Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1. Ботаническая классификация представителей рода Rhododendron 7
1.2. Особенности распространения и экологии представителей рода Rhododendron 9
1.3. История интродукции видов рода Rhododendron 13
1.4. Использование рододендронов в различных областях народного хозяйства 19
1.5. Микроклональное размножение растений: модели, основные факторы, влияющие на микроклональное размножение 21
1.6. Классификация фенольных соединений и их функции в растениях 36
Глава 2. Материалы, методы и объекты исследований 49
Глава 3. Экспериментальная часть 69
3.1. Изучение морфологических особенностей вегетативных почек модельных видов рододендрона 69
3.2. Оптимизация методики клонального микроразмножения представителей рода Rhododendron 87
3.3. Изучение содержания фенольных соединений у представителей рода Rhododendron 105
Выводы 115
Список литературы 116
- Ботаническая классификация представителей рода Rhododendron
- Использование рододендронов в различных областях народного хозяйства
- Изучение морфологических особенностей вегетативных почек модельных видов рододендрона
- Оптимизация методики клонального микроразмножения представителей рода Rhododendron
Введение к работе
Род Rhododendron L. - самый крупный в семействе Ericaceae - насчитывает более 1300 видов. Рододендроны характеризуются большим видовым разнообразием, множеством экотипов и широким естественным ареалом. Они представлены вечнозелеными, полувечнозелеными и листопадными видами, значительно отличающимися по морфофизиологическим и биохимическим характеристикам (Кондратович, 1981). Рододендроны - одна из интереснейших групп растений, пользующихся заслуженной популярностью во всем мире благодаря высоким декоративным качествам. Их также можно отнести к ресурсным растениям, так как они являются источниками биологически активных веществ, что обусловлено их высокой биосинтетической активностью.
Метод клонального микроразмножения растений, имеющий значительные преимущества перед традиционными способами вегетативного размножения, приобретает все большее значение в современных биотехнологических исследованиях. Поэтому для ценных видов все более актуальна разработка и оптимизация методик клонального микроразмножения. При этом важное значение имеет предварительная оценка регенерационного потенциала in vitro на основе морфологического анализа вегетативных почек.
Метод клонального микроразмножения базируется не только на процессах морфогенеза и регенерации в условиях in vitro, но и на структурно-физиологической адаптации регенерантов. При этом большую роль играют фенольные соединения - низкомолекулярные продукты вторичного метаболизма, образующиеся практически во всех клетках растений и защищающие их от стрессовых воздействий (Запрометов, 1993).
Поэтому установление особенностей образования фенольных соединений в листьях интродуцированных видов рода Rhododendron в разные периоды вегетации необходимо для выявления оптимальных сроков изоляции эксплантов.
Таким образом, оптимизация методики клонального микроразмножения и изучение особенностей накопления фенольных соединений в растениях рода Rhododendron весьма актуальны.
Цель исследований - комплексное изучение биологических особенностей размножения и сохранение некоторых видов рода Rhododendron ex situ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. выявить зависимость между морфологическими особенностями вегетативных почек разных видов рододендрона и их регенерационным потенциалом;
2. изучить влияние типа экспланта и времени его изоляции на регенерационную способность;
3. усовершенствовать методику клонального микроразмножения модельных видов рододендрона;
4. исследовать динамику накопления фенольных соединений в листьях однолетних побегов разных видов рододендрона на протяжении вегетации;
5. сравнить биосинтетическую способность к образованию фенольных соединений интактных растений рододендрона и микропобегов, культивируемых в условиях in vitro. • Научная новизна. Впервые предложен метод предварительной оценки регенерационного потенциала in vitro на основе морфологического анализа вегетативных почек представителей рода Rhododendron.
Выявлены общие закономерности и специфические особенности культивирования in vitro вечнозеленых, полувечнозеленых и листопадных видов рододендрона.
Впервые установлены особенности образования фенольных соединений в листьях интродуцированных видов рододендрона в разные периоды вегетации, а также микропобегах в процессе культивирования in Впервые на основе исследования содержания фенольных соединений установлены оптимальные сроки изоляции эксплантов разных видов рода Rhododendron.
Практическая ценность работы и реализация результатов исследований. Предложенный метод предварительной оценки регенерационного потенциала, основанный на особенностях морфологии вегетативных почек рододендрона позволяет прогнозировать потенциальную способность к размножению в культуре in vitro.
Оптимизирована методика клонального микроразмножения представителей рода Rhododendron на основе прямой регенерации растений, которая позволит получать выровненный посадочный материал высоко декоративных и зимостойких видов, форм и сортов этой культуры для заложения маточников.
Создан генетический банк представителей рода Rhododendron in vitro, включающий 20 образцов.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены на 9 Российских и Международных конференциях: Международной конференции по дендрологии, посвященной 90-летию П.И. Лапина (Москва, 1999); на конференции, посвященной 40-летию ботанического сада им. И. Косенко (Краснодар, 1999); на Конференции молодых ученых МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, 2000); на IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и. перспективы их использования» (Москва - Пущино, 2000); на Всероссийской конференции по нетрадиционным плодовым, ягодным и декоративным культурам (Мичуринск, - 2003); на Международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004); на IX и X конференциях «Проблемы озеленения крупных городов» (Москва; декабрь 2005, март 2007), на I и II Всероссийских конференциях «Биотехнология как инструмент сохранения биоразнообразия растительного мира» (Волгоград; 2006, 2008); на Международной конференции, посвященной 20-летию экспозиции «Японский сад» в ГБС РАН (Москва, 2007). Научные разработки экспонировались на различных выставках, в том числе: на Международной флористической выставке «Flowerex» (Москва; 2006, 2007), на Международной выставке «Мир биотехнологии - 2007», на XI Международной выставке «Цветы - 2007»; на II Фестивале науки в г.
Москве, (МГУ, 2007).
Ботаническая классификация представителей рода Rhododendron
Род Rhododendron — самый крупный в семействе Ericaceae DC. Он насчитывает свыше 1300 видов и около 12000 сортов (Кондратович, 1981а).
Впервые родовое название Rhododendron было упомянуто в книге «De Plantis Libri XVI» (1583 г.) и связано только с природным видом - Rh. ferrugineam L. В XVII в. был описан второй вид этого рода - Rh. hirsutum L.
Первую попытку систематизировать рододендроны сделал в 1753 г. К. Линней, дав подробное описание 9 видов (3 вечнозеленых и 6 листопадных) в книге «Species Plantarum». Причем вечнозеленые виды он относил к роду Rhododendron, а листопадные - к роду Azalea L. Позже - в 1813 г. -А. procumbens L. была выделена в самостоятельный род Loiselenria Desv. Классификация, предложенная Линнеем, в широком применении просуществовала до второй половины XVIII в.
Впервые И. Гмелин объединил рода Rhododendron и Azalea, основываясь на отсутствии между ними существенных биоморфологических различий. В 1807г. Солбери упоминает только род Rhododendron. Подобной классификации придерживались И. Ремер, И. Шультес, Декандоль, Э. Шпах.
В 1822 г. Дж. Дон предлагает новую ботаническую систему, р восстанавливая род Azalea, к которому относит A. procumbens. При этом остальные виды, входившие по классификации Линнея в род Azalea, он оставляет в составе рода Rhododendron.
В 1834 г. Э. Эндлихер вновь объединяет рода Azalea и Rhododendron, что наиболее четко аргументирует Г. Дон в работе «General System of Gardening and Botany» (1834 г.). Начиная с этого времени, листопадные и вечнозеленые виды рододендрона относят к роду Rhododendron. Однако в мировой садоводческой практике до сих пор под рододендронами понимают только вечнозеленые виды, а листопадные называют азалиями.
Единой ботанической классификации рода Rhododendron до сих пор не существует. В настоящее время широко используют 2 основные ботанические классификации этого таксона.
Система А. Бальфура разработанная в 1920-1930 гг., согласно которой все виды рододендронов впервые разделены по морфологическим признакам (форма и размеры листовой пластинки, окраска цветков, размеры чашечки, наличие-отсутствие опушения различных частей растения и др.) на 44 серии. В 1930 г. на основе работ А. Бальфура Дж. Стивенсон (1947) формулирует новую ботаническую классификацию рода Rhododendron в книге «The species of Rhododendron», где дано подробное описание всех известных видов рододендрона, предусматривающее их деление на 43 серии, а некоторые (наиболее крупные из них) - на подсерии. Система Стивенсона широко известна как «английская система классификации рододендронов». Она отличается ясностью и удобством в использовании, но имеет ряд недостатков: объем серий неравнозначен, некоторые виды из разных подродов объединены в одну серию и др.
Более детальная и точная ботаническая классификация рода Rhododendron разработана А. Редером (1956) на основе системы Стивенсона. Автор выделяет в составе рода 4 подрода, разделенные на секции, подсекции и серии. Позднее классификация Редера была переработана и дополнена. X. Слеймером, И. Коуэном (1952). Согласно этой классификации в составе рода Rhododendron сохраняется четырехступенчатое соподчинение таксонов. При этом серии в ней соответствуют сериям системы Стивенсона. Система Слеймера, Коуэна широко применяется в современной систематике.
А. Хофф (1954) разработана классификация рододендронов на основе анатомо-морфологического анализа с учетом изучения ареалов видов рода Rhododendron. При этом одним из основных признаков автор указывает типы опушения различных частей растений. Эта система не получила широкого распространения, хотя и признана удобной для практического использования. Некоторые справочники по декоративному садоводству составлены именно на ее основе.
Существуют также ботанические классификации рододендронов, созданные в середине XX в., согласно которым род Rhododendron разделен на подроды без выделения секций (Флора СССР, 1952; Деревья и кустарники СССР, 1960). 1.2. Особенности распространения и экологии представителей рода Rhododendron
Ареалы видов рода Rhododendron В природе представители рода Rhododendron распространены в северном полушарии в основном в зонах умеренного климата. Центром происхождения большинства известных представителей этого рода является Восточная Азия. В Европе встречается 10 видов. На территории Северной Америки распространено 29 видов рододендрона, произрастающих в основном по побережью Тихого и Атлантического океанов. На двух континентах - Южная Америка и Африка - рододендроны не встречаются (Флора СССР, 1952; Berg, 1952; Деревья и кустарники СССР, 1960; Bowers, 1960; Berg, Heft, 1969; Александрова, 1975; Кондратович, 19816).
Принято выделять 7 основных областей естественного распространения видов рода Rhododendron (Berg, Krussmann, 1951): 1) Гималаи, Западный и Центральный Китай; 2) прибрежные районы Китая; 3) Северо-восточная Азия; 4) Япония; 5) Малайский архипелаг; 6) Европа; 7) Северная Америка.
Климатические условия территорий Гималаев, Западного и Центрального Китая определяются муссонами, обуславливающими повышенный уровень влажности воздуха. Изучение природной флоры этой области было начато в 1847 г. Дж. Гукером. Было открыто и подробно описано более 40 местных видов рододендрона. При этом отмечена четко выраженная закономерность: виды рода Rhododendron встречаются в интервале высот от 1800 до 4800 м над уровнем моря. В лесах до высоты 2000 м над уровнем моря встречаются эпифитные виды рододендрона. На высоте 1800-2900 м в дубовых и хвойных лесах рододендроны образуют плотные заросли; на высоте 2500-3000 м вместе с листопадными кустарниками произрастают древовидные рододендроны высотой 10-15 м; в зоне низких температур — 3700-4000 м в хвойных лесах рододендроны часто образуют сплошной древостой (некоторые виды - Rh. giganteum Forrest -достигают высоты 30 м); в альпийской зоне (выше 4000 м) рододендроны доминируют, образуя плотные кустарниковые заросли (Кондратович, 1981а).
Использование рододендронов в различных областях народного хозяйства
Представители рода Rhododendron применяются в различных областях народного хозяйства. Они являются лекарственными, эфиромасличными, дубильными растениями (Кондратович, 1981а; Александрова, 2007). Кроме того, рододендроны используются в народной медицине. Настойки и вытяжки из их листьев характеризуются антибактериальными и диуретическими свойствами, оказывают антигипоксическое и противосудорожное действие, проявляют фунгистатическую активность (Аболь, 1956). Настой из листьев рододендрона положительно действует на сердечно-сосудистую систему, повышая тонус сердечной мышцы, увеличивая амплитуду сердечных сокращений, снижая артериальное и венозное давление, но, не изменяя скорости кровотока, т. е. действует по типу сердечных гликозидов Digitalis sp. По своему действию они могут заменить Adonis vernalis L. и Strophanthiis kombe Oliv. (Российский, 1954). =? Комбинированный препарат состава: ацетиландромедол, алкалоиды раувольфии, флавоноиды боярышника оказывает положительное влияние на больных эссенциальной гипертонией (Оганесян, 1966). Из Rh. ponticum и Rh. caiicasicwn получены суммарные препараты флавоноидов, характеризующиеся Р-витаминной активностью (Шварцман, 1941). Листья различных видов рододендрона содержат значительное количество (до 221 мг/г сухой массы) аскорбиновой кислоты. Причем, содержание витамина С в листьях рододендронов в течение вегетационного периода меняется: максимальное количество наблюдается в летние месяцы - июль, август.
Настои, экстракты, настойки из рододендронов оказывают губительное влияние на туберкулезную палочку, брюшнотифозную бациллу, дифтерийную палочку, вирус гриппа, стафилококки и стрептококки (Роллов, 1908; Российский, 1955).
Установлено, что некоторые виды рододендрона содержат сильнодействующие глюкозиды (Энциклопедический словарь ..., 1959; Ботяновский, 1981). В листьях рододендронов также содержится большое количество эфирных масел, фенольных кислот, флавоноидов, тритерпиноидов, кахетинов, флавонолов. Они могут служить сырьем для производства биофлавоноидов (Грязнова, Подколзина, 1957; Зорикова, 1971). В гомеопатии препараты из рододендронов используются при отравлении ртутью, для лечения слизистых оболочек, от головной боли и при лечении многих других заболеваниях (Землинский, 1951; Белова, Юшатова, 1968).
Многие рододендроны (например, Rh. luteum Sweet, Rh. ponticum L.) содержат в цветках, листьях и молодых побегах от 0,05 до 0,35% эфирных масел. Эфирное масло, полученное из цветков рододендрона желтого, применяется в парфюмерной промышленности при производстве высококачественных сортов духов (Волынец, Прохорчик; 1983).
Многие рододендроны характеризуются фитонцидными и инсектицидными свойствами (Медведева, Клец, 1957; Минаева, 1960; Александрова, 1970).
Рододендроны используются и как технические растения, являясь перспективным сырьем в ряде производств. Виды рододендрона флоры Кавказа относятся к хорошим дубителям. Например, Rh ponticum содержит в коре и листьях 8-12%, a Rh. luteum - 7-18% дубильных веществ... Практически все части растений рододендронов содержат дубильные вещества группы пирокатехинов. В листьях и побегах некоторых рододендронов также содержатся танины (Грязнова, Подколзина, 1957; Первухин, 1963).
Некоторые виды рододендронов (например, Rh. ponticum) относятся к. породам с ценной древесиной (Пояркова, 1952).
Кроме того, рододендроны имеют и другие хозяйственно-полезные свойства. Rh. caucasicum Pall, считается хорошим медоносом, а в горных условиях на крутых склонах является почвоукрепляющими растениями (Полетико, 1960).
Однако, самая большая ценность рододендронов - в их высокой декоративности. Особенно эффектны они во время цветения, которое происходит до или после распускания листьев, иногда одновременно с ним. Да и сами листья рододендронов очень декоративны: у вечнозеленых - круглый год темно-зеленые или оливково-зеленые, у листопадных - осенью, когда меняют окраску на желтую или пурпурную и становятся неотразимыми. По многообразию форм и окраске цветков и листьев, по декоративности летом и зимой они не имеют себе равных среди красивоцветущих кустарников. Они восхищают белыми, розовыми, красными, лиловыми, фиолетовыми цветками, нередко собранными в крупные соцветия, напоминающие букет, состоящий из 20-30 цветков.
Растения разных видов и сортов рододендронов цветут в разные сроки и при удачном подборе их в насаждениях можно в течение трех месяцев — с " середины апреля до середины июля любоваться разноцветным ярко и пышно цветущим садом. Еще одна важная особенность рододендрона, позволяющая использовать его в озеленении крупных промышленных городов - это его газо - и дымоустойчивость (Александрова, 1975).
Изучение морфологических особенностей вегетативных почек модельных видов рододендрона
В связи с тем, что у древесных растений и кустарников в качестве эксплантов обычно используют апикальную меристему вегетативных органов, одной из задач наших исследований являлось изучение морфологических особенностей вегетативных почек различных видов рододендрона, которыми определяется реализация морфогенетического потенциала и, возможно, коэффициент размножения в условиях in vitro.
Для представителей рода Rhododendron L. характерно наличие почек двух типов: листовых и цветочных. Листовые почки закладываются на побегах весеннего роста в пазухах листьев, реже - на верхушке. Цветочные же почки формируются на верхушке побега, реже - в пазухах 2-3 верхних листьев. Почки разных типов отличаются между собой по форме, размерам, количеству кроющих чешуи, окраске и опушению. Заложение кроющих чешуи, листьев, соцветий, цветков и их частей в почках происходит акропетально. Число, форма и особенности анатомического строения кроющих чешуи почек зависит от биологических и экологических особенностей вида.
Начиная с первой декады мая, у основания конуса нарастания стебля закладываются бугорки будущих почечных чешуи. Затем они быстро растут, дугообразно изгибаясь и черепитчато налегая друг на друга. Вследствие неравномерного роста тканей, на обеих сторонах чешуи происходит загиб и вегетативная почка принимает конусообразную форму (рис. 1,2). Al A2 Рис.1. Вегетативные почки некоторых видов рододендрона. Условные обозначения: А -вечнозеленые виды: Al -Rh.brachycarpum, А2 -Rh.catawbiense Б - листопадные виды: Б - Rh.luteum. 1 - терминальная почка, 2 - аксиллярная почка. 2 Рис.2. Продольный разрез вегетативных почек рододендрона. Условные обозначения: 1 -терминальная почка, 2 - аксиллярная почка. В конце мая у основания конуса нарастания вновь образуются боковые бугорки, из которых формируются в акропетальной последовательности примордиальные листья.
К концу июня в листовых почках образуются молодые листья имеющие строение, свойственное взрослому листу, характерное для каждого вида. Черешок полностью формируется при выходе листа из почки. Наружные чешуи у всех видов треугольные, кожистые, внутренние - более длинные, мягкие.
Вегетативные почки исследуемых видов отличаются друг от друга по размерам, форме, опушенности. Особенно это различие проявляется между почками вечнозеленых и листопадных видов рододендрона.
Листовые почки вечнозеленых рододендронов конусовидные, зеленые, голые, реже опушенные (у Rh. smirnowii), в среднем 14-16 мм длиной и 6-8 мм шириной, имеют 11-20 черепитчато-налегающих чешуи; листоположение в почке отвернутое (рис.3,4). На укороченной оси почки наблюдается формирование 6-8 зачаточных листьев длиной до 2 мм, которые имеют форму и основную структуру взрослого листа.
Вегетативные почки листопадных рододендронов продолговатые или продолговато-яйцевидные по форме, значительно мельче вышеописанных, длина их колеблется от 3-4 мм до 7-8 мм, а ширина - от 1,5-2 до 3-3,5 мм. Цвет варьирует от желтовато-зеленых, серовато-зеленых до зеленовато-бурых и бурых. Как правило, голые, закрыты 11-15-ю реснитчатыми по краю чешуями, расположенных на укороченном побеге, на верхушке которого находятся от 4-7 до 9-13 зачатков листьев. В пазухах молодых еще. не развернувшихся листьев имеются зачатки пазушных почек. В пазухе взрослого листа расположены пазушные почки подобного строения.
В то же время, существуют особенности, общие для всех видов рододендрона. Развитие почек видов рода Rhododendron по длине побега происходит базипетально. В связи с этой особенностью, почки, расположенные в пазухах нижних листьев, как правило, остаются спящими. Эти почки могут находиться в состоянии покоя неопределённо долгое время, иногда много лет. Развитие их может быть вызвано искусственным удалением или повреждением вышерасположенных почек или другими факторами внешней среды.
Кроме описанных выше вегетативных почек, в пазухе каждого листа есть пазушные почки, построенные по типу листовых почек, правда, значительно меньшие по размерам (рис.2). Чаще всего эти почки пребывают некоторое время в состоянии покоя.
Снаружи почку покрывают от 8 до 18 жестких, очень клейких, с заостренной верхушкой чешуек. В центре почки находится конус нарастания. Он прикрыт двумя маленькими зачатками листьев. Из листовой верхушечной почки развивается олиственный побег.
- Рост побегов у рододендронов протекает неравномерно. Активность роста приурочена к началу весеннего потепления, продолжая оставаться в течение некоторого времени высокой, скорость роста затем постепенно уменьшается, и, наконец, рост полностью приостанавливается.
Анатомо-морфологические исследования и фенологические наблюдения показали, что почки нарастания у всех изученных нами видов рододендронов закладываются на побегах весеннего роста. В почке формируются кроющие чешуи и листья, в пазухах последних закладываются внучатые почки. На следующий год из этих почек формируется вегетативный побег, на верхушке которого развивается цветочная почка. В конце цветения трогаются в рост почки нарастания, повторяя описанный ход развития. Таким образом, развитие почек у рододендронов идет по дициклическому типу.
У рододендронов в условиях г. Москвы рост побегов заканчивается примерно к середине июля. К этому времени аксиллярные почки содержат 2 - 6 (в зависимости от вида) ясно различимых зачатков листьев, в пазухах которых заметны почки второго порядка. В течение лета число зачатков листьев увеличивается, и к осени на побегах возобновления терминальная вегетативная почка при моноподиальном нарастании содержит от 3 до 10 (в зависимости от вида) ясно различимых зачатков листьев.
Формирование почек — важный этап в развитии растений. В период интенсивного роста побегов и листьев в пазухах последних образуются бугорки будущих вегетативных почек. Они закладываются на побегах весеннего роста. После окончания роста на верхушке побега в течение 1,5-3,0 месяцев закладывается генеративная почка, реже она формируется в пазухах 2—3 верхних листьев.
Оптимизация методики клонального микроразмножения представителей рода Rhododendron
При изучении особенностей культивирования in vitro различных видов рода Rhododendron выявлены факторы, влияющие на эффективность регенерации при микроклональном размножении. Реализация морфогенетического потенциала культивируемых тканей этого таксона обусловлена видовыми особенностями, происхождением, сроками изоляции экспланта, составом питательной среды и условиями культивирования.
Влияние типа экспланта на регенерационный потенциал в культуре in vitro. Большое значение для разработки методики клонального микроразмножения имеет тип экспланта, его размер и сроки изоляции с донорного растения. Первым этапом этой работы для любого таксона является выбор экспланта и подбор режима стерилизации. Для индукции культуры использовали терминальные и латеральные почки одревесневших побегов и побегов текущего года, а также верхушки стерильных проростков. Оптимальным режимом для стерилизации почек является использование сулемы (1%) в экспозиции 10-12 мин. и лизоформина (3%) в экспозиции 13-15 мин., а для семян большинства исследуемых видов - 50%-ного раствора гипохлорита натрия в экспозиции 15-7 мин. Причем, для семян лесного типа необходимо 17мин., а для семян альпийского типа достаточно 15 мин.
На первых этапах культивирования модельных видов рододендрона наблюдали потемнение среды, большое количество окисленных эксплантов, а, впоследствии, их гибель. Это объясняется негативным влиянием поликонденсации фенолов на рост и развитие изолированных тканей, синтез которых в клетках увеличивается при механических повреждениях растений (Упадышев, 2008). В ходе исследования выяснено, что процент окисленных эксплантов у вечнозеленых рододендронов выше, чем у листопадных.
В этом случае органогенез наблюдали у 58-72 % эксплантов, в то время как при использовании выделенных меристем (размером 0,2-0,5 мм) - только у 9—16 %. Это, вероятно, связано с наличием запаса энергопластических веществ в тканях побега, способствующих активному делению и росту клеток и тканей in vitro.
Исследования по определению регенерационного потенциала различных типов эксплантов (апикальные и латеральные почки одревесневших и не одревесневших побегов, а также верхушки стерильных проростков), проведенные на четырех модельных видах (Rh. ledebourii, Rh. roseum, Rh. japonicum, Rh. catawbiense), позволили установить зависимость коэффициента размножения рододендронов in vitro от типа первичного экспланта (табл. 8).
Самым высоким регенерационным потенциалом характеризовались экспланты, изолированные из стерильных проростков. Наибольшее число микропобегов этих эксплантов, получено у Rh. roseum (14,2) и Rh. japonicum (13,4). Наименьшей регенерационной способностью характеризовались экспланты Rh. catawbiense (5,7). У всех исследуемых видов рододендрона экспланты, выделенные из не одревесневших побегов текущего года, характеризовались меньшими показателями коэффициента размножения. Это может быть объяснено тем, что у эксплантов, выделенных из стерильных проростков синтезируется больше эндогенных фитогормонов, что в дальнейшем способствует дедифференциации клеточных структур, их активному делению и росту, а затем, и образованию большего числа микропобегов.
В дисперсионный анализ не были включены показатели коэффициентов размножения у эксплантов, выделенных из одревесневших побегов, так как процесса регенерации у них не наблюдали.
Таким образом, в качестве первичных эксплантов у рододендрона наиболее эффективно использовать верхушки стерильных проростков, а также апикальные почки побегов текущего года.
Морфолого-анатомический анализ эксплантов показал, что образующиеся в данном случае побеги являются по происхождению аксиллярными, так как развиваются из уже существующих пазушных меристем растений. Сходные результаты получены ранее для гладиолусов (Чурикова, 1993) и сирени (Молканова и др., 2002).
На основании морфологического изучения показано, что на оси побега проростка в базальной части происходит ветвление, приводящее к образованию множества почек (побегов), соединенных между собой посредством обычных проводящих элементов. В то же время может происходить и заложение дополнительных почек, из которых развиваются адвентивные побеги. Эти почки, а затем и развивающиеся из них микропобеги образуют конгломерат, характерный, прежде всего, для листопадных видов рододендрона.
Вероятно, это связано с более высокой регенерационной способностью листопадных рододендронов, а также более раннему кущению их сеянцев, которое наблюдается при семенном размножении in vivo. Так, например, у Rh. hiteum, в отличие от вечнозеленых видов рододендрона, уже на второй или третий год из спящих почек прироста первого года появляется несколько побегов второго порядка (Александрова, 1966). У Rh. japonicum на второй год одновременно с ростом главного побега наблюдается рост пазушных почек у его основания, которые образуют боковые побеги. Вечнозеленые рододендроны отличаются от листопадных более длительным ювенильным периодом в онтогенезе (растения). Кущение у них происходит лишь на 5-7 год.
Основной метод, используемый при размножении большинства таксонов древесных растений - активация развития пазушных меристем. Он считается наиболее надежным для сохранения генетической стабильности размножаемых форм (Высоцкий, 1999).
Многими исследователями показано определяющее влияние физиологически активных веществ на морфогенез in vitro (Высоцкий, 1998; Игнатова, 2004; Долгих, 2005).
Дальнейшие исследования направлены на возможность повышения коэффициента размножения у некоторых видов рододендрона. Для поддержания устойчиво пролиферирующей культуры in vitro весьма существенным является правильный подбор и оптимальное соотношение стимуляторов роста (цитокининов и ауксинов).
Для процессов клеточного деления, дифференциации в культуре клеток и тканей, по мнению многих исследователей, для некоторых таксонов обязательным условием является присутствие в среде как ауксина, так и цитокинина одновременно (Коротков, 2008; Малаева, 2008). Соотношение гормонов в питательной среде для каждого вида устанавливается экспериментальным путем.
Для увеличения коэффициента размножения и получения выровненных микропобегов, способных к ризогенезу, было проведено исследование по подбору оптимальных концентраций регуляторов роста (табл. 9, рис. 10).
. Самый высокий коэффициент размножения у исследуемых видов рододендрона получен при использовании питательной среды Андерсона, дополненной зеатином. В этом случае происходило образование хорошо сформированных (выровненных) микропобегов. Оптимальными концентрациями зеатина оказались 1,0 — 1,5 мг/л, на которых коэффициент размножения составил соответственно у Rh. ledebourii 19,8 и 16,2; у Rh. japoniciim 16,1 и 14,4.
