
используя методы ПЦР и TAIL-ПЦР. Определить активность генов rolB и rolC
методом обратно-транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ ПЦР)
после совместного культивирования эмбрионов с агробактериями.
4. Провести сравнительный морфологический анализ эмбрионов с
опухолеподобными структурами, возникающими вследствие трансформации
генетическими конструкциями, несущими ген gal4 и гены rolB и rolC.
Определить сходство и различие в строении эмбрионов и опухолеподобных
структур после трансформации.
Научная новизна и теоретическая значимость
В нашей работе впервые продемонстрирована возможность агробактериальной трансформации в условиях морской среды на примере эмбрионов морских ежей. Это является подтверждением гипотезы о переносе генов опинового синтеза от агробактерий к представителям различных групп морских беспозвоночных. Более того, нами зафиксирована встройка
9 агробактериальной Т-ДНК в геномную ДНК морских ежей. Наряду с известным фактом трансформации клеток млекопитающих наши данные указывают на целенаправленный транспорт Т-ДНК в ядра клеток животных.
Апробация работы и публикации
Результаты работы были представлены на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003), на I и IV Всероссийских симпозиумах по клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003, 2006), на международном научном семинаре «Проблемы репродукции и раннего онтогенеза морских гидробионтов» (Мурманск, 2004), на Международной научной конференции "Инновации в науке и образовании -2006" (Калининград, 2006), на X Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (МЭС, ТИБОХ, 2006) и на годичной научной конференции Института биологии моря'имени А. В. Жирмунского ДВО РАН (Владивосток, 2006).
Материалы диссертации изложены в 3 статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и содержит 2 таблицы. Список литературы содержит 193 наименования.
Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов Президиума ДВО РАН (гранты 03-3-Ж-06-096,04-ЗА-06-047, 06-И-СО-06-025 и 06-Ш-В-06-214) и при финансовой поддержке НОЦ ДВГУ за счет средств фонда US CRDF (проектУЪ-ООЗ) и Министерства Образования РФ (АОЗ-2.12-524).
Распознавание растительной клетки-реципиента
При повреждении корневой системы или участка стебля ниже уровня почвы клетки растения выделяют сок, имеющий кислый рН (5,0-5,8) и содержащий полифенольные соединения. Это служит сигналом для запуска механизма агробактериальной трансформации. После образования контактов с растительной клеткой агробактерии способны распознавать сигнальные молекулы полифенолов, таких как лигнин и предшественники флавоноидов. Полифенолы активируют экспрессию vzr-региона. Наиболее изученным и эффективным активатором на сегодняшний день из соединений данного класса является ацетосирингон (Stachel et al., 1985). Более того, полифенольные сигналы являются специфическими для разных штаммов агробактерии (Citovsky et al., 1992). Аналогичная сигнализация инициирует образование симбиотического комплекса у- родственного агробактериям рода Rhizobium (Peters, Verma, 1990).
Существует ряд дополнительных агентов, которые в чистом виде или в совместном действии с полифенолами активируют экспрессию wr-региона. Так, было показано, что некоторые моносахара, такие как глюкоза, галактоза и некоторые неметаболические сахара, могут значительно увеличивать экспрессию vir при низких концентрациях или полном отсутствии ацетосирингона (Citovsky et al., 1992). В присутствии полифенольных соединений невысокие концентрации опинов увеличивают уровень экспрессии генов vir.
Вещества, стимулирующие экспрессию локуса vir, не участвуют в метаболизме бактерий и не обеспечивают их рост и размножение. В противоположность этому, условия, обеспечивающие рост агробактерии, не способствуют активации генов vir (Veluthambi et al., 1989). Таким образом, стимуляция локуса vir и, в конечном итоге, генетическая трансформация растительной клетки приводит к переходу от сапротрофного типа питания к паразитическому.
Точный механизм процесса активации локуса vir давно известен и неоднократно упоминался в ряде обзорных публикаций по данной теме (Citovsky et aL, 1992; Sheng, Cytovsky, 1996; Citovsky et aL, 2007). Полифенольные соединения распознаются рецепторным белком VirA, локализованным на поверхности клеточной мембраны бактерий. Это приводит к взаимодействию белков VirA и VirG. В свою очередь VirG запускает транскрипцию остальных генов vir. Белок VirA функционирует как протеинкиназа и фосфотрансфераза (Winans et aL, 1994).
После взаимодействия с полифенолами происходит фосфорилирование гистидинового остатка VirA в положении 474, а затем фосфатная группа переносится на остаток аспарагина VirG в положении 52 и, возможно, в положении 8. Интересно, что VirG имеет гомологию по аминокислотной последовательности с белками-переносчиками сигнала (OmpR и NtrC) в Тра-системах Е. coli, но, в отличие от них, его фосфорилирование весьма стабильное. Это обеспечивает постоянный высокий уровень экспрессии остальных генов vir. Фосфорилированный VirG выполняет функцию активатора транскрипции, связываясь с vzr-боксом в промоторной части оперона. Хотя нефосфорилированная форма также может связываться с промоторной областью, считается, что фосфорилирование белка увеличивает сродство к ДНК, а, соответственно, и уровень экспрессии, как было показано на белках OmpR и NtrC (Sheng, Citovsky, 1996).
Активация локуса vir является определяющей для нормального протекания процессов сборки Т-комплекса - нуклеопротеиновой частицы, ее последующего транспорта в ядро растительной клетки и встройки в геномную ДНК растения. Центральная часть Т-комплекса - одноцепочечная Т-ДНК, которая кодируется Т-регионом агробактериальных плазмид. Формирование Т-ДНК идет в направлении от 51 к 3 концу при участии двух белков VirDl и VirD2 (Citovsky et aL, 1996), которые в комплексе работают как сайт-специфические эндонуклеазы. Сайты рестрикции для этих белков определяются правой и левой границами Т-региона (Wang et aL, 1987).
Различные варианты закодированной информации внутри Т-региона никак не. сказываются на эффективности распознавания мест рестрикции и сборке Т-комплекса. После рестрикции одна молекула VirD2 ковалентно связывается с 5 концом правой границы Т-ДНК, а другая с плазмидной частью левой границы. Вслед за этим Т-ДЬЖ удаляется из плазмиды, и происходит восстановление недостающей цепи плазмиды (Pansegrau et aL, 1993).
Межклеточный транспорт связанной с VirD2 Т-ДНК обеспечивает virB оперон. Это локус, который кодирует 11 мембран-ассоциированных белков, включая основной компонент Т-пилей - VirB2 (Lai, Kado, 2000). Транспорт, обеспечивающий передачу Т-ДНК в составе Т-комплекса, имеет сходство с бактериальной конъюгацией, как упоминалось выше, и является модификацией данного процесса. В пользу такой точки зрения говорит то, что все белки Vir гомологичны белкам Тра-систем Е. coli (Jones et aL, 1994) и В. pertussis (Kado, 1994).
Благодаря мембран-ассоциированному комплексу и формированию контактов между агробактерией и растительной клеткой возможен АТФ-зависимый транспорт Т-ДНК. VirB2, также как и ChvA, ChvB, PscA и Att, взаимодействует с мембранными белками растительной клетки. Но, в данном случае, характер и роль таких контактов отличаются от вышеописанных. На примере арабидопсиса Arabidopsis thaliana было показано, что в мембране растительной клетки локализованы белки BTI, один из которых (ВТП) взаимодействует с главным компонентом Т-пилей агробактерий — VirB2 (Hwang, Gelvin, 2004), формируя прочные контакты. В результате взаимодействия происходит сборка канала для транспорта Т-ДНК (Citovsky et aL, 2007).
Трансформация плазмидой, содержащей ген универсального активатора транскрипции gal4
Выделение проводили методом щелочного лизиса из- свежей суспензионной культуры бактерий Е. coli штаммов TG2(pPCV002-ro/C), TG2(pPCV002-ro/), TG2(pPCV002), TG2(pMA563) после культивирования в среде LB (NaCI - 10 г/л бидистиллированной воды; пептон - 10 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л, рН 7,5) течении ночи при 37С (Maniatis et al., 1982). Нативность плазмидной ДНК проверяли электрофорезом в 0,8 % агарозном геле (Pharmacia, Швеция) віх ТВЕ буфере (рН 8;0) при напряжении 5V/CM.
Трансформацию эмбрионов морских ежей конструкциями, несущими ген универсального активатора транскрипции gal4 (Рис. 1), проводили по методике с использованием ПЭГ (4000 Да, Loba Feinchemie, Австрия), описанной ранее (Bulgakov et al., 2002; Одинцова и др., 2003). Трансформацию начинали спустя 45 минут после оплодотворения. Используемое количество плазмидной ДНК варьировало от 0,01 до 1 мкг. В опытах делали два контроля: 1) без добавления ПЭГ и плазмиды; 2) с добавлением ПЭГ. Развитие контрольных и трансформированных эмбрионов шло в климатической камере при 18С. Наблюдение за эмбрионами вели в течение 3 суток.
Для агробактериальной трансформации эмбрионов бактериальную культуру - Agrobacterium tumefaciens GV3101(pMP90RK) с плазмидами, pPCV002-ro/C, pPCV002-ro/ и pPCV002 (Рис.2) - выращивали на агаризованной среде LB (NaCI - 10 г/л; пептон - 10 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л, рН 7,5; агар - 12 г/л). С чашек Петри была взята суточная культура и помещена в стерильную морскую воду (105"6 кл/мл) для дальнейшей обработки эмбрионов и первичных клеточных культур морских ежей.
Через 20 минут после оплодотворения 15-20 мл суспензии яйцеклеток помещали в центрифужную пробирку. Центрифугировали при 600 об/мин около 1 мин на центрифуге К-23 (Heinz Janetzki K.-G. Maschinebau, Engelsdorf, Германия). Супернатант сливали, к осадку добавляли 4 мл стерильной морской воды, пипетировали и отбирали по 0,5 мл в пробирки. Эксперимент проводили в двух направлениях.
1) Трансформацию плазмидной ДНК проводили по методике, описанной ранее (Bulgakov etal, 2002). К суспензии оплодотворенных яйцеклеток (200-300 эмбрионов/мл) добавляли плазмиду по 15 мкл (1300 мкг), инкубировали в течение 1 мин, приливали по каплям 0,5 мл 15% ПЭГ (м. м. 4000 Да) до конечной концентрации 7,5% и помещали в климатическую камеру на 20 мин. Для удаления ПЭГ к суспензии добавляли по каплям 2-3 мл морской воды, перемешивали и доводили объем до 10 мл морской водой. После-перемешивания центрифугировали при 800 об/мин. Супернатант сливали и добавляли 1 мл морской воды, пипетировали. Для дальнейшего развития.-эмбрионы помещали в чашки Петри (40 мм) из расчета 0,5 мл с добавлением 1,5 мл морской воды (в двух параллелях).
2) Агробактериальная трансформация. Суспензию эмбрионов (500 мкл) инкубировали с однодневной культурой агробактерий в морской воде (концентрация бактерий 104-106 кл/мл). Через 13-14 часов добавляли антибиотик цефатоксим до конечной концентрации 250 мг/л (Sigma, США). Используемая концентрация антибиотика не оказывает видимого эффекта на развитие эмбрионов. Помимо этого для изучения состояния агробактерий в совместной культуре в ряде экспериментов цефатоксим не добавляли. Для того, чтобы исключить влияние агробактерий на развитие эмбрионов и оценить эффекты отдельных онкогенов, проводили трансформацию плазмидными ДНК, несущими гены rol. Развитие контрольных и трансформированных эмбрионов шло в климатической камере при 18С. Наблюдение за эмбрионами вели в течение 3 суток. son ЇЯГ-. oti Рис. 1. Схематическое изображение плазмиды рМА563, несущей ген gal4. nos prom — нопалинсинтазный промотор, nos term - нопалинсинтазный терминатор,. Схематическое изображение плазмид pPCV002, несущих гены rol. А - плазмида без генов rol, Б - вектор с геном rolB, В - вектор с геном rolC. BR — правый бордер, BL — левый бордер, pNos - нопалинсинтазный промотор, 35S — промотор вируса мозаики цветной капусты, NosTerm - нопалинсинтазный терминатор, NPTII — ген неомицинфисфотрансферазы, pAOcs — сайт полиаденилирования, ori - точка инициации репликации.
В экспериментах по длительному культивированию агробактерий в среде LB и в морской воде с живыми эмбрионами морских ежей (300-400 эмбрионов/мл) и зафиксированными 96% этиловым спиртом (на стадии плутеуса) использовали штамм A. tumefaciens GV3101 с плазмидой pPCV002-rolC с начальной концентрацией 1-5 105 кл/мл. Перед опытом фиксированных эмбрионов отмывали 5 раз стерильной морской водой. Просчет числа агробактерий проводили при помощи высева на агаризованную среду LB с добавлением селективного антибиотика канамицина до конечной концентрации 50 мг/л (АКО «Синтез», Россия). Культивирование эмбрионов морских ежей с агробактериями проводили при постоянном помешивании (60-80 об/мин) при 18-20С. Параллельно с этим проводили фотосъемку совместной культуры эмбрионов морских ежей и агробактерий в течение 3 суток без добавления антибиотиков.
В эксперименте использовался штамм агробактерий GV3101(pMP90RK) с плазмидой pPCV002-ro/C. К оплодотворенным яйцеклеткам добавляли суспензию агробактерий на морской воде с начальной концентрацией 1-5 105 кл/мл. Культивировали при 18-20С в чашках Петри (40 мм) в конечном объеме 3 мл. Для измерения рН культуру переносили в 1,5 мл пробирки типа Эппендорф и центрифугировали 1500 об/мин 3 минуты (Minispin, Eppendorf, Германия). Для полного удаления агробактерий супернатант пропускали через нестерильный нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм (Millipore, США). Измерения значения рН проводили при помощи рН-метра OR-211/1 с комбинированным электродом (Radelkis, Венгрия). В эксперименте ставили три параллели: 1) эмбрионы без добавления агробактерий; 2) эмбрионы с добавлением агробактерий; 3) эмбрионы с добавлением агробактерий и с добавлением цефатоксима через 12-13 часов совместного культивирования. Отдельно проводили измерение рН морской воды, которую брали для культивирования.
Наличие и экспрессия генов rol в трансформированных эмбрионах
Для доказательства встройки Т-ДНК мы использовали метод TAIL-ПНР. Этот метод позволяет амплифицировать участок ДНК, где произошла сшивка чужеродной и геномной ДНК, с использованием специфического и вырожденного (рэндом) праймеров. Для доказательства встройки мы выбрали участок Т-ДНК, прилегающий к правому бордеру (Рис. 7, А).
После трех амплификации (схема изложена в разделе «Материал и методика» и на Рис. 7, А) ПЦР-продукт был клонирован и секвенирован. Точная масса ампликона составила 161 п.н., из которых 34 п.н. приходились на фрагмент, прилегающего к правому бордеру участка Т-ДНК, 2 п.н. - на остаток бордера и 125 п.н. - предположительно, на последовательность ДНК морского ежа (Рис. 7, А, Б). Анализ фрагмента величиной 125 п.н. не показал гомологии с последовательностью плазмиды pPCV002-ro/, поэтому мы предполагаем, что данная последовательность является последовательностью ДНК морского ежа. К сожалению, гомологии на данный участок среди известных последовательностей ДНК морского ежа S. purpuratus (GenBank) не было обнаружено. Это дает основание предположить, что встройка Т-ДНК произошла в видоспецифическую неконсервативную последовательность.
Клонирование последовательности, содержащей сшивку Т-ДНК A. tumefaciens и геномной ДНК S. intermedius. А - схема проведения TAIL-ПЦР. На схеме представлены три последовательные амплификации. Часть Т-ДНК, прилегающая к правому бордеру (черный сегмент), отображена белым цветом, геномная ДНК S. intermedius представлена серым сегментом. Б - выравнивание нуклеотидной последовательности участка плазмиды pPCV002-ro/C, несущего прилегающие к правому бордеру области, и клонированной нуклеотидной последовательности в месте соединения Т-ДНК с геномной ДНК S. intermedius.
В ходе совместного культивирования, агробактерий A. tumefaciens, несущих растительные онкогены rolB и rolC, у части эмбрионов наблюдается формирование опухолеподобных структур - такие структуры представлены-неоформленными скоплениями клеток на поверхности эмбрионов и получили название вследствие их внешнего вида. Ранее подобные структуры были описаны у эмбрионов морских-ежей при трансформации плазмидами рМА563, несущими ген универсального активатора транскрипции gal4 (Bulgakov et al., 2002; Одинцова и др., 2003). В связи с этим, мы, наряду с агробактериальной трансформацией, проводили трансформацию плазмидой, несущей ген gal4, для сравнения количества эмбрионов с ОПС, а также для сравнительного анализа морфологии опухолеподобных структур. Кроме того, для полного снятия эффекта присутствия агробактерий мы проводили трансформацию векторами, содержащими гены rolB и rolC.
На рисунке 8 представлены данные по процентному содержанию эмбрионов с ОПС при трансформации плазмидами рМА563, несущими ген gal4, плазмидами pPCV002-ro/# и pPGV002-ro/C. В качестве дополнительных контролей мы проводили обработку оплодотворенных яйцеклеток ПЭГ 4000 Да без добавления плазмидной ДНК и трансформацию вектором pPCV002, который не содержит генов rol.
В контрольной культуре эмбрионов наблюдали небольшой процент (в среднем 0,82±0,15%) эмбрионов с ОПС, по-видимому, это связано с нарушением хода эмбриогенеза у части эмбрионов. При обработке полиэтиленгликолем 4000 Да и плазмидой pPGV002 процент ОПС несколько возрастает (1,65±0,15%). Незначительное увеличение процента ОПС можно объяснить токсическим эффектом детергента. Увеличение количества ОПС при трансформации pPCV002 (2±0,38%), вероятнее всего, связано со встройкой чужеродной ДНК в геномную ДНК морских ежей, что может приводить к сбою программы развития вследствие инактивации генов или их неконтролируемой активности.
Количество эмбрионов с ОПС при трансформации геном gal4 в процентном соотношении составляет 3,6±0,5%. В этом случае опухолеподобные структуры наблюдали на 3 сутки после оплодотворения. Эффект растительных онкогенов rolB и rolC проявляется уже к концу первых суток, содержание эмбрионов с ОПС при этом составляет 4,5±0,75% для гена rolC и 3,8±0,6% для rolB.
Результаты агробактериальной трансформации, которую проводили путем совместного культивирования A. tumefaciens с эмбрионами морских ежей трех видов, представлены на рисунке 9. Максимальное количество эмбрионов с ОПС наблюдали через 20-24 часа у Scaphechinus mirabilis и через 24-28 часов у S. nudus и S. intermedius. После этого количество эмбрионов с такими аномалиями развития сокращалось, но в культуре появлялось большое количество одиночных клеток. По-видимому, спустя какое-то время происходил распад эмбрионов с ОПС на клетки. Подводя итог, можно сказать, что при совместном культивировании со штаммом агробактерий GV3101(pMP90RK), несущих плазмиду pPCV002, количество эмбрионов с ОПС варьировало в пределах 1-3%. Процентное содержание в культуре эмбрионов с ОПС составило 4-8% для pPCV002-ro/C и 4,5-14% для pPCV002-ro/.
Встройка Т-ДНК агробактерий и экспрессия генов rolB и rolC при совместном культивировании с эмбрионами морских ежей
На сегодняшний день в научной литературе описано три вида нарушений хода эмбриогенеза морских ежей, для которых характерно образование на поверхности эмбрионов каких-либо структур: экзогаструляция (Gustafson, Wolpert, 1963), формирование опухолеподобных структур при трансформации геном универсального активатора транскрипции gal4 (Bulgakov et al., 2002) и пригагробактериальной трансформации растительными онкогенами ro/Z? и го/С (Bulgakov et al, 2006). Все эти изменения; эмбриогенеза кардинально отражаются на строении эмбрионов и дальнейшее, развитие невозможно. В . научной литературе, касающейся- развития морских ежей, описано множество примеров прекращения; хода эмбриогенеза- при «выключении» тех или иных генов. Однако практически все эти примеры описывают именно остановку развития но не прекращение хода эмбриогенеза вследствие аномального развития, или: неправильной закладки зародышевых листков. Приведенные выше примеры экзогаструляции и формирования ОПЄ у эмбрионов являются немногочисленными исключениями. Несколько лет назад при исследовании роли гена spRunt в эмбриогенезе морских ежей при ингибировании транскрипции этого гена была наглядно продемонстрирована, остановка развития с образованием ранее неизвестных структур у эмбрионов (Goffmane/ al., 2004; Dickey-Sims et al., 2005); По внешнему виду эти образования сходны с опухолеподобными структурами эмбрионов после трансформации геном gal4 и агробактериальной трансформации. При ингибировании активности spRunt помимо изменения в морфологии и остановки дальнейшего развития наблюдается апоптоз части клеток и следующая за ним активизация пролиферации. Сравнивая все известные типы нарушений хода эмбриогенеза, в первую очередь следует обращать внимание на план строения эмбрионов и время появления аномалий в развитии. Это связано с тем, что развитие морских ежей в достаточной степени детерминировано, и события, имеющие место в определенный период времени, будут являться следствием различных молекулярно-генетических процессов.
Первой из подобных аномалий была описана экзогаструляция, представляющая собой выпячивание архентерона наружу при воздействии определенных факторов. Экзогаструляцию у млекопитающих можжи вызвать путем удаления яйцевых оболочек. Более того, при экзогаструляции у амфибий вследствие отсутствия контактов между хордомезодермой и эктодермой НЄ происходит закладки нервной системы. Для нормального хода эмбриогенеза и закладки зародышевых листков необходимо взаимодействие клеточных полей эмбриона. При экзогаструляции такие взаимодействия осуществляются не в полной мере. Кроме того, морфогенетические движения клеток претерпевают изменения, и это все является причинами, по которым закладка некоторых типов тканей эмбриона невозможна, что приводит к остановке дальнейшего развития.
Процессы, имеющие место при экзогаструляции, приводят к изменению клеточной судьбы при формировании трех зародышевых листков и получили название вегетализации. Изменения происходят в vegl регионе аборальной эктодермы. Нижняя часть региона, прилегающая к региону будущей энто-мезодермы, претерпевает трансдетерминацию, при этом в ней наблюдается экспрессия специфичных для энтодермы маркеров, таких как Endol6 (Yuh, Davidson, 1996). Точные механизмы выпячивании архентерона наружу не изучены до конца, по всей вероятности, это происходит из-за формирования обширного региона энтодермы. Такое нарушение при закладке зародышевых листков приводит в дальнейшем к изменению строения эмбриона и нарушению взаимодействий между эмбриональными листками. Результатом является остановка развития вследствие невозможности закладки некоторых типов ткани.
Следует обратить внимание на строение экзоархентерона и экзогаструлы в целом. При выпячивании первичной кишки наружу она сохраняет эпителиальное строение. Более того, на верхушке экзоархентерона наблюдается, выселение клеток вторичной мезенхимы и, в некоторых случаях, возможно формирование целомических мешков (Gustafson, Wolpert, 1963).. Клетки первичной мезенхимы в это время имеют нормальный паттерн. При экзогаструляции происходит вегетализация прилегающих к области презумптивной энтодермы эмбриональных полей эмбриона, в-результате чего нарушается процесс эмбриогенеза из-за трансдетерминации части эктодермы в энтодерму и, как следствие, происходит ненормальная закладка и формирование зародышевой энтодермы.
Иное строение имеют эмбрионы с опухолеподобными структурами, трансформированные плазмидой рМА563, несущей ген gal4. В этом случае1 развития- первичной кишки не наблюдается, а практически весь бластоцель. занимают клетки, по строению сходные с мезенхимными. По-видимому, экспрессия gal4 приводит к увеличению пролиферативной активности эмбриональных клеток морских ежей, как это было показано на первичных культурах эмбриональных клеток морских ежей (Bulgakov et ah, 2002). Изменение пролиферативного статуса большей частью должно иметь место в мезенхимных клетках ввиду ненормального увеличения количества мезенхимы в трансформированных эмбрионах, отсутствия энтодермального зачатка и постепенного разрушения эпителиальной структуры внешнего слоя клеток. К какому зачатку (эктодерма или энтодерма) следует относить поверхностный эпителий зародыша с опухолеподобной структурой, морфологически определить невозможно, поэтому мы характеризуем его как внешний слой клеток. Кроме того, наблюдаемые в этом случае процессы изменения хода эмбриогенеза при формировании ОПС сильно отличаются от таковых, имеющих место при экзогаструляции, где при вегетализации эмбриона сдвиг детерминации клеточных полей эмбрионов происходит в энто-мезодермальном направлении
