Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Систематический обзор и цитогенетическая изученность рода abies mill 9
1.1. Систематический обзор рода A hies Mill 9
1.2. Ботанико-лесоводственная характеристика пихты сибирской 14
1.3. Особенности половой репродукции представителей рода Abies Mill... 20
1.4. Кариологическая изученность рода A hies Mill 24
Глава 2. Объекты, материал и методы исследования 29
2.1. Географическое положение и природно-климатические условия района исследований 29
2.2. Объекты исследования 32
2.3. Материал и методики исследования 39
Глава 3. Микроспорогенез и микрогаметогенез пихты сибирской 46
3.1. Мейоз при микроспорогенезе у пихты сибирской и его особенности в разных условиях произрастания 46
3.2. Нарушения мейоза при микроспорогенезе 55
3.3. Микрогаметогенез пихты сибирской и его особенности в разных условиях произрастания 71
3.4. Нарушения микрогаметогенеза 73
3.5. Особенности развития тапетума в микроспорангиях пихты сибирской 81
Глава 4 . Кариологическая характеристика пихты сибирской 90
4.1. Число хромосом и геномные мутации 90
4.2. Сравнительный анализ морфологии хромосом пихты сибирской из разных местопроизрастаний 94
4.3. Нуклеолярные районы хромосом и анализ ядрышек 99
4.4. Структура нормального кариотипа пихты сибирской 106
Глава 5 . Хромосомные аберрации и патологии митоза у пихты сибирской
5.1. Хромосомные перестройки у пихты сибирской НО
5.2. Анализ митоза у пихты сибирской 114
5.3. Микроядерный тест 122
Заключение 125
Выводы 129
Литература 131
- Систематический обзор рода A hies Mill
- Особенности половой репродукции представителей рода Abies Mill...
- Мейоз при микроспорогенезе у пихты сибирской и его особенности в разных условиях произрастания
- Сравнительный анализ морфологии хромосом пихты сибирской из разных местопроизрастаний
Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Пихта сибирская является одним из основных лесообразующих видов Сибири. Оптимальные условия для своего развития она находит в горах Южной Сибири, где сосредоточено свыше 90 % лесов с ее преобладанием. Черневые пихтовые леса, распространенные только в Алтае-Саянской горной области, представляют собой уникальные формации Сибири (Типы лесов..., 1980; Назимова и др., 2005). Пихта сибирская обладает высоким репродуктивным потенциалом, однако жизнеспособность ее семян крайне низкая, что затрудняет процесс естественного возобновления вида (Горчаковский, 1956; Савченко, 1970; Рябинков, 1977; Бажина, 1997). В последние десятилетия положение усугубляется интенсивным усыханием пихтовых лесов в горных районах Южной Сибири: Хамар-Дабана, Западного и Восточного Саяна (Поликарпов и др., 1986; Воронин, 1989; Бажина, Третьякова, 2001). Одной из основных причин формирования стерильных семян пихты в горах Южной Сибири является недостаточное количество и слабая жизнеспособность пыльцы (Третьякова, Бажина, 1994, 1999).
Одним из важнейших критических периодов полового размножения организмов является мейоз. Качество мужских гамет и успешность оплодотворения у растений зависит от прохождения мейоза и формирования мужского гаметофита, нарушения которых могут привести к стерильности пыльцы. Исследования степени сбалансированности мейотических и митотических циклов позволяют выявлять ранние изменения цитогенетической системы организма и прогнозировать его состояние в меняющихся условиях среды (Буторина, Калаев, 1999, 2000; Калашник и др., 1999; Дмитриева, 2005). В качестве биоиндикаторов уже давно применяются покрытосеменные растения, исследование же голосеменных находится на начальном этапе и ограничено небольшим количеством видов. Между тем, хвойные растения проявляют повышенную чувствительность к различным химическим агентам и позволяют проводить многолетние мониторинговые
5 исследования (Калашник и др., 1997; Шафикова, Калашник, 1997; Druskovic, 1997; Мі сі eta, Murin, 1998; Шафикова, 1999; Махнева и др., 2003 и др.).
Генетические ресурсы основных лесообразующих видов хвойных Сибири и Дальнего Востока изучены недостаточно (Ирошников, 1998; Милютин, 1998, 2006). Кариологические исследования являются составной частью изучения генетических ресурсов и необходимы для использования генофонда мирового разнообразия хвойных. Изучение кариологического полиморфизма служит одним из аспектов исследования фенотипической изменчивости природных популяций растений (Гриф, 1992, 1997). К настоящему времени пихта сибирская, несмотря на широкое распространение и важную лесообразующую роль, оказалась наименее изученной в кариологическом и цитогенетическом отношении по сравнению с другими видами хвойных.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлся сравнительный анализ цитогенетических и кариологических особенностей пихты сибирской в различных местопроизрастаниях Средней Сибири.
В задачи исследования входило:
Изучить процессы, ответственные за формирование мужских гамет -мейоз и развитие мужского гаметофита;
Оценить уровень и спектр цитогенетических отклонений в мейозе у деревьев разных категорий жизненного состояния (морфологически здоровых, пораженных ржавчинным раком, усыхающих) в природных популяциях и искусственных насаждениях;
Изучить кариотип пихты сибирской из разных местопроизрастаний для выявления внутривидового кариологического полиморфизма данного вида;
Провести сравнительное исследование семенного потомства пихты сибирской из разных местопроизрастаний по цитогенетическим показателям (хромосомные мутации, уровень и спектр нарушений митоза, наличие микроядер).
Научная новизна. Впервые проведено детальное исследование характера прохождения мейоза при микроспорогенезе и развития мужского гаметофита у пихты сибирской, установлены особенности этих процессов в различных условиях произрастания и у деревьев разных категорий жизненного состояния. Приведены новые данные о структуре кариотипа данного вида из различных местопроизрастаний. Впервые проведен сравнительный анализ цитогенетических показателей семенного потомства усыхающих деревьев пихты сибирской.
Теоретическое и практическое значение. Полученные данные о характере прохождения мейоза и кариологических особенностях пихты сибирской вносят существенный вклад в изучение репродуктивной деятельности, внутривидовой дифференциации и генетических ресурсов данного вида и служат основой для дальнейших эколого-генетических исследований. Результаты исследований могут быть использованы для цитогенетического мониторинга состояния экосистем. Установленные цитогенетические показатели пихты сибирской из экологически благополучных районов могут рассматриваться как контрольные для проведения цитогенетического мониторинга окружающей среды с использованием данного вида в качестве тест-объекта.
Материалы настоящего исследования используются в лекционных
курсах и на практических занятиях по биологии и экологической генетике на
эколого-биотехнологическом факультете Красноярского государственного
аграрного университета, а также в лекционном курсе по экологии на
лесохозяйственном факультете Сибирского государственного
технологического университета.
Защищаемые положения. 1. Цитогенетические показатели (уровень и спектр нарушений мейоза и митоза, частота встречаемости хромосомных мутаций, наличие микроядер) отражают условия произрастания пихты сибирской.
2. Пихта сибирская характеризуется низким уровнем внутривидового
полиморфизма по кариологическим признакам: морфометрическим
параметрам хромосом, количеству и локализации вторичных перетяжек,
числу ядрышек в интерфазных ядрах.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на
конференциях молодых ученых «Исследования компонентов лесных
экосистем Сибири» (Красноярск, 2004, 2005, 2006), на VIII международной
школе-конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири
и сопредельных территорий» (Абакан, 2004), на межрегиональной
конференции «Горные экосистемы Южной Сибири: изучение, охрана и
рациональное природопользование» (Барнаул, 2005), на международной
школе-конференции «Эмбриология и биотехнология» (Санкт-Петербург,
2005), на IV Российской конференции памяти Л.М. Черепнина «Флора и
растительность Сибири и Дальнего Востока» (Красноярск, 2006), на I
международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006),
на международной конференции «Факторы экспериментальной эволюции
организмов» (Алушта, Украина, 2007, 2008).
Кроме того, результаты исследований были представлены на 3-м съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в 21 веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на международных конференциях «Climate changes and their impact on boreal and temperate forests» (Екатеринбург, 2006) и «Лесные экосистемы северовосточной Азии и их динамика» (Владивосток, 2006).
Публикации. Основные положения диссертации изложены в 19 опубликованных работах, 2 работы находятся в печати.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 16 таблиц и 46 рисунков. Библиографический список включает 249 наименований, из которых 68 - на иностранных языках.
Личный вклад автора. Представленные в диссертации результаты исследований получены непосредственно автором в лаборатории лесной генетики и селекции Учреждения Российской академии наук Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН.
Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность и признательность научному руководителю д.б.н., проф. Е.Н. Муратовой, а также к.б.н. Е.В. Бажиной за помощь в работе над диссертацией. Автор благодарит д.б.н., проф. Л.И. Милютина, к.б.н. Т.С. Седельникову и других сотрудников лаборатории лесной генетики и селекции Учреждения Российской академии наук Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН за обсуждение широкого круга вопросов по изучаемой проблеме, ценные советы и критические замечания, а также за помощь в сборе и предоставление экспериментального материала.
Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке РФФИ (грант № 03-04-49719), РФФИ-ККФН (гранты № 05-04-97717; № 07-04-96810; № 07-04-96823), РФФИ-БФФИ (гранты № 06-04-81026, 08-04-90001), ККФН (гранты № 17G050, 18G106), СО РАН (интеграционный проект № 145), Программы Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».
Систематический обзор рода A hies Mill
Род Abies Mill, (пихта) включает около 50 видов, большая часть которых произрастает на тихоокеанском побережье Азии и Северной Америки. Пихты также являются важными лесообразующими видами Центральной и Южной Европы, Азии и Северной Африки, где формируют темнохвойные и горные леса в районах с умеренно влажным климатом (Бобров, 1978; Козубов, Муратова, 1986; Крылов и др., 1986). Распространение пихт связано преимущественно с горными районами, лишь два вида - пихта сибирская и пихта бальзамическая - приспособились к жизни на равнине, что может свидетельствовать о молодости этих видов в эволюционном отношении (Маценко, 1963, 1964).
При наличии богатых почв, мягкого температурного режима и высокой влажности воздуха многие виды пихт отличаются исключительно высоким приростом, создавая огромные запасы органического вещества на единицу площади. Горные пихтовые леса играют важную почвоохранную и склонозащитную роль, а также являются регуляторами речного стока (Крылов и др., 1986). Древостой пихты имеют большое санитарное и гигиеническое значение благодаря высокому содержанию фитонцидов.
Высокая декоративность большинства видов пихт, связанная с красивой темно-зеленой или сизой конической кроной, делает эти деревья частым объектом интродукционной работы не только в дендрариях и ботанических садах, но и в парковых и аллейных посадках (Качалов, 1969). В отличие от большинства хвойных пихты хорошо переносят подрезку и могут быть использованы для создания живых изгородей. Однако пихты весьма чувствительны к загрязнению воздуха и поэтому непригодны для озеленения крупных промышленных населенных пунктов.
Все представители рода Abies - крупные вечнозеленые конусовидные деревья с отстоящими, более или менее мутовчатыми ветвями. Кора старых деревьев толстая и потрескавшаяся; на молодых деревьях гладкая, часто со смоляными железами. Побеги гладкие, реже морщинистые. Почки смоляные или без смолы, яйцевидные до веретенообразных. Иголки собраны в спиральные ряды, на боковых побегах часто двустрочно-гребневидные с расширенным черешковидно-суженным основанием, после их опадения остается круглый плоский след. Сверху иголки часто морщинистые, с устьичными каналами или без них, внизу расположены два устьичных канала; смоляных ходов два, реже три (Крюссман, 1986). Микростробилы яйцевидные, расположены на нижней стороне побегов предыдущего года. Макростробилы расположены вертикально у концов побегов прошлого года. Семенные чешуи тонкие, каждая несет по два семязачатка; кроющие чешуи зрелых шишек кожистые, приросшие основанием к семенным чешуям. Семена клиновидные или яйцевидные, соединены с превышающим их крылом (Бобров, 1978).
В анатомическом строении древесины наиболее характерным признаком рода Abies является отсутствие лучевых трахеид и смоляных ходов, которые могут возникать только при поранениях (травматические смоляные ходы). Напротив, тяжевая паренхима, крайне редко встречающаяся у других сосновых, у пихт часто присутствует в довольно значительных количествах. На основании этих признаков &. В. Будкевич (1961) относит род Abies к наиболее древней, примитивной группе семейства Pinaceae. Древность рода Abies подтверждается и рядом морфологических признаков, таких как сильное развитие кроющих чешуи у большинства видов и раздвоенный кончик хвои -свидетельство древней дихотомии (Маценко, 1964).
Палеоботанические данные о семействе Pinaceae в виде типичных семян и пыльцевых зерен известны из верхнего триаса и юры. Считается, что хвойные достигли полной родовой дифференциации уже в конце мезозоя (Криштофович, 1950). Самые древние находки рода Abies - верхнеюрские пыльцевые зерна, сходные с пыльцевыми зернами современных пихт (Тахтаджян, 1956). Однако, по мнению Е.Г. Боброва (1978), достоверными можно считать ископаемые остатки пихт лишь с олигоцена.
Несмотря на биологическое и экономическое значение пихт, до сих пор не разработана единая филогенетическая классификация рода Abies, многие вопросы систематики остаются спорными. Существующие таксономические системы рода основаны, главным образом, на морфологических, анатомических и биохимических признаках, таких как форма, расположение и анатомическое строение хвои, структура и форма смоляных каналов, форма и цвет женских шишек, форма и размер кроющих и семенных чешуи (Маценко, 1963, 1964; Liu, 1971; Farjon, Rushforth, 1989). Однако использование этих высоко полиморфных признаков для идентификации видов и классификации их в секции в пределах рода не всегда приводит к однозначным результатам. Вследствие этого таксономические системы разных авторов часто противоречат друг другу.
В последние годы для уточнения существующих классификационных систем рода Abies и выявления филогенетических взаимосвязей видов применяются современные методы генетического анализа, основанные на изучении состава ДНК (Kormutak et al., 1993; Гончаренко, Падутов, 1995; Parducci, Szmidt, 1999; Isoda et al., 2000; Suyama et al., 2000; Xiang et al, 2004; Saito et al., 2005; Ziegenhagen et al., 2005; Семериков, Семерикова, 2007; Семерикова, Семериков, 2007; Jaramillo-Correa et al., 2008; Puizina et al., 2008 и др.). Однако эти работы ограничены, как правило, небольшим числом видов, результаты их часто противоречивы и требуют дальнейшей проверки.
В нашей стране чаще всего используется таксономическая система рода Abies, разработанная А.Е. Маценко (1963, 1964, 1968). В основу деления пихт на секции и видовые ряды положены форма и размер кроющих и семенных чешуи - наиболее важный и постоянный, с точки зрения автора, диагностический, а также филогенетический признак. А.Е. Маценко выделяет в роде Abies 4 секции: Bracteata (15 видов), Elate (8 видов), Abies (8 видов) и Piceaster (23 вида). Секция Bracteata является наиболее древней, представители ее характеризуются клиновидными, равносторонними семенными чешуями, постепенно переходящими в едва заметную ножку. Кроющие чешуи продолговатые, обратнояйцевидные, длиннее семенных. В состав секции Bracteata входят два видовых ряда, произрастающие в Китае: Fargesiana (5 видов) и Faxonianae (2 вида), и два видовых ряда Fraserianae и Religiosae, представленные б видами, растущими на тихоокеанском побережье Америки.
Виды секции Elate имеют семенные чешуи почковидной формы с ясно выраженной ножкой. Кроющие чешуи лопатчатые или яйцевидные, у более древних видов (серия Veitchianae) длиннее семенных, у эволюционно продвинутых (серия Nephrolepides) - короче. Восемь видов этой секции произрастают в Восточной Азии и на Дальнем Востоке.
Секция Abies содержит 3 видовых ряда: Firmae (1 вид из Японии), Nordmannianae (3 вида, встречающихся в Малой Азии и на Кавказе), Albae (4 вида из Средней и Южной Европы), представители которых имеют треугольные семенные чешуи с длинной ножкой и линейно-лопатчатые, более длинные и отогнутые наружу кроющие чешуи.
Секция Piceaster характеризуется крупными полулунными семенными и короткими кроющими чешуями. Представители серий Amabiles (2 вида), Lowianae (5 видов) и Arizonicae (2 вида) распространены в Северной Америке; серий Chensienses (3 вида) и Webbianae (2 вида) — в Южном Китае, Гималаях и Малой Азии; серии Pinsaro (3 вида) - в Южной Европе и Малой Азии; серий Homolepides (2 вида) и Mariesianae (1 вид) - в Восточной Азии и на Дальнем Востоке; серии Sibiricae (3 вида) - на северо-востоке европейской части России, в Сибири, Тянь-Шане, Тибете, Гималаях.
Особенности половой репродукции представителей рода Abies Mill...
Цитоэмбриологические исследования процессов половой репродукции имеют большое значение при изучении закономерностей формирования семян и естественного возобновления хвойных видов. Особенности микроспорогенеза и микрогаметогенеза среди представителей рода Abies изучены достаточно подробно у некоторых зарубежных или интродуцированных за рубежом видов: A. sachalinensis, A. homolepis, A. nobilis, А. х boresii-regis, A. alba, A. nordmanniana, A.pinsapo, A. concolor, A. cephalonica, A. amabilis, A. grandis, A. lasiocarpa и A. koreana (Sax, Sax, 1933; Mergen, Lester, 1961a; Kantor, Chira, 1965; Ritchie, 1966; Krugman et al., 1974; Owens, Molder, 1985).
Пихта сибирская, несмотря на свой обширный ареал, в этом отношении изучена слабо. Краткое описание отдельных стадий микроспорогенеза приведено в монографии Т.П. Некрасовой и А.П. Рябинкова (1978). Некоторые особенности мейоза при микроспорогенезе в условиях промышленного загрязнения описаны Л.П. Преснухиной и Н.А. Калашник (2003).
Генеративный цикл представителей рода Abies продолжается в течение 14 месяцев: с июля по сентябрь следующего года. Заложение зачатков микро-и макростробилов начинается в конце лета, дальнейшее развитие их, процессы опыления, оплодотворения и формирования семян происходят в течение весны - лета следующего года, и к осени семена созревают (Singh, 1978). Заложение микростробилов происходит в пазухах игл хвои и приурочено к периоду окончания роста побегов, который у пихты протекает в более сжатые сроки, чем у других хвойных. Характерной особенностью рода Abies является то, что макростробилы закладываются строго в тканях верхней стороны побега, а микростробилы - в тканях нижней стороны (Некрасова, 1970; Минина, Третьякова, 1983). Заложение инициальных бугорков генеративных органов обусловлено процессами детерминации в тканях апикальных меристем и сексуализацией примордиев, которые находятся под физиологическим контролем (Козубов, 1974).
Летом первого года происходит заложение примордиев генеративных почек, их дифференциация и начало микроспорогенеза. Вскоре после прекращения роста побега на нем становятся видны зачатки микростробилов в виде светло-зеленых бугорков, густо усеивающих нижнюю сторону побега и представляющих собой бугорки меристематической ткани, прикрытые покровными чешуйками (Третьякова, 1990). Каждый из них располагается в пазухе хвоинки. В течение июля примордии микростробилов активно растут, происходит их дифференциация. На флангах возникают группы активно делящихся клеток, которые формируют выступы — зачатки будущих микроспорофиллов.
Микростробилы состоят из многочисленных плоских микроспорофиллов, которые сидят на общем стержне, располагаясь по спирали. В середине августа на нижней стороне каждого микроспорофилла образуется два микроспорангия, заполненные однородной массой крупных клеток - спорогенной тканью, окруженной однослойным тапетумом, клетки которого доставляют питательный материал для развивающихся материнских іслеток микроспор (Owens, Molder, 1985). К концу августа микроспорангии увеличиваются в размерах, в них начинают дифференцироваться клетки первичного археспория. На этой стадии осеннее развитие мужских генеративных органов прекращается.
Дальнейшее развитие микростробилов происходит на следующий год. У A. grandis рост микростробилов возобновляется в середине февраля, у A. lasiocarpa и A. amabilis - в конце апреля (Owens, Molder, 1985). У A. sibirica весеннее развитие микростробилов начинается только во второй половине апреля, когда температура достигает довольно высоких дневных максимумов (Некрасова, Рябинков, 1978). Археспориальная ткань распадается на микроспороциты, в которых происходит мейоз. Продолжительность стадии первичного археспория значительно варьирует среди видов: у A. sachalinensis археспориальные клетки наблюдались до 25 января, у A. nobilis glauca - до 25 марта (Mergen, Lester, 1961а). У A. sibirica распад археспориальной ткани начинается в конце апреля (Некрасова, Рябинков, 1978).
После обособления клеток первичного археспория происходит их преобразование в округлые или овальные клетки с большим количеством крахмальных зерен - материнские клетки микроспор. За исключением зерен крахмала, эти клетки однородно окрашены в течение короткого периода, предшествующего появлению дифференцированного ядра, которое обозначает начало мейоза (Mergen, Lester, 1961а). Мейоз является одним из наиболее важных и сложно организованных клеточных процессов, протекающих в живых организмах. Мейоз представляет собой специальный тип деления клеток генеративной ткани, в результате которого обеспечивается редукция числа хромосом, необходимая для полового процесса, и рекомбинация генетического материала, полученного от разных родительских форм. Проведение цитологических исследований морфологии мейоза имеет большое значение для характеристики биологии вида, онтогенеза организма и генетического анализа.
Сроки прохождения мейоза могут варьировать в зависимости от температуры (Owens, Molder, 1985). У A. grandis мейоз заканчивается в начале марта, у A. lasiocarpa и A. amabilis — во второй половине апреля. В результате мейотического деления образуются тетрады микроспор, которые быстро распадаются, и формируется структура пыльцевых зерен.
Развитие мужского гаметофита начинается после кратковременного периода покоя. В результате двух последовательных митотических делений в пыльцевом зерне образуются две маленькие проталлиальные клетки и одна большая антеридиальная. Проталлиальные клетки быстро дегенерируют и превращаются в мертвые дисковидные образования, прилегающие к оболочке микроспоры. Антеридиальная клетка делится на маленькую генеративную клетку и более крупную клетку трубки, содержащую запас крахмала.
Процесс опыления проходит в конце мая - начале июня в зависимости от погодных условий. В это время пыльца у большинства представителей рода Abies четырехклеточная. У пихты сахалинской пыльца пятиклеточная за счет деления генеративной клетки, которая образует сперматогенную, или клетку-тело, и стерильную клетку, или клетку-ножку, способствующую высвобождению мужских гамет (Mergen, Lester, 1961а).
Качество формирующейся пыльцы является важным фактором семенной продуктивности. Наиболее важными показателями считаются жизнеспособность, отражающая процент проросших пыльцевых зерен, и их фертильность, характеризующая морфологическую полноценность зерна (Третьякова, 1990). Снижение качества пыльцы у пихты, как и у других хвойных, часто наблюдается в условиях техногенного загрязнения (Бессонова, 1992; Третьякова, Бажина, 1999).
Мейоз при микроспорогенезе у пихты сибирской и его особенности в разных условиях произрастания
Генеративный цикл пихты сибирской продолжается в течение 14 месяцев: с июля по сентябрь следующего года (Некрасова, Рябинков, 1978). Зачатки микростробилов на нижней стороне молодых побегов становятся видимыми в конце июня - начале июля. В августе в микроспорофиллах образуются микроспорангии, заполненные спорогенной тканью, их окружает однослойный тапетум, клетки которого доставляют питательный материал для развивающихся материнских клеток микроспор (Третьякова, 1990). К осени микроспорангии увеличиваются в размерах, в них начинают дифференцироваться крупные угловатые клетки с заметными ядрышками — первичная археспориальная ткань (рис. 3.1, а-б). На этой стадии осеннее развитие мужских генеративных органов прекращается. Весеннее развитие микростробилов пихты начинается в апреле; в это время они имеют вид овальных почек высотой 2-3 мм, покрытых чехлом засмоленных коричневых чешуи. В апреле в микроспорангиях начинается распад ткани первичного археспория на микроспороциты - материнские клетки микроспор. Это крупные клетки округлой формы с заметной структурной дифференциацией ядра, часто окруженного зоной прозрачной цитоплазмы. Диаметр микроспороцитов в 1,5-2,0 раза больше, чем у окружающих клеток тапетума, и в среднем составляет 55,8+1,2 мкм.
Первое деление мейоза имеет длительную профазу, продолжительность которой составляет около недели. Изучение ранних стадий профазы у пихты сибирской, как и у других хвойных, связано с трудностями из-за большой длины хромосом, перепутанных в плотный клубок. После непродолжительного периода предмейотической интерфазы хромосомы становятся видимыми (рис. 3.1, в). На ранних стадиях профазы I (лептотена и зиготена) хромосомы в виде плотного клубка располагаются на одной стороне ядра (рис. 3.1, г). В конце зиготены хромосомы распределяются по всему ядру, наблюдается сближение и начало конъюгации гомологичных хромосом. В клетках чаще всего наблюдается одно крупное ядрышко, если ядрышек несколько, то одно всегда крупнее и лучше прокрашено. В природных популяциях микроспороциты содержали до 4 ядрышек, в искусственном насаждении - до 5.
Завершение синапсиса и оформление дочерних хроматид происходит на стадии пахитены (рис. 3.1, д-ё). Конец пахитены - начало диплотены характеризуется диффузным состоянием, несмотря на продолжающуюся спирализацию хромосом (рис. 3.1, э/с). Хромосомы разрыхляются, приобретая вид «ламповых щеток», что связано с их возвратом к активной транскрипции. Это явление характерно для хромосом ооцитов животных, однако встречается у некоторых растений, в том числе и у хвойных (Mergen, Lester, 1961а; Owens, Molder, 1971; Буторина и др., 1982; Муратова, 1995в).
В конце диплотены начинается отталкивание гомологичных хромосом, хроматиды отдаляются друг от друга, сохраняя связь в нескольких точках -хиазмах (рис. 3.1, з). Конъюгация и образование хиазм обеспечивают обмен участками хроматид. Исследования показали, что в это время в микроспороцитах пихты сибирской исчезают ядрышки, хотя ранее считалось, что они сохраняются до конца диакинеза (Некрасова, Рябинков, 1978).
Все последующие стадии мейоза проходят в более быстром темпе. Дальнейшее сокращение длины хромосом происходит в диакинезе, достигая максимума в прометафазе I (рис. 3.1, и). На этих стадиях можно охарактеризовать морфологию бивалентов, которая определяется расположением и числом хиазм. У пихты сибирской насчитывается до 4 хиазм на бивалент (в среднем 2,6±0,1). Средняя частота хиазм на клетку составляет 31,2+0,9. По литературным данным у A. cephalonica и A. nordmanniana частота хиазм составляет в среднем 2,4 на бивалент (Sax, Sax, 1933).
В метафазе I биваленты выстраиваются на экваторе клетки, в анафазе I гомологичные хромосомы расходятся к противоположным полюсам (рис. 3.2, а-б). В телофазе I хромосомы находятся в конденсированном состоянии у полюсов (рис. 3.2, в). Первое деление мейоза завершается формированием двух дочерних ядер - диады (рис. 3.2, г).
Второму делению мейоза предшествует кратковременный период интеркинеза, в котором, в отличие от интерфазы, не происходит синтеза ДНК. Во втором делении сестринские хроматиды каждой хромосомы расходятся к полюсам, в результате формируется тетрада ядер, каждое из которых содержит гаплоидный набор хромосом (п=12). Основные стадии второго деления мейоза пихты сибирской представлены на рисунке 3.2 (д-е).
Мейоз завершается образованием тетрады гаплоидных ядер (рис. 3.2, з). Достаточно быстро формируются клеточные оболочки, и происходит обособление микроспор (рис. 3.2, и). Расположение микроспор в тетрадах чаще тетраэдрическое, иногда Т-образное. Спустя некоторое время общая оболочка тетрады теряет прочность, при надавливании на покровное стекло она легко повреждается, и микроспоры выходят наружу.
Исследования показали, что в целом мейоз у пихты сибирской протекает по классическому типу. В качестве особенностей, отличающих пихту сибирскую от других видов хвойных, можно отметить быстрое прохождение телофаз первого и второго делений, каждую из которых удалось наблюдать лишь у небольшого количества исследованных микроспороцитов. Кроме того, для пихты сибирской и, вероятно, всего рода Abies, характерна четко идентифицируемая профаза второго деления мейоза (рис. 3.2, д). У некоторых других видов хвойных, например, у сосны обыкновенной, данная стадия очень кратковременна и не выявляется, сразу начинается метафаза II (Буторинаи др., 1982; Муратова, 1995в).
Развитие микроспороцитов пихты сибирской происходит синхронно лишь на ранних стадиях профазы первого деления. Более поздние стадии, начиная с диакинеза, проходят асинхронно. Обычно в пределах микроспорангия наблюдаются клетки на разных стадиях первого или второго деления. Асинхронное развитие микроспороцитов наблюдалось и у других видов хвойных (Moir, Fox, 1975; Рождественский, 1974а; Мурая и др., 1988; Муратова, 1995в; Романова, Третьякова, 2005).
Кроме того, асинхронность развития микроспороцитов наблюдается и в пределах стробила: в микроспорангиях, расположенных в нижней части микростробила, мейоз протекает быстрее по сравнению с микроспорангиями верхней части. По мнению Т.П. Некрасовой и А.П. Рябинкова (1978), это может отражать неравные температурные и иные условия развития в разных микроспорангиях, а также различия в питании микростробилов. Интересно, что изучение микроспорогенеза у Picea sitchensis дало противоположный результат - мейоз в верхней части микростробила протекал быстрее, чем в нижней (Moir, Fox, 1975).
Еще одной особенностью мейоза у пихты является наличие микроспороцитов с различной ориентацией веретен во втором делении мейоза (рис. 3.3). По мнению некоторых авторов (Мок, Peloquin, 1975; Буторина и др., 1985а) в норме во втором делении мейоза веретена должны быть ориентированы по отношению друг к другу под углом 60. Параллельное расположение веретен может привести к слиянию групп хромосом на полюсах и формированию пыльцевых зерен с нередуцированным числом хромосом. Однако процесс слияния параллельных веретен в значительной степени зависит от влияния факторов среды (Veileux et al., 1982). В то же время другие исследователи (Абрамова, 1994) считают, что формирование «слитого» биполярного веретена происходит уже на стадии метафазы II и является первичным наблюдаемым эффектом мутации fs (fused spindles). Исследования В.Е. Подлисских с соавторами (1996, 2002) показали, что разделенные в пространстве мейоцита параллельные веретена являются вариантом нормы и наблюдаются довольно часто.
Сравнительный анализ морфологии хромосом пихты сибирской из разных местопроизрастаний
Для популяции из заповедника «Столбы» использовалось 22 пластинки с ЕЬ З00,0-350,0 мкм, из Енисейского и Козульского районов - 23 (1/=335,0-385,0 мкм) и 19 (ELa=305,0-355,0 мкм) пластинок соответственно. Полученные поликариограммы приведены на рисунке 4.3. Используемый метод позволил выделить в диплоидном наборе пихты сибирской четыре группы хромосомы со сходными параметрами. Длинные метацентрические хромосомы образуют одну группу, включающую I-VII пары. Абсолютная длина хромосом I-VII пар варьирует от 11,5 до 23,0 мкм, относительная длина - от 3,8 до 6,1%, центромерный индекс - от 40,0 до 50,0 %. SO Как правило, хромосомы VI-VII пар более короткие и симметричные по сравнению с хромосомами I-V пар, однако достоверно идентифицировать отдельные пары гомологов в данной группе не представляется возможным. Хромосомы VIII-XII пар неравноплечие и более короткие. Согласно рекомендациям В.Г. Грифа и Н.Д. Агаповой (1986), хромосомы данной группы идентифицировали по значению центромерного индекса как субметацентрические и интерцентрические. Отдельно были выделены VIII пара субметацентриков и IX пара интерцентриков; субметацентрические хромосомы Х-ХП пар образуют одну группу со сходными параметрами. Средние значения морфометрических параметров выделенных групп хромосом для каждого изученного местопроизрастания приведены в таблице 4.5. Различия по абсолютной длине и центромерному индексу между данными группами хромосом статистически достоверны (табл. 4.6). Кариотип пихты сибирской, систематизированный по данным поликариограммного анализа, представлен на рисунке 4.4.
Кариотип пихты сибирской, систематизированный по данным поликариограммного анализа. I-XII - номера хромосом. Таблица 4.5. Средние значения морфометрических параметров хромосом пихты сибирской из разных местопроизрастаний 4.3. Нуклеолярные районы хромосом и анализ ядрышек Дополнительным маркером для идентификации отдельных пар гомологичных хромосом служат вторичные перетяжки. Хромосомы пихты сибирской, как и других видов хвойных, характеризуются большим количеством вторичных перетяжек (Муратова, 1995а; Муратова, Матвеева, 1996; Седельникова, Пименов, 2005). Проведенные исследования показали, что наименьшее число хромосом с вторичными перетяжками наблюдалось в кариотипе пихты сибирской из окрестностей метеостанции «Оленья речка» - от 3 до 8, в среднем 5,1 ±0,2 хромосомы на метафазнуїо пластинку. В кариотипах пихты из равнинных местопроизрастаний (д. Плотбище и ст. Веселая) также наблюдалось не более 8 таких хромосом, в среднем 5,4±0,1 и 5,7±0,2 хромосом 100 соответственно. От 3 до 10 хромосом с вторичными перетяжками содержали метафазные пластинки из заповедника «Столбы» (в среднем 6,1±0,3) и окрестностях пос. Танзыбей (в среднем 6,4±0,3). Таблица 4.6. Достоверность различий между средними значениями морфометрических параметров групп хромосом пихты сибирской Район произрастания Сравниваемые признаки tcp для сравниваемых групп хромосом Фенотипическая изменчивость района локализации вторичной перетяжки довольно высока. Хромосома может содержать одну или несколько вторичных перетяжек, локализованных в разных районах плеча. Морфометрический анализ позволил выявить наиболее часто встречающиеся вторичные перетяжки и идентифицировать с их помощью отдельные пары гомологичных хромосом (табл. 4.7). I и II пары метацентрических хромосом, как правило, содержат вторичную перетяжку в дистальном районе более длинного плеча. Хромосомы III пары в кариотипах пихты из большинства местопроизрастаний характеризуются наличием постоянной вторичной перетяжки в медиальном районе плеча. Для IV пары метацентриков характерно наличие двух вторичных перетяжек, локализованных на разных плечах хромосомы. Частота встречаемости таких хромосом достаточно низкая - 12,2-28,9 % изученных метафазных пластинок, но наблюдаются они в кариотипах пихты из всех местопроизрастаний. Еще одна постоянная вторичная перетяжка расположена в дистальном районе более длинного плеча VI пары хромосом. Описанные выше вторичные перетяжки наблюдаются в кариотипах пихты из большинства исследованных местопроизрастаний. Кроме того, есть перетяжки, характерные для кариотипа из определенного района. Так, вторичная перетяжка в проксимальном районе плеча V пары хромосом наблюдается в кариотипе пихты из окрестностей пос. Танзыбей (табл. 4.7). В кариотипе пихты из Козульского района VII пара хромосом содержит непостоянную вторичную перетяжку в дистальном районе длинного плеча. На субметацентрических хромосомах также могут наблюдаться вторичные перетяжки, хотя частота их встречаемости достаточно низкая (табл. 4.7). Наиболее часто они отмечаются в кариотипе пихты из горных местопроизрастаний заповедника «Столбы» и Западного Саяна.
