Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Из истории изучения секреторных структур цветковых растений
1.1 Нектарники 6
1.2 Осмофоры 17
1.3 Трихомы 21
1.4 Биохимия летучих пахучих веществ 31
1.5 Некоторые аспекты применения, генетики,
биотехнологии 34
Глава 2. Материал и методика 36
Глава 3. Результаты исследований
3.1 Морфология, анатомия, цитология 43
3.2 Гистохимия и флуоресценция 99
Глава 4. Обсуждение результатов.
4.1 Нектарники 101
4.2 Осмофоры 110
4.3 Волоски - трихомы 114
4.4 Некоторые особенности ультраструктуры секреторных клеток цветка 127
4.5 Взаимодействия между секреторными структурами цветка 133
Выводы 137
Список литературы 139
Приложение 155
- Нектарники
- Биохимия летучих пахучих веществ
- Морфология, анатомия, цитология
- Некоторые особенности ультраструктуры секреторных клеток цветка
Введение к работе
Изучение секреторных структур и образования секрета является весьма актуальным, так как продуцируемые растениями вещества не только играют важную роль в их жизнедеятельности, но и могут широко использоваться человеком. Изучение секреторных систем растений имеет давнюю историю. Начиная с работ Грю и Мальпиги, изучены различные аспекты топографии, происхождения, развития и физиологии секреторных клеток и систем у различных групп растений. Большинство работ посвящено секреторным структурам, связанным с вегетативными органами (слизевые ходы и железки, млечники, пищеварительные железки насекомоядных растений, эфирно-масляные волоски и железки, смоляные ходы, гидатоды, внецветковые нектарники). Существенно меньше внимания уделено изучению секреторных тканей цветка.
Как отметил А.Е. Васильев в работе 1977 года, весьма перспективным является метод электронной микроскопии в сочетании с методами цитохимии. Эта точка зрения не потеряла своей актуальности и сейчас. К секреторным тканям цветка можно отнести: нектарники, осмофоры, различные трихомы.
Все эти структуры так или иначе участвуют в процессах аттрактации, опыления, оплодотворения и развития зародыша. Представляет интерес сравнительное цитологическое изучение клеток, особенно на ультраструктурном уровне, а также сравнение механизмов выделения секрета и возможных путей их регуляции в разные периоды функционирования цветка.
Несмотря на давнюю историю (более 200 лет) изучения нектарников, как секреторных и морфологических частей цветка, и широкий круг рассматриваемых вопросов, большинство из них остаётся пока без ответа. Исследователи обычно охватывают ограниченное число семейств и небольшое число видов внутри семейств в качестве объектов изучения. Природа нектарников у многих представителей, как тропической флоры, так и средней полосы остаётся неизвестной, так как редко применяется сравнительно-анатомический и сравнительно-морфологический методы исследования, а тем более — изучение онтогенеза нектарников. Существует относительно немного работ с хорошими анатомическими иллюстрациями (Bonnier, 1878; Feldhofen, 1933; Карташова, 1965), но они затрагивают только отдельные виды в семействах. В физиологии нектарообразования и нектаровыделения не существует единой общепринятой концепции механизма этих процессов. Немногое известно о биологической роли нектарника как мультифункциональной структуре и взаимоотношениях в системе "нектарник-цветок-опылитель". Недостаточность знаний о нектарниках не позволяет широко использовать их особенности для изучения филогенетических отношений разных таксонов.
Продуцируемый растениями запах играет огромную роль в их жизни. Прежде всего это - привлечение опылителей - аттрактивная функция. Ее выполняют специализированные ткани - осмофоры, а также разнообразные железистые волоски и железки. Часто пахнет и сам нектар - первичный аттрактант. Вторая разновидность аттрактации - привлечение животных- защитников, например, муравьев, спасающих растение от «нектарных воришек» и тем самым способствующих благополучному опылению и диссеминации. Эту роль выполняют либо нецветковые нектарники, широко представленные, например, у рода Impatiens, либо железистые чешуйки и железки, например у представителей Bignoniaceae. Эти секреторные структуры располагаются в основном на черешках листьев, цветоножках и чашелистиках. Еще одна функция связана с отпугиванием травоядных животных и насекомых-вредителей. Роль репеллентов играют вещества, продуцируемые секреторными трихомами, которые могут находиться на разнообразных частях растения. Выделяемые растениями пахучие вещества (воздушный сигнал) выполняют функцию сигнала для соседних растений во время поражения их патогенами и тем самым позволяют другим особям подготовиться к инфекционной атаке, активировать их системы защиты (Dudareva, Pechersky, 2000).
Подробное рассмотрение таких структур и изучение их метаболитов началось сравнительно недавно. В последние время появился ряд работ, посвященный строению, секреции железистых волосков, но большей частью расположенных на вегетативных органах растений (Belmonte, 1986 и др.). Пристальный интерес к этой теме связан с тем, что трихомы синтезируют выделяют ряд веществ, интересных для человека в техническом и медицинском аспектах. Эти волоски играют разнообразную роль в жизни самого растения, но часто их значение не выяснено. Разнообразие функций и различия в составе секрета отражаются в разнообразном строении и путях выделения веществ. Возможность участия железок и волосков, например, в синтезе гормонов и фоторецепции (Данилова, Кашина, 1999) позволяет шире взглянуть на роль этих структур в жизни растения и возможности их применения в деятельности человека. Эти данные важны для решения вопросов, связанных с физиологией секреции. В семействе норичниковых многие растения известны своими лекарственными свойствами (Носаль, Носаль, 1958; Палов, 1998). В связи с этим особенный интерес представляет анализ продукции головчатых трихом. Изучение видов, синтезирующих и аккумулирующих летучие терпеноиды (масла), представляет большой интерес для развития некоторых отраслей промышленности.
Однако работы, отражающие строение и функционирование железистых трихом цветка, единичны, а терминология практически не разработана.
Классической работой, посвященной осмофорам, является работа Фогеля (Vogele, 1962), где предложены основные методы изучения и дана характеристика этой ткани на светооптическом уровне.
Последние работы, в частности, охватывающие и ультраструктурный уровень исследований, касаются только осмофоров орхидных (Curry, McDowell, 1991, Pridgeon, Stern, 1983).
В качестве объекта изучения нами было выбрано семейство Scrophulariaceae, которое занимает центральное положение в порядке Scrophulariales. Это семейство привлекло наше внимание потому, что его представители имеют различные типы цветков и, следовательно, различные способы аттрактации и типы опыления. Сведения о нектарниках представителей норичниковых немногочисленны, касаются небольшого числа видов и не всегда подкреплены иллюстративным материалом. Вопросы морфогенеза нектарников и их эволюции внутри семейства не освещены. В работах с применением сравнительно-морфологического метода (Pennell, 1935; Карлова, 1975) и сравнительно-эмбриологического метода (Афанасьева, 1960; 1976; Карлова, 1975) о нектарниках вообще не упоминается.
Следует отметить, что такие важные структуры цветка как трихомы и осмофоры в семействе не изучены.
Цель данного исследования состояла в изучении морфологического и анатомического строения, цитологических особенностей секреторных структур цветка представителей семейства Scrophulariaceae в сравнительно-морфологическом и онтогенетическом плане. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: изучить морфологию секреторных структур и выявить ткани осмофоров в цветках представителей семейства Scrophulariaceae; изучить анатомическое строение секреторных структур цветка представителей семейства Scrophulariaceae; исследовать морфогенез нектарников, осмофоров и трихом цветка некоторых представителей семейства Scrophulariaceae; изучить ультраструктуру секреторных структур представителей исследуемого семейства на разных стадиях их развития и в разном функциональном состоянии; выявить разнообразие и осуществить попытку классификации секреторных структур цветка представителей семейства Scrophulariaceae; определить возможные механизмы секреции, установить дополнительные функции и выявить тенденции эволюции секреторной системы цветка в целом, а также изучить биологическую роль нектарников, осмофоров и трихом как единой функциональной системы аттрактации у представителей семейства Scrophulariaceae.
Нектарники
Довольно подробные обзоры литературы по строению, физиологии и биологии нектарников существуют в работах ряда исследователей (Feldhofen, 1933; Кулиев, 1960; Тутаюк, 1962; Карташова, 1965; Васильев, 1977; Зауралов, 1985). Наиболее полный обзор охватывает период до 1965 года, он содержится в монографии Н.Н. Карташовой. Поэтому вначале мы делаем краткий обзор трудов и направлений исследований за этот период, руководствуясь работой Н.Н.Карташовой (1965) и более подробно остановимся на публикациях последующих лет.
Выделение сахаристой жидкости растениями, связанная с этим их медоносность, связь цветков и насекомых издавна привлекали внимание ученых. О медоносных растениях писали такие отцы ботаники как Аристотель и Теофраст (Bonnier, 1879; Кулиев, 1960; Карташова, 1965). Однако долгое время для частей цветка, выделяющих нектар, не существовало определенного термина, на что указывал еще А. Декандоль (De Candolle, 1827, цит. по: Карташова, 1965). Лишь в 1735 г. К.Линней (Linne, 1956; Линней, 1989) предложил для них термин "нектарий".
По положению на растении нектарные железки были разделены на флоральные (цветковые) и экстрафлоральные (внецветковые) (Caspary, 1848). Впоследствии экстрафлоральные нектарники подробно изучены рядом исследователей (Radtke, 1926; Zimmeman, 1932; Дарвин, 1950а,б; и др.). Особо были выделены септальные нектарники однодольных, описанные в классической монографии Шнивинд-Тис (Schniwindhies, 1897) и работах других авторов.
Н.Н. Карташова выделяет несколько направлений в изучении флоральных нектарников. Одно из них затрагивает вопрос о происхождении нектарников, их природе (Payer, 1857; Daumann, 1931; Fisher, 1928; Arber, 1931a,b; Карташова, 19596, 1961, 1962; Немирович-Данченко, 1964, 1965; и др.) у представителей некоторых родов и семейств покрытосеменных растений.
Анатомо-морфологическое и анатомо-физиологическое направления начаты Р. Каспари (Caspary, 1848), который дал описания нектароносной ткани и первую классификацию нектарников по их положению в цветке. Классическая работа Г. Боннье (Bonnier, 1878) не утратила своего значения и по сей день. Автор дал морфолого-анатомические описания нектарников большого числа растений, затронул вопрос о зависимости нектаровыделения от экологических условий произрастания и сопроводил свой труд прекрасными иллюстрациями. Большой фактический материал по анатомии нектарников содержится в работах Фельдхофена, Дауманна и Фана (Feldhofen, 1933; Daumann, 1930a,b, 1941; Fahn, 1952). Их данные часто были использованы последующими авторами для обобщающих сводок по этой теме (Кулиев, 1960; Карташова, 1965). Все вышеперечисленные исследователи отмечают наличие у нектарников как минимум двух гистологических зон. Это варьирующий по структуре эпидермис и сходная по строению у большинства видов секреторная ткань, содержащая разные запасные вещества (Feldhofen, 1933).
Непосредственно с изучением морфологии и анатомии связано исследование проводящей системы в нектарниках. Это направление, как указывает Н.Н. Карташова (1965), развивалось в многочисленных работах, начиная с Боннье (Bonnier, 1879; Radtke, 1926; и др.). Оно является важным для понимания физиологической сущности нектарников и их связи с другими выделительными структурами (гидатодами, солевыми железками и др.). Сюда же относятся экспериментальные работы по изучению зависимости секреции и состава секрета от особенностей проводящих элементов (Agthe, 1951), условий освещения и протекания процесса фотосинтеза (Beutler, 1930; Кулиев, 1952; Гирник, 1958 и др.).
Связь эволюции нектарника и морфогении цветка подробно обсуждена рядом ученых (Fisher, 1928; Daumann, 1931; Fahn, 1952; Карташова, 1959, 1961; Кулиев, 1960; Тутаюк, 1961, 1962). Особенно интересны работы Фана (Fahn 1952, 1953). На большом материале он выявил основную эволюционную тенденцию - акроцентропетальное перемещение нектароносной ткани в цветке.
Вопрос о биологической роли нектарников одним из первых занимал умы ученых. Еще в XVI веке Цезальпино считал, что нектар необходим для питания и роста молодых зародышей (Caesalpini, 1583; цит. по: Карташова, 1965). Ряд исследователей, начиная со Шпренгеля (Sprengel, 1793), придерживается мнения о нектаре как о пище для насекомых-опылителей, тем самым указывая на важную роль нектарников и их секрета в обеспечении перекрестного опыления (Дарвин, 19396 1950а,б; Ильин, 1946; Козо-Полянский, 1951;Руцкий, 1951; Тахтаджян, 1954а,б, 1964; Берг, 1959).
В 1965 году вышла монография Н.Н.Карташовой, подводящая итог ее многолетним исследованиям цветковых нектарников двудольных растений (Карташова, 1955-1964). В своем труде автор рассматривает многочисленные вопросы, касающиеся нектаровыделения и нектаропродуктивности; химического состава нектара; анатомии, морфологии и эволюции нектарников. На огромном материале (более 350 видов), при учете данных других авторов, Н.Н. Карташова показывает разнообразие структуры эпидермиса, цитологические особенности секреторной ткани и подстилающей паренхимы нектарника. Она выделяет несколько типов проводящей системы - флоэмная паренхима, тяжи протофлоэмы и полные проводящие пучки. Секреция может осуществляться разными путями: диффузией через кутикулу, разрывами в кутикуле, а у большинства - через устьичные щели, размер которых может изменяться у ряда растений. Карташова дает свою оригинальную (и до сих пор наиболее разработанную) классификацию нектарников. Эта классификация базируется не только на анатомо-морфологических характеристиках, но и на особенностях морфогенеза нектарников. Все многообразие разделено на 4 типа: 1. Нектарники-эмергенцы, морфологически выраженные. 2. Нектарники-эмергенцы, морфологически невыраженные. 3. Нектарники, как рудименты частей цветка. 4. Нектарники, возникающие из примордиев частей цветка (модифицированные лепестки у некоторых лютиковых).
Некоторые коррективы в эту классификацию были внесены В.В. Письяуковой (1976), которая считает, что можно выделить только две группы типов нектарников:
1. Нектарники-эмергенцы;
2. Нектарники примордиального происхождения
Первая группа соответствует первым двум по Н.Н. Карташовой, вторая объединяет две оставшиеся.
В эволюции нектарников Н.Н. Карташова отмечает три главных направления. Первое - возникновение нектарников при уменьшении числа тычинок у растений с верхней завязью.
Второе — у растений с цветочной трубкой аппендикулярной природы -перемещение нектароносной ткани с нижней в верхнюю часть цветка.
Третье направление связано с развитием секреторной ткани в основании завязи и как верх эволюции - формирование нектароносного кольца с хорошо развитой проводящей системой в цветках с синкарпной завязью и спайнолепестным венчиком. Н.Н. Карташова затрагивает вопрос о мультифункциональности нектарника — антибиотические свойства нектара, его значение для развития плодов и семян, и, конечно, отмечает важную роль в привлечении опылителей. Работа Н.Н. Карташовой особенно ценна тем, что в ней приведены различные методики для многостороннего изучения нектарников и дана критическая оценка исследований в этой области за предшествующее время. Впоследствии Н.Н. Карташова и ее школа выпустили несколько работ, посвященных цитологическому исследованию нектарников как секреторных структур. Особое внимание в них уделено выяснению роли ядра и ядрышка, влиянию плоидности на цитофизиологию процесса секреции (Михайлова, 1958; Бондарь, Михайлова, 1968; Карташова и др., 1968; Карташова, Немирович-Данченко, Цитленок, 1970).
Биохимия летучих пахучих веществ
Основу пахучих секретов составляют различные терпены (Рощина, 1989). Выделяют несколько классов этих соединений: 1) монотерпены - летучие - гераниол, лимонен, ментол, камфора, альфа-кинен + циклические монотерпены, 2) сесквитерпены, которые играют меньшую роль в создании запаха, 3) гормоны - абсцизовая кислота, гиббереловая кислота, стероиды, ферменты синтезирующие терпены, борнилпирофосфат циклаза.
Их синтез идет в пластидах, лейкопластах амебоидной формы, в которых отсутствуют внутренние мембраны и рибосомы.
Фермент гидроксиметилглутарил-Ко-А-синтетаза, участвующий в синтезе терпенов, находится в АЭР, мембранах митохондрий и пластид. Источником для синтеза, например, монотерпенов служит изопентилфосфат. По другой классификации (Vainstein, Lewinson, Pichersky, Weiss 2001), большинство самых распространенных пахнущих компонентов принадлежат следующим трем главным классам: 1) фенилпропаноиды (включая бензоидные соединения), 2) производные жирных кислот 3) терпеноиды
Составляющие пахучих веществ - это спирты с короткой цепочкой, альдегиды, образующиеся в результате деградации фосфолипидов и жирных кислот в результате работы липооксидаз, пероксидаз, изомераз и других ферментов. Сесквитерпены синтезируются в цитозоле, монотерпены в пластидах. Используя метод меченых антител, было показано (Turner, Gershenzon, Nielson, Froehlich, Croteau, 1999), что в железистых волосках синтез монотерпенов происходит в лейкопластах, дальнейшие их превращения происходят в цитозоле. Описана (Heinrih, Pfeifhofer, Stabentheiner, Sawidis, 2002) положительная корреляция между количеством лейкопластов и содержанием монотерпенов в эфирном масле. Локализация синтеза монотерпенов в амебоидных лейкопластах экспериментально подтверждена синтезом немодифицированных монотерпенов изолированными лейкопластами (Turner, Gershenzon, Croteau, 2000).
Локализация большинства фенолпропаноидов и бензоидов пока не известна, но, скорее всего в цитозоле и, возможно, в пероксисомах. Многие ферменты биосинтеза флавоноидов и фенилпропаноидов обнаружены в ЭПР (Turner, Gershenzon, Croteau, 2000). Основные ферменты, осуществляющие конечные этапы синтеза пахучих веществ - метилтрансферазы и ацетилтрансферазы. Метилтрансферазы используют SAM как донор метила. ВЕАТ-ацетилтрансфераза использует ацетил-КоА как донор ацетилов (Dudareva, Pechersky, 2000).
В основном это приятные для человеческого обоняния запахи, имеющие биотехнологический потенциал или уже нашедшие применение в косметике, парфюмерии, медицине. Однако среди них есть такие, которые мы не воспринимаем, но их чувствуют насекомые. Эти соединения ждут подробного изучения и возможного применения.
Наши знания о синтезе и локализации летучих пахучих веществ значительно расширены в течение последних 15 лет благодаря применению простых, чувствительных методов, например, газовой хроматографии, спектрометрии (Dudareva, Pichersky, Gershenzon, 2004). Исследованные соединения являются в основном, липофильными продуктами с молекулярными массами около 300 кДа. Почти все эти вещества выделены из вегетативных органов (некоторые даже из корней), а также цветков.
Происходит синтез летучих веществ в эпидермальных клетках, откуда они могут легко выделяться в атмосферу (или ризосферу). Или в железистых трихомах (например, мяте, Artemisia annua, Ocimum basilicum и др.). В цветках есть специализированные оформленные и не оформленные структуры для секреции запаха. Их работа скоординирована с ритмикой цветения.
Основной прогресс в изучении этих соединений, как в других областях биологии, связан с использованием молекулярных и биохимических методов. Описано много генов, кодирующих энзимы различных этапов биосинтеза летучих пахучих соединений. Именно выделение и характеристика генов ответственных за образование летучих составов, облегчили исследование различных путей биосинтеза, что дало возможность предложить модели их регуляции. Установлена положительная корреляция между количеством мРНК, количеством белка, активностью ферментов и эмиссией. Эмиссия запаха регулируется уровнем мРНК в месте секреции. Пахучие компоненты синтезируются в клетках эпидермиса лепестков де ново когда раскрываются бутоны.
При этом ген, ответственный за синтез специфических ферментов в биосинтезе запаха, кодирует катализаторы в биосинтезе лигнина. Небольшие изменения его работы приводят к синтезу другого энзима. Эти гены принадлежат к числу кодирующих ацетилтрансферазы - энзимы, участвующие в продукции вторичных метаболитов.
Исследователи считают (Dudareva, Pechersky, 2000), что возникновение путей синтеза пахучих веществ (и их разнообразие) связано с изменением регуляции путей вторичного метаболизма в растениях. Все многообразие запахов базируется на различной регуляции небольшого числа генов. Таким образом «старые» гены могут быть вовлечены в создание новых запахов.
Изменения в работе ферментов, ответственных за заключительные этапы биосинтеза, происходит параллельно с изменением экспрессии соответствующих структурных генов, что подтверждает основную регуляцию на посттрансляционном уровне.
Уровень ферментов, ответственных за конечные этапы биосинтеза конкретного летучего соединения - не единственный ограничивающий показатель. Регуляция синтеза также включает количество поступающего в секреторные клетки предшественника. Предшественниками часто служат гликозиды (Dudareva, Pechersky, 2000).
В случае ферментов, которые способны использовать несколько аналогичных субстратов, как, например, SAMT и ацилтрансферазы, именно их количество влияет на тип конечного секрета. Роль предшественника в регуляции биосинтеза летучих пахучих составов также недавно была подтверждена методами генной инженерии. Когда ген линалоолсинтетазы был введен в составе вируса мозаики цветной капусты в петунию, различия по сумме синтезированного органами линалоол или гликозида больше зависело от доступа в ткани и количества предшественника для их синтеза, чем от экспрессии гена линалоолсинтетазы.
Итак, можно выделить несколько путей регуляции биосинтеза эфирных масел: 1) изменение конфигурации и активности ферментов (посттрансляционный уровень) 2) изменение количества ферментов (за счет изменения экспрессии генов, транскрипционный уровень) 3) качественное и количественное изменение секрета в зависимости от поступающего в секреторные клетки субстрата.
Максимальная эмиссия летучих составов в течение дня или ночи совпадает с пищевой активностью потенциальных опылителей. Таким образом, она управляется длиной светового дня и циркадными ритмами.
На количество и качество продукции эфирных масел, а также на процесс их выделения могут существенно влиять такие факторы окружающей среды, как, например, свет, температура и влажность. Кроме того, опыление уменьшает эмиссию пахучих соединений. Этот спад начинается после того, как пыльцевые трубки достигнут завязи.
До настоящего времени очень немного известно о самом механизме выделения летучего секрета из клеток. В общих чертах этот процесс зависит от физических свойств выделяемого состава, свойств поверхности клетки (клеточная стенка и кутикула) и внутриклеточных мембран (например, в случае монотерпенов, которые синтезируются в пластидах). Мембраны, участвующие в разделении компонентов и их хранении внутри клетки, или наружные мембраны и эпидермальные клеточные стенки могут быть избирательно проницаемой для некоторых летучих составов. Фактически очень мало или почти ничего неизвестно о взаимодействиях метаболитов с внеклеточными структурами (например, субкутикулярными полостями). Как происходит транспорт продуктов туда, какие преобразования могут происходить вне протопласта, какие механизмы управляют выделением секрета наружу. Также дальнейшего изучения требуют и эти процессы, содействующие регуляции эмиссии летучих составов.
Морфология, анатомия, цитология
Scrophularia nodosa Нектарник овариально-рецептакулярный - хорошо развитый крупнолопастной нектарный диск (рис. 12 А, Б), расположенный на цветоложе его поверхность представлена мелкими изодиаметрическими клетками со складчатой поверхностью и тонкой кутикулой. Устьица отсутствуют, выделение нектара идет, по-видимому, через оболочку клеток. Эпидермальные клетки довольно крупные, почти квадратные на срезе, со слабо утолщенными стенками. Цитоплазма густая, имеются оформленные ядра с ядрышками. Секреторная ткань многослойная, сложена крупными слабо вакуолизированными клетками с густой цитоплазмой и оформленными ядрами с ядрышками. Клетки секреторной ткани, так же, как и клетки эпидермы, хорошо адсорбируют краситель. По размеру они мельче клеток эпидермы, увеличиваются в размере к моменту секреции. Паренхима нектарника (далее — н.) выражена слабо и непосредственно переходит в паренхиму цветоложа. Слои высоко вакуолизированых изодиаметрических клеток, слабо адсорбирующих красители. Клетки крупнее клеток эпидермы и секреторной паренхимы. Н. снабжен мощным разветвленным протофлоэмным проводящим пучком, отходящим от пучка стенки завязи.
Развивается как овариальный нектарник, меристема нектарника закладывается уже в бутоне 1-2 мм. тэм Клетки н. на стадии бутона перед открытием
Эпидермальные клетки сильно вакуолизированы, вакуоли занимают большую часть объема клетки. В клетках крупные ядра. Секреторная паренхима. Плотная цитоплазма со множеством свободных рибосом. К моменту открытия бутона исчезают крупные вакуоли.
Появляются участки цитоплазмы разной плотности. Митохондрии со светлым матриксом и несколькими кристами. В цитоплазме расположены многочисленные везикулы АГ, неправильной формы липидные капли. Подстилающая паренхима - цитоплазма прозрачная, крупные вакуоли. Многочисленные плазмодесмы соединяют клетки. Меньше межклетников и амилопластов по сравнению с секреторной паренхимой.
Клетки н. в открытом цветке рис. 12
Эпидерма. После открытия цветка и начала активной секреции происходит уплотнение цитоплазмы, в ней находятся многочисленные митохондрии и профили ГЭР. Появляются многочисленные везикулы (они и в секреторной паренхиме). Увеличение в размерах амилопластов. Уменьшаются размеры ядер. Происходит увеличение размеров вакуоли.
На поверхности эпидермальных клеток темная неоформленная масса -видимо, секрет, - нектар под отслоенной кутикулой (рис. 12 Г).
Секреторная паренхима. Происходят изменения, сходные с изменениями в эпидермальных клетках. Крупные ядра с диффузным хроматином, иногда с извитым контуром, маленькое ядрышко. Клетки связаны многочисленными плазмодесмами. Лейкопласты с крахмальными зернами. В дальнейшем они частично разрушаются, с образованием на их месте вакуолей. Формируется центральная вакуоль. Митохондрии ортодоксальные для такого типа ткани, с немного расширенными кристами и просветленным матриксом. ГЭР. Диктиосомы активного АГ. Липидные капли неправильной формы, темнее по сравнению со стадией бутона. Периплазматическое пространство с везикулярными структурами. Много развитых межклетников, заполненных темным содержимым. Много вакуолей в эпидермальных и секреторных клетках заполнено светло-серым хлопьевидным материалом (по электронной плотности как кутикула). Эти липидоподобные конгломераты (рис. 12 Г, Ж) пронизаны тонкими черными фибриллами. Проводящий пучок подходит к секреторной паренхиме, немного в нее заходит. Плотная цитоплазма. Слабо вакуолизированые клетки. Многочисленные митохондрии. Выпячивания клеточной стенки образуют протуберанцы. Соседние клетки паренхимы богаты митохондриями, диктиосомами АГ, ЭПР.
После активной секреции нектара наблюдается явная аутофагическая активность вакуолей в клетках. Однако ткани нектарника не разрушаются сразу после опыления. Нектарник сохраняется при зреющем плоде. Linaria vulgaris открытый цветок
Н. овариально-рецептакулярный - нектарный валик-диск светло-желтого цвета, окружающий основание завязи в виде зигоморфного асимметричного кольца (рис. 44 А, 49 А). Н. имеет хорошо выраженное утолщение (рис.45 А), обращенное к шпорцу. Этот участок н. на большем своем протяжении не срастается с завязью, однако в основании завязи виден плавный переход ее поверхности в поверхность н. Эпидермальные клетки н. почти прямоугольные с поверхности, среди них встречаются устьица (рис. 45 Б). Максимальное число устьиц приходится на выступающий участок. Клетки эпидермы (рис. 47, 49 Б, В) на срезе также прямоугольные, с крупными вакуолями и плотными ядрами. Замыкающие клетки устьиц мельче, с утолщенными стенками, плотной цитоплазмой и крупными ядрами с ядрышками. Секреторная паренхима хорошо окрашивается красителем. Ее клетки (рис. 47, 49 Б-Д) довольно крупные, содержат крупные ядра с ядрышками, многочисленные крахмальные зерна. В н. входит разветвляющийся проводящий пучок (рис. 43 Б, 46, 48, 49 Г), состоящий из протофлоэмы и отходящий от пучка, идущего в стенку завязи.
Формирование н. начинается на очень ранних этапах развития цветка. Он закладывается как бугорок в основании завязи (рис. 44 а), а затем (рис. 44 б,в) идет его асимметричный рост. Клетки н. на ранних стадиях развития мелкие с плотной цитоплазмой и крупным ядром, расположенным в центре клетки.
Шпорец изнутри покрыт одноклеточными простыми волосками со струйчатой поверхностью (рис. 49 Е). Волоски отогнуты в сторону вершины шпорца. ТЭМ рис. 50-55 Нектарник бутон
В бутоне перед открытием плотная цитоплазма занимает пристеночное положение. Стандартные митохондрии и пластиды с маленькими крахмальными зернами. АГ активный, окрашивается проционовыми красителями (рис. 51 Г), также много окрашенных ими же везикул, что показывает присутствие в них белков и углеводов (гидроксильные остатки). Темный хлопьевидный материал в периплазматическом пространстве, вдоль всей клетки. В цитоплазме и в вакуолях встречаются одиночные осмиофильные включения.
Цветок
Эпидермальные клетки сильно вакуолизированы, вакуоли занимают большую часть объема клетки. Цитоплазма прозрачная, плотная только в клетках устьица. Крупные ядра с диффузным хроматином. Активные ядрышки с несколькими ФЦ. Плазмалемма формирует извитой контур, содержимое периплазматического пространства. Секрет на поверхности эпидермальных клеток тонкозернистый.
Многочисленные митохондрии и ГЭР. Появляются многочисленные везикулы. Происходит увеличение в размерах митохондрий и амилопластов. Особенно крупные пластиды с крупными крахмальными зернами в клетках нектарного устьица (рис.50 А, Б)
Секреторная паренхима. Цитоплазма средней электронной плотности, много свободных рибосом.
Некоторые особенности ультраструктуры секреторных клеток цветка
Ядро
Ядра секреторных клеток имеют извитой, лопастной конутур, что является признаком активно протекающего метаболизма. Ядра с диффузным хроматином и глыбками хроматина по периферии. Встречаются хромоцентрические ядра (рис. 70) и хромонемно-хромоцентрические.
В ядрах одно-два ядрышка.
Ядрышко - изменение структуры - переключение, смена метаболизма клетки. Количество ФЦ в ядрышке является хорошим показателем активности ядра (Ченцов, 2004) и клетки в целом, свидетельствующим об уровне синтетических процессов в ней. Активные ядрышки с несколькими ФЦ в предсекреторный период. Ядрышки с выростами (нуклеонемные) в меристемах, особенно префлоральной (Данилова, Кашина, 1999) связаны с постранскрипционным преобразованием (процессингом) пре-и-РНК. Ядрышки компактные с крупными фибриллярными светлыми аморфными центрами - гетерогенными ФЦ - свидетельство активного синтеза рРНК на рДНК (Ченцов, 2004). Похожие ядрышки описаны (Show, Jordan, 1995) в животных клетках, связанных с процессами созревания половых клеток. Это указывает на возможное участие секреторных клеток нектарников, трихом в формировании гаметофита. Такие ядрышки характерны для всех секреторных структур в бутоне.
Нами отмечено, что после периода активной работы ядрышка, как правило, в открытом цветке, происходит его сегрегация (разделение ФК и ГК). То есть происходит полная или частичная дезактивация ядрышка и снижение синтетических процессов. Хотя многочисленные элементы ГЭР в таких клетках, свободные рибосомы и митохондрии могут свидетельствовать о продолжающемся синтезе белков на матрицах и-РНК, синтезированных в большом количестве в предыдущий период «активного ядрышка».
Изменения, приводящие к дезактивации ядрышка, обратимы (Muneur, Jeannane, Thiry, Deltour, Goessens, 1998). В тканях открытого цветка снова появляются активные ядрышки, но не во всех клетках.
Нектарник. Активное ядрышко в предсекреторный период. Дезактивация в клетках эпидермы (рис. 130 А, Б) перед открытием в бутоне и, частично, в секреторных клетках в открытом цветке (рис. 141 А), начале цветения. В секреторных клетках могут встречаться два ядрышка в разных состояниях, например, одно компактное без ФЦ и рядом ретикулярное (рис. 54 Б, В). Дифференциация активности клеток в этот период. После опыления происходит восстановление активности ядрышек эпидермальных клеток, возможно, связанное с синтезом специфических белков и ферментов для процесса реабсорбции.
Волосок. Активность ядрышка не снижается во время секреции, активные ядрышки в период секреции сохраняются и в клетках ножки. В головчатых волосках типа А синтез идет на всем протяжении их функционирования. В маленьких головчатых типа В ядрышки с большим числом ФЦ - наиболее активные в бутоне. В открытом цветке в их секреторных клетках происходит необратимая сегрегация ядрышка. Такие волоски немногочисленны, расположены на чашечке и завязи (рис. 100 А, Б), вероятно, их основная функция состоит в секреции БАВ, регуляторных веществ, необходимых для нормального созревания генеративных структур цветка.
В ядре могут находиться кристаллоиды белковой природы, например, в клетках паренхимы нектарника (рис. 129 В, Г). Может быть, это белок актин или микрофиламенты. Возможно, это изменение состояния белков ламины. За недостатком материала мы не можем обсуждать особенности отложения таких включений в ядре и их функциональную нагрузку. Во всяком случае, как указывалось ранее, это не влияет на работу самого ядра.
Клеточная стенка и кутикула являются не пассивными скелетными и защитными структурами, а компартментом, активно участвующим в жизни клетки. Место запаса кальция (Муравник, Иванова 1999), ионообменник (Meychik, Yermakov, 2001). Утолщения, протуберанцы клеточных стенок могут содержать олигосахарины (активные олигосахариды), относящиеся к новому классу фитогормонов (Элберсгейм, Дарвилл, 1985), которые контролируют ряд функций растения, в том числе и защиту, морфогенез, а в смеси с другими гормонами (ауксинами и цитокининами) - участвуют в регуляции цветения.
Кутикула может играть ферментативно-каталитическую роль при модификации проходящих через нее веществ (рис. 24 Г,Д, рис 29 Б, 90 В).
Схожее расслоение клеточной стенки и кутикулы описаны в клетках папилл рыльца Strongilodon macrobotrys (Prychid, Owens, Rudall, 1998). В субкутикулярном пространстве там находится эскудат в виде липидных капель, идет подготовка к разрыву кутикулы на рыльце перед опылением. Сходные процессы протекают и в трихомных нектарниках Penstemon при подготовке к выделению нектара из кутикулярного вздутия. Есть данные (Douliez, 2004) о том, что мономеры кутина и суберина (со-гидроксилпальмитиновая кислота, а,со-тетрадекандикарбоновая кислота, а,со-гексадекандиол, 12-гидроксилстеариновая кислота) индуцируют уменьшение размера фосфолипидных везикул от нескольких микрометров до приблизительно 300 нм, изменяют структуру мембран.
Производные пектиновой части клеточной стенки участвуют в формировании субкутикулярных полостей и расширений при экзосекреции. Фибриллярный матрикс полости является местом прохождения активных модифицирующих секрет реакций, что хорошо видно при изменении плотности и цвета липидного компонента в полости в разные фазы
созревания волоска (рис. 124, 142, 146, 147). Уже была показана локализация продуктов секреции при образовании терпенов, главных составляющих запаха, в районе клеточной стенки и в ней самой (рис. 1, Kolosova, Sherman, Karlson, Dudareva, 2001), а также обнаружение продуктов на фибриллярном матриксе в субкутикулярной полости (рис. 3, Mahlberg, Kim, 1997).
Клеточная стенка участвует в обмене веществами с протопластом и внешней средой, транспортирует и модифицирует вещества. Хорошо увидеть изменения клеточной стенки при апопластическом транспорте веществ в субкутикулярную полость можно на рис. 146-148. В области, прилежащей к базальной части полости, клеточная стенка становится более рыхлой. Жесткость клеточной стенки связана с состоянием пектинового матрикса (Suarez-Cervera, Arcalis, LeThomas, Seoane-Camba, 2002). Он связан с ионами кальция, которые связывают пектины. Не эстерифицированные галактуроновые кислоты (компонент пектина) связываются с кальцием. В результате формируется либо гелеобразная подвижная структура, либо жесткая в зависимости от способа связывания кальция с пектином. Подобные изменения в связывании кальция компонентами клеточной стенки лежат и в основе образования субкутикулярных полостей у головчатых волосков. Для перевода структуры в гель, например, при прорастании пыльцы (Suarez-Cervera, Arcalis, LeThomas, Seoane-Camba, 2002) или для выхода ферментов, растворов у насекомоядных бромелиевых (Owen, Tomson, 1991) нужна вода, влага. Расположение головчатых волосков преимущественно вдоль \ над жилками несущих органов показывает необходимость свободного поступления воды в них для быстрого изменения структуры и выделения веществ.
Важная роль клеточной стенки и кутикулы в процессе реабсорбции неоднократно обсуждалась выше. Можно еще раз подчеркнуть важную роль дедритов и сформированных ими структур. После пассивной и \ или активной диффузии на первых этапах реабсорбции, возможен активный транспорт в цитоплазму при участии специфических транспортных мембранных белков и белков рецепторов. Можно предположить, что этот процесс запускает цикл каскадных реакций, приводящих к переключению метаболизма в секреторной клетке.
Можно выделить еще один функциональный аспект клеточной оболочки.
Кутикула (липофильный слой) предотвращает обмен сигналами клеток друг с другом, в таком случае, вероятно, важную роль выполняют дендритов в восприятии сигнала извне. Именно поэтому наиболее развитая система дендритов в кутикуле разнообразных волосков цветка (рис. 66, 76, 82, 111), вступающих в непосредственный контакт с опылителями. Особенности строения и состава кутикулы играют важную роль в нормальном развитии, морфогенезе растения (Sieber and al., 2000).
