Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 10
1.1. Актуальность 10
1.2. Определение и патофизиология розацеа 11
1.3. Клиническая классификация розацеа 20
1.4. Диагностика розацеа 23
1.5. Лечение и профилактика розацеа 23
ГЛАВА II Материалы и методы 30
2.1. Критерии включения и исключения больных 30
2.2. Общая характеристика больных розацеа 31
2.3. Разделение на группы больных 36
2.4. Методы исследования 37
2.4.1. Дерматологический осмотр 37
2.4.2. Оценка антиоксидантной системы 39
2.4.3. Исследование концентрации метаболитов оксида азота 39
2.4.4. Определение уровня ILip и IL6 в сыворотке крови 41
2.4.5. Статистическая обработка результатов исследования 42
2.5. Описание исследуемых препаратов 42
ГЛАВА 3. Собственные клинико-лабораторные исследования 49
3.1. Клиническая характеристика больных до лечения 49
3.1.1. Оценка субъективных симптомов и степени тяжести розацеа 49
3.1.2. Оценка антиоксидантного статуса у больных розацеа до лечения 52
3.1.3. Общий уровень концентрации метаболитов азота в крови больных до лечения 54
3.1.4. Определение уровня цитокинов в крови больных до лечения 58
3.2. Результаты лечения больных 60
3.2.1. Динамика клинических симптомов розацеа в результате терапии 60
3.2.2. Динамика показателей антиоксидантного статуса у больных в результате лечения 64
3.2.3. Динамика продукции оксида азота у больных в результате лечения 66
3.2.4. Динамика уровня цитокинов у больных в результате лечения 67
Заключение 70
Выводы 80
Практические рекомендации 82
Список используемой литературы 83
- Определение и патофизиология розацеа
- Исследование концентрации метаболитов оксида азота
- Общий уровень концентрации метаболитов азота в крови больных до лечения
- Динамика показателей антиоксидантного статуса у больных в результате лечения
Введение к работе
Розацеа представляет собой хронический воспалительный дерматоз поражающий преимущественно кожу лица и характеризующийся возникновением транзиторной либо стойкой эритемы и телеангиэктазий. В период обострения заболевания могут наблюдаться дополнительные клинические проявления такие как, отек, папулопустулёзные элементы и узлы (Адаскевич В.П., 2003; Tanzi E.L., Weinberg J.M., 2001; Wilkin J. et al., 2004).
Розацеа диагностируется преимущественно у лиц европейского происхождения, реже – у представителей негроидной расы и коренных жителей Америки. По статистическим данным, мужчины страдают этим заболеванием в три раза реже, чем женщины. Однако розацеа у мужчин протекает значительно тяжелее, что проявляется преобладанием пролиферативных процессов, которые характеризуются гиперплазией сальных желёз и, как следствие, формированием фим (Plevig G., Kligman A.M., 2000, Сирмайс Н.С., с соавт., 2011).
Основным этиологическим фактором, обуславливающим возникновение розацеа, является генетическая предрасположенность, которая приводит к лимфатической васкулопатии, что ведет к развитию транзиторной и/или стойкой эритемы и телеангиэктазий. Повышение в коже уровня медиаторов воспаления и свободных радикалов, а также сенсибилизирующее и токсическое воздействие продуктов жизнедеятельности условно патогенной биоты кожи и желудочно-кишечного тракта (Demodex folliculorum, S. aureus, B. оleronius, Malassezia spp., Нelicobacter pylori) способствуют Т-клеточной пролиферации и формированию воспалительных элементов – папул, пустул, единичных узлов. В дальнейшем торпидно протекающий воспалительный процесс способствует эластозу кожи и лимфоцитарной инфильтрации, а также гиперплазии соединительной ткани и сальных желёз, что обуславливает возникновение фиматозных изменений кожи (ринофима, гнатофима, отофима) (Powell F.C., 2005; Yamasaki K., et al., 2007, Олисова О.Ю., с соавт., 2012).
В исследованиях было установлено, что ведущая роль в появлении сосудистых реакций при розацеа принадлежит активаторам ангиогенеза (фактору роста эндотелия сосудов (VEGF) и оксиду азота (NO)). (Олисова О.Ю., с соавт., 2012; Oztas M., Balk M., 2003; Jones, 2004; Yamasaki K., Di Nardo A., Bardan A. et al., 2007). Одним из основных патофизиологических механизмов повреждающего действия фотодинамических реакций в коже, является активация свободнорадикального окисления липидов (Koffi-Aka V. et al., 2002, J. Plevig, 2000). Нарушения механизмов периоксидации липидов меняют структуру и функциональную активность клеточных и субклеточных мембран, что может приводить к выходу протеолитических ферментов в цитоплазму клеток и кровяное русло, нарушениям пролиферации лимфоидных клеток и «запуску» иммунопатологических механизмов (Cohen A.F., 2002). Длительная дилатация сосудов в итоге ослабляет стенки капилляров, что приводит к накоплению в дерме нейтрофилов и провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1, ИЛ-6). В результате этого экстраваскулярная жидкость накапливается, сдавливая лимфатические сосуды, тем самым вызывая отек (Miyachi Y., 2001; Bamford J.T., 2001).
Выбор тактики лечения розацеа зависит от клинического подтипа заболевания (Wilkin J. et al., 2002), тяжести, длительности течения, переносимости препаратов, наличия сопутствующей соматической патологии, возраста, пола и психоэмоциональных особенностей пациента (Перламутров Ю.Н., Ольховская К.Б., 2009, Ильина И.В., Масюкова С.А., 2011).
Учитывая международные рекомендации по лечению розацеа, производные метронидазола, антибиотики и ретиноиды остаются золотым стандартом в терапии этого дерматоза, однако, до настоящего времени не существует единого мнения выраженности противовоспалительной активности используемых препаратов (Odom R, et al., 2009).
Цель исследования
Провести сравнительный анализ антиоксидантной, противовоспалительной и вазопротекторной активности различных методов лечения для совершенствования терапии папулопустулёзного подтипа розацеа.
Задачи исследования
-
Изучить эпидемиологические характеристики больных с папулопустулёзным подтипом розацеа.
-
Оценить взаимосвязь клинических проявлений папулопустулёзного подтипа розацеа с общими характеристиками больных (возраст, пол и длительность заболевания).
-
Определить уровень отклонений в антиоксидантной системе, концентрации оксида азота и в цитокиновом профиле у больных с папулопустулёзным подтипом розацеа.
-
Провести клиническую оценку эффективности и переносимости различных методов терапии больных с папулопустулёзным подтипом розацеа.
-
На основании лабораторных методов исследования определить оптимальный метод лечения больных с папаулопустулёзным подтипом розацеа в зависимости от показателей антиоксидантного и цитокинового статуса, а также эндотелиальной функции.
Новизна исследования
Впервые проведено исследование по определению соотношения отклонений в антиоксидантной системе, эндотелиальной дисфункции и цитокинового профиля у больных с папулопустулёзным подтипом розацеа.
Лабораторная диагностика выявила достоверное снижение общей антиокислительной активности и повышение активности супероксиддисмутазы более чем в 2 раза у больных с папулопустулёзным подтипом розацеа, элевацию метаболитов оксида азота и уровня цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-6 в сравнении с группой здоровых доноров.
На основании полученных сравнительных данных по изучению эффективности различных методов лечения больных с папулопустулёзным подтипом розацеа определена наибольшая эффективность и безопасность применения изотретиноина, что сопровождалось стойкой нормализацией показателей лабораторных исследований, характеризующих основные патогенетические звенья дерматоза.
Практическая значимость работы
С целью повышения уровня оказания специализированной помощи больным с папулопустулёзным подтипом розацеа в результате исследования была показана обоснованность включения лабораторных исследований по определению отклонений в антиоксидантном статусе, метаболитов оксида азота и цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-6.
Доказана наибольшая эффективность и безопасность метода комплексной терапии больных с папулопустулёзным подтипом розацеа с использованием изотретиноина.
Отсутствие побочных эффектов и выраженная клиническая эффективность комплексной терапии папулопустулёзного подтипа розацеа с использованием изотретиноина обуславливают его широкое применение у данной категории больных.
Определение влияния основных препаратов, используемых для лечения больных розацеа, на различные патогенетические звенья дерматоза, позволяет совершенствовать терапию заболевания в зависимости от степени их отклонений.
Положения, выносимые на защиту
-
В структуре заболеваемости папулопустулёзным подтипом розацеа соотношение мужчин и женщин распределяется как , при этом возраст мужского контингента больше в среднем на 8 лет.
-
Папулопустулёзный подтип розацеа протекает тяжелее у мужчин старшего возраста при небольшом стаже заболевания.
-
У больных с папулопустулёзным подтипом розацеа обнаружены отклонения в антиоксидантной системе организма с выраженной эндотелиальной дисфункцией, что сопровождается повышением концентрации в сыворотке крови метаболитов азота, а также повышением основных провоспалительных цитокинов: ИЛ-1 и ИЛ-6.
-
Лечение больных с папулопустулёзным подтипом розацеа с использованием метронидазола, доксициклина гидрохлорида и изотретиноина способствует достижению значимых клинических результатов. Наилучший эффект доказан при лечении ароматическим ретиноидом (изотретиноином) в низких дозах, что проявлялось более выраженной положительной динамикой симптомов заболевания, длительной ремиссией у подавляющего большинства больных и минимальным количеством побочных эффектов.
-
Использование изотретиноина в комплексной терапии папулопустулёзного подтипа розацеа способствует повышению противовоспалительной, антиоксидантной и вазопротекторной активности. Применение метронидазола способствовало нормализации показателей антирадикальной системы, а доксициклина гидрохлорида – противовоспалительной активности.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в практику работы дерматологических отделений ГКБ №14, в программу лекций и практических занятий на кафедре кожных и венерических болезней МГМСУ для студентов лечебного факультета и слушателей ФПДО.
Апробация работы
Апробация диссертации проведена на научной конференции сотрудников кафедры кожных и венерических болезней Московского государственного медико-стоматологического университета 20 января 2012 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 3 в журналах ,рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Объём и структура работы
Работа изложена на 90 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», главы с изложением собственных результатов исследования, обсуждения полученных данных, выводов и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 12 рисунками. Библиографический указатель включает 23 наименования отечественных и 67 иностранных источников.
В результате скринингового обследования в исследование вошло 98 больных с папулопустулёзным подтипом розацеа и 32 человека соответствующего возраста без клинических признаков патологии кожи. Все больные предъявляли жалобы на высыпания и ощущение «приливов крови» к лицу, причём 39(39,8%) больных на периодическую, остальные (59/60,2%) – на стойкую эритему. Кроме того, 68 пациентов (69,39%) отмечали сухость кожи лица.
Возраст исследуемых больных колебался от 25 до 49 лет. Большинство больных папулопустулёзным подтипом розацеа были женщины – 75 больных (76,53%), и их подавляющее большинство находилось в возрасте от 31 до 45 лет (65 человек), а средний возраст пациенток составил 39,7+5,4 года. Мужчины составили четвёртую часть вошедших в исследование – 23 человека (23,47%), при этом основная масса больных мужского пола находилась в возрасте старше 46 лет (17 человек). Средний возраст мужского контингента - 47,3±2,1 лет, что достоверно больше, чем у женщин (р<0,05).
Перед началом лечения у 98 пациентов, вошедших в исследование, был собран подробный анамнез заболевания. Основные факторы обострения носили индивидуальный характер: отрицательное воздействие инсоляции было отмечено 24 пациентами (19 женщинами и 5 мужчинами) – 24,49%, смена климата – 11,22% (11 женщин), пряные пищевые продукты вызывали обострение у одной женщины (1,02%), алкогольные напитки – 18,37% (15 женщин и 3 мужчин), стресс – 5,10% (5 женщин), лекарственные препараты – 8,16% (8 женщин), косметические средства – 9,18% (9 женщин), неизвестная причина обострения у 22 больных (22,45% из них 15 мужчин и 7 женщин).
Длительность течения розацеа составляла: от 1 до 3 лет – у 22,45% (22 человека), от 4 до 7 лет – у 45,92% (45 человек), от 8 до 11 лет – у 31,63% (31 человек).
Из анамнеза больных, находившихся под наблюдением, выявлено, что они неоднократно проходили лечение в амбулаторных условиях, где назначалась традиционная терапия: наружно препараты метронидазола, азелаиновая кислота, антибиотики, специальные косметические и акарицидные средства. Системно применялись антибактериальные средства, а также препараты, улучшающие кровоснабжение и функцию желудочно-кишечного тракта. Эффективность ранее проводимой терапии (формирование ремиссии до 6 месяцев) отмечали только 27 больных (27,55%), у остальных продолжали наблюдаться высыпания на коже лица с незначительным улучшением.
При генеалогическом анализе выявлено, что наследственность была зарегистрирована только у 21 больного, из них у 16 по линии материи и у 5-ти по линии отца. Необходимо отметить, что большинство пациентов с розацеа не отмечали наличие заболевания у родственников, хотя при детальном опросе выяснялось, что повышенная чувствительность кожи и периодическое покраснение отмечалось у многих родителей, однако отсутствие медицинской документации не позволило нам зарегистрировать уних розацеа.
В зависимости от проводимой терапии все больные были разделены на три группы
В первую группу больных вошло 27 больных папулопустулёзным подтипом розацеа (6 мужчин и 21 женщина), которые получали традиционную наружную терапию (комбинация геля с азелаиновой кислотой и 0,75% крема метронидазол) в сочетании с метронидазолом по 250 мг 2 раза в день.
Вторую группу составили 30 пациентов с папулопустулёзным подтипом розацеа (11 мужчин и 19 женщин), которым помимо вышеуказанной наружной терапии был назначен приём доксициклина гидрохлорида по 100мг в сутки.
В третью группу вошел 41 больной (6 мужчин и 35 женщин) с папулопустулёзным подтипом розацеа, которым в комплексе с традиционной наружной терапией был назначен препарат из группы синтетических ароматических ретиноидов – изотретиноин по 10 мг в сутки.
Курс проводимой терапии для достоверности исследования во всех группах составил 4 недели, отдалённые результаты оценивались через 4 месяца после окончания терапии.
Диагноз устанавливался на основании клинической картины (WilkinJ., Dahl М. et al., 2002; Dahl M., 2004).
В процессе исследования для оценки тяжести розацеа применялась шкала диагностической оценки розацеа (ШДОР) (Адаскевич В.П., 2004) до лечения и через каждые 4 недели от начала лечения (4 месяца), которая включала качественную оценку выраженности эритемы (0 – ощутимой нет, 1 – слабая (легкая), 2 – умеренно выраженная, 3 – тяжелая (сильная)), определение количества папул и пустул (0 – менее 10;1 – от 11 до 20; 2 – от 21 до 30; 3 – более 30), наличие телеангиэктазий (0 – отсутствуют, 1 – занимали менее 10% лица, 2 – от 11 до 30%, 3 – более 30%).Также оценивали второстепенные признаки: сухость кожи и наличие шелушения (0 – отсутствует, 1 – слабая, 2 – умеренная, с незначительным шелушением, 3 – сильная, с выраженным шелушением), субъективные ощущения (чувство «жжения и покалывания» кожи), наличие отека лица (0 – отсутствует, 1 – слабый, 2 – умеренный, 3 – сильный), а также выраженность симптомов офтальморозацеа (0 – отсутствует, 1 – нерезко выраженная гиперемия, 2 – коньюнктивит, 3 – кератит, язва роговицы, другие выраженные изменения).
Для оценки состояния системы «оксиданты-антиоксиданты» у обследованных больных и лиц контрольной группы проводилось определение уровней продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), общей антиокислительной активности и отдельных антиоксидантов: каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), трансферрина. Количественное содержание продуктов ПОЛ определялось в сыворотке крови в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) спектрофотометрическим методом. Общую атиокислительную активность плазмы крови определяли спектрофотометрическим методом, в основе которого лежит реакция восстанавления антиоксидантами свободного радикала – дифенилпикрилгидразила. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре «Cary-50». Количественное содержание Cu-Zn-зависимой супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с помощью тест-систем фирмы «BenderMedSystems» (Австрия). Уровень каталазы в сыворотке крови обследованных лиц определяли спектрофотометрическим методом, основанным на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдата аммония стойкое соединение желтого цвета. Содержание трансферрина определяли спектрофотометрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе «Keysys» с использованием тест-систем фирмы «Roche».
У всех пациентов и здоровых доноров определялся уровень экскреции метаболитов оксида азота по методу Метельской В.А. (2005 г.), который достаточно точно отражает степень активности синтазы оксида азота по уровню метаболитов в сыворотке крови. После депротеинизации сыворотки крови с помощью этилового спирта и центрифугирования, уровень метаболитов (суммарную концентрацию нитратов и нитритов) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Восстановителем служил ванадия хлорид (Германия). Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы: 40,8-45,6 ммоль/л (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).
Иммуноферментный анализ (ELISA) для определения уровня IL1 и IL6 проводили методом «сэндвичевого» типа с использованием стандартного набора реактивов «human IL1» и «human IL6» компании R&D (США). Реактивы хранили при температуре 4оС до проведения реакции.
Полученные результаты обработаны статистическими методами вариационного и корреляционного анализа с использованием ПК «IBM/PCPentium 4» с использованием пакета прикладных программ для статистической обработки «Excel 7» и «SPSS 17.0», Результаты исследований обрабатывались параметрическими (дисперсионный анализ, критерий Стьюдента, Ньюмена-Кейлса, Даннета) и непараметрическими (критерий Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни, Данна) методами.
Определение и патофизиология розацеа
Розацеа - это неинфекционное, хроническое воспалительное заболевание кожи лица, характеризующееся проградиентным течением, персистирующей или стойкой эритемой, телеангиэктазиями, с эпизодами воспаления и появлением папул, пустул, редко - узлов. (Насыбуллина Н.М., 2006; Wilkin J. Powell F et al., 2004)
По существующим на сегодняшний день представлениям, розацеа представляет собой полиэтиологический дерматоз, с участием в его патогенезе многих универсальных патологических реакций. Основным этиологическим фактором, обуславливающим возникновение розацеа, является генетическая предрасположенность, которая приводит к лимфатической васкулопатии. Реализации генетической предрасположенности способствуют различные экзогенные и эндогенные триггеры (Данилова Е.Н., 1997; Черкасова М.Ж., Сергеев Ю.В., 1998.) По данным исследований одним из самых распространённых пусковых механизмов, способствующих дебюту и рецидивам заболевания, является инсоляция. Сосудистой гиперреактивности при этом заболевании способствует ультрафиолетовое (УФ) излучение. Вследствие механического воздействия ультрафиолетовое излучение способствует генерации кислорода и матриксных металлопротеиназ, которые приводят к расширению сосудов с последующим накоплением провоспалительных цитокинов, что способствует к развитию воспалительной реакции на коже лица (Nam Е., Suzuki Т., Moriyama М., et al., 2005; Buechner S.A., Dermatology, 2005). В настоящее время показано, что одним из основных патофизиологических механизмов повреждающего действия фотодинамических реакций, в том числе в коже, является активация свободнорадикального окисления липидов (Koffi-Aka V. et al., 2002). Ключевая роль свободнорадикального окисления липидов в этом процессе объясняется тем, что нарушения механизмов периоксидации липидов меняют структуру и функциональную активность клеточных и субклеточных мембран, что может приводить к выходу протеолитических ферментов в цитоплазму клеток и кровяное русло, нарушениям пролиферации лимфоидных клеток и «запуску» иммунопатологических механизмов (Cohen A.F., 2002). Однако не все пациенты с розацеа ассоциируют своё состояние с УФ воздействием, а некоторые из них отмечают положительное воздействие солнца на течение дерматоза (Crawford G.H., 2004).
Вследствие благотворного влияния местных и системных антимикробных препаратов была выдвинута гипотеза о непосредственной роли микробных и паразитарных агентов в развитии этого дерматоза. Некоторые исследования показали повышение в сально-волосяных фолликулах уровня Demodex folliculorum у пациентов с розацеа, по сравнению со здоровыми лицами (Crawford G.H., 2004; Buechner S.A., 2005).
При эритематозно-сквамозных дерматозах процент выявления D.folliculorum такой же, как и у здоровых. Исключение составляют больные розацеа, у которых D.folliculorum обнаруживается в кожном сале в 77-78%. В инвазированной клещом коже имеет место гипертрофия сальных желёз, отёк дермы, очаговые круглоклеточные инфильтраты с примесью гистиоцитов. При отсутствии D.folliculorum изменения менее выражены. Кроме того, имеются значительные изменения в нервных волокнах, подходящих к сально-волосяному фолликулу, что свидетельствует о наличии длительного раздражения нервных элементов. На основании этого учёные представляют патогенез розацеа следующим образом: D.folliculorum, находясь в сально-волосяном фолликуле, раздражает рецепторы кожи, что приводит к повышенной возбудимости эффекторных систем и, в первую очередь, к изменению сосудистых реакций, то есть к сосудодвигательным расстройствам. С возрастом наступает ослабление вазомоторных систем, появляются заболевания желудочно-кишечного тракта, что способствует нарушениям компенсаторных сил организма. Продолжающееся раздражение сенсорных систем кожи вызывает парез вазомоторов и атоническое расширение сосудов (Landow К., 2002).
Powell F.C., 2005 предполагает возможную причину размножения клеща в результате повышения температуры, что предшествует первым признакам розацеа и наличию патогенных бактерий. В результате длительно существующего симбиоза между клещами и хозяином складывается стабильное равновесие (бессимптомное носительство), при котором воздействие паразита уравновешивается механизмами неспецифической резистентности здорового хозяина-носителя, и под влиянием экзо- и эндогенных факторов симбиоз нарушается и возникают клинические признаки размножающегося клеща (Powell F.C., 2005).
Существует мнение, что D.folliculorum вызывает застой кожного сала и секрета сальных желез, и длительную ирритацию нервно-рецепторного аппарата сально-волосяного фолликула, что приводит к его дистрофии, усилению патогенности стафилококка (Allison t. Vidimos., 2002).
Роль клеща D.folliculorum объяснялась эффективностью пирметрина, метронидазола и другими препаратами, обладающими антибактериальным и противопротозойным действием (Kocak М. et al., 2002). Однако в последующем было показано, что использование этих средств не приводит к уменьшению клеща в сально-волосяных фолликулах, не смотря на снижение клинических симптомов дерматоза, что объясняет их эффективность при лечении этого заболевания только за счёт противовоспалительного и антиоксидантного эффекта (Del Rosso J.Q., 2006; Webstar G., 2003). В последнее время большинство исследователей склонны определять роль клеща Demodex folliculorum в формировании розацеа как косвенную (Курдина М.И. с соавт., 1998; Потекаев Н.Н., 2000; Thissen M.R., Neumann Н.А., 2001; Соколовский Е.В. с соавт., 2005), но вопрос о роли клеща в развитии розацеа до сих пор остаётся открытым и является предметом многочисленных дискуссий.
Наличию у больных розацеа заболеваний желудочно-кишечного тракта всегда уделялось значительное внимание. Присутствие в желудочно-кишечном тракте Helicobacter pilory, по данным литературы, может существенно усугублять тяжесть проявлений розацеа, способствуя более упорному течению заболевания (Сенкевич И., 2008; Utas S., Ozbakir О., 1999). Исследования также показали повышение уровня Ig G и Ig М к Helicobacter Pilory и их нарастание в период обострения розацеа. Однако ряд исследователей считают, что патология желудочно-кишечного тракта встречается у больных розацеа не чаще, чем у остального населения (Bonamigo R.R., Leite C.S., Wagner М., 2000).
При рассмотрении особенностей иммунного ответа у больных розацеа были обнаружены генетически обусловленные сдвиги, которые проявляются выработкой цитокинов и антимикробных белков (кателицидина) в ответ на воздействие ультрафиолетового облучения (Takeda К., 2003; Meylan Е., Tschopp J., Karin М., 2006; Dorschner R.A., Pestonjamasp V.K., Tamakuwala S., et al., 2001).
Исследование концентрации метаболитов оксида азота
Для оценки состояния системы «оксиданты-антиоксиданты» у обследованных больных и лиц контрольной группы проводилось определение уровней продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), общей антиокислительной активности и отдельных антиоксидантові каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), трансферрина. Количественное содержание продуктов ПОЛ определялось в сыворотке крови в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) спектрофотометрическим методом. Общую атиокислительную активность плазмы крови определяли спектрофотометрическим методом, в основе которого лежит реакция восстанавления антиоксидантами свободного радикала дифенилпикрилгидразила. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре «Сагу-50». Количественное содержание Cu-Zn-зависимой супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с помощью тест-систем фирмы «Bender MedSystems» (Австрия). Уровень каталазы в сыворотке крови обследованных лиц определяли спектрофотометрическим методом, основанным на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдата аммония стойкое соединение желтого цвета. Содержание трансферрина определяли спектрофотометрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе «Keysys» с использованием тест-систем фирмы «Roche».
В настоящее время уже получены и обсуждены конкретные данные о том, что оксид азота (II) (N0) сопровождает целый ряд биохимических и физиологических процессов, включающие регуляцию сосудистого тонуса, плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, формирование иммунного ответа и нейротрансмиссию, торможение пролиферации гладкомышечных клеток и некоторых других. В то же самое время снижение концентрации оксида азота (II), синтез которого происходит в эндотелиальных клетках сосудистой стенки, считают одной из самых главных причин дисфункции эндотелия, имеющей место при таких патологиях, как гиперхолестеринемия, сахарный диабет, артериальная гипертензия, сердечная недостаточность и так далее. Дисфункция эндотелия, которая обусловлена снижением продуктивности оксида азота (И), считается одним из ранних признаков атеротромбоза и ишемической болезни сердца. Избыточность же синтеза оксида азота (II), за счет которого поддерживается антимикробный эффект при воспалительных процессах, может превратиться из звена адаптации в звено патогенеза и стать не менее опасным повреждающим фактором для человеческого организма, чем его дефицит (Сосунов А.А., 2000.; Moncada S., 2000; Festa Adostino R., Williams К., Karter A.I., 2001).
У всех пациентов и здоровых доноров определялся уровень экскреции метаболитов оксида азота по методу Метельской В.А. (2005 г.). Для предотвращения искусственного повышения уровня экскреции NO, связанного с алиментарным попаданием нитратов, больные за сутки до начала сбора анализа придерживались диеты, исключающей сырые овощи, копчености, колбасы и иные продукты, содержащие консерванты. Также во избежание стимуляции эндогенной продукции NO минимум за 4 часа до проведения исследования воздерживались от приема алкоголя и напитков, содержащих кофеин.
Уровень метаболитов оксида азота в сыворотке крови определяли по методу Скрининг - метод определения оксида азота, который достаточно точно отражает степень активности синтазы оксида азота по уровню метаболитов в сыворотке крови. После депротеинизации сыворотки крови с помощью этилового спирта и центрифугирования, уровень метаболитов (суммарную концентрацию нитратов и нитритов) определяли колориметрическим методом по развитию окраски в реакции диазотирования нитритом сульфаниламида, входящего в состав реактива Грисса. Восстановителем служил ванадия хлорид (Германия). Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы: 40,8-45,6 ммоль/л (Метельская В.А., Туманова Н.Г., 2005).
Для получения сыворотки венозную кровь, взятую в чистую сухую пробирку, оставляли на 30 минут при комнатной температуре для формирования сгустка, затем центрифугировали в течение 30 минут при 5000 оборотах в минуту. Надосадочную фракцию (сыворотку) разливали на аликвоты по 0,5 мл и хранили при -40С до проведения иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (ELISA) для определения уровня IL1(3 и IL6 проводили методом «сэндвичевого» типа с использованием стандартного набора реактивов «human IL1» и «human IL6» компании R&D (США). Реактивы хранили при температуре 4С до проведения реакции. На первой стадии анализа определяемый цитокин, содержащийся в калибровочных и исследуемых пробах, связывается с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. На второй стадии анализа иммобилизованный цитокин взаимодействует с конъюгатом вторых антител - биотином. Количество связавшегося коньюгата прямо пропорционально количеству определяемого цитокина в исследуемом образце. На последней стадии анализа в лунки вносят авидин-пероксидазу.
Во время инкубации с субстратной смесью происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся меченых антител. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация определяемого цитокина в исследуемом образце.
Расчёт концентрации цитокинов в исследуемых пробах в пг/мл проводился при помощи компьютерной программы для анализов результатов иммуноферментного анализа.
Полученные результаты обработаны статистическими методами вариационного и корреляционного анализа с использованием ПК «IBM/PC Pentium 4» с использованием пакета прикладных программ для статистической обработки «Excel 7» и «SPSS 17.0», Результаты исследований обрабатывались параметрическими (дисперсионный анализ, критерий Стьюдента, Ньюмена-Кейлса, Даннета) и непараметрическими (критерий Крускала-Уоллиса, Манна-Уитни, Данна).
Общий уровень концентрации метаболитов азота в крови больных до лечения
Эндотелий - внутренняя выстилка сосудов - состоит приблизительно из 16x1013 клеток. Эндотелий интимы сосудов выполняет барьерную, секреторную, гемостатическую, вазотоническую функции, играет важную роль в процессах воспаления и ремоделирования сосудистой стенки. Эндотелиальную дисфункцию можно определить как неадекватное (увеличенное или сниженное) образование в эндотелии различных биологически активных веществ. Одним из методов оценки выраженности эндотелиальной дисфункции является выявление содержания в крови этих веществ или исследование содержания в крови факторов, повреждающих эндотелий, уровень которых коррелирует с эндотелиальной дисфункцией. Эндотелий принимает самое активное участие в регуляции сосудистого тонуса, вырабатывая различные биологически активные вещества. По своему действию вазоактивные вещества делятся на вазоконстрикторы (эндотелии 1, тромбоксан А2, 20-НЕТЕ, ангиотензин II) и вазодилататоры (NO, простациклин, натрийуретический пептид С, кинины) (Escocard R.D., Kanashiro М.М., Petretski J.H. et al., 2006; Yoon S.Y., Lee Y.J., Seo J.H. et al., 2006; Zhang P., Liu Y., Li J. et al., 2006).
Эндотелиальные клетки чувствительны к различным повреждающим факторам, таким как деформация сдвига, свободные радикалы, воспалительные цитокины или холестерин. Наиболее вероятным звеном, повреждающимся в эндотелии при перечисленных нарушениях, является система синтеза важного эндотелиального фактора - NO. NO постоянно образуется из L-аргинина при участии NO-синтаз (NOS) и выделяется из эндотелия. Активность NOS наиболее выражена в эндотелии артериальных сосудов и минимальна в эндотелии капилляров и вен. Многие клетки осуществляют свою функцию через продукцию N0. Например, макрофаги в некоторых состояниях ингибируют пролиферацию лимфоцитов NO зависимым механизмом. N0 характеризуют как сильный медиатор натуральных супрессорных клеток в костном мозге. Установлено, что интерферон-у является индуктором NO-синтеза. NO оказывает разнообразные гомеостатические воздействия как активатор растворимой гуанилатциклазы, стимулятор нейронов, нейротрансмиттер периферической нервной системы и регулятор сокращения гладкой мускулатуры и сосудистого эндотелия. Кроме того, NO участвует в формировании обонятельной памяти, синаптических связей и их ремоделировании. Одним из главных условий ангиогенеза является повышение проницаемости эндотелия, что связывают преимущественно с действием NO. Повышение проницаемости сосудов необходимо для выхода белков плазмы крови, и в первую очередь - фибриногена, что приводит к образованию фибриновой основы для последующей миграции эндотелиоцитов. N0 отвечает за вазодилататорный эффект релаксирующего фактора, выделяемого эндотелием. В ответ на повреждение эндотелий сосудов вырабатывает семейство аминопептидов, называемых эндотелинами. Нестабильность NO делает непригодным стандартные методы его определения. Так как большая часть N0 окисляется в нитрит (N02) и нитрат (N03), и они определяются с использованием реакции Грисса (Keilhoff G., 2005; Pacher P., Beckman J.S., Liaudet L., 2007).
При исследовании уровня метаболитов оксида азота у здоровых из группы сравнения было констатировано его снижение по отношению к рекомендуемым референсным значениям, что можно объяснить широким распространением сердечно-сосудистой патологии среди людей старше 30 лет, при которых даже в начальных стадиях определяется пониженный уровень NO. Однако при исследовании уровня метаболитов оксида азота в крови пациентов розацеа было определено достоверное увеличение этого показателя (58,46±6,47мкМ/л) по сравнению со здоровыми добровольцами (34,53±2,8мкМ/л) и референсными значениями (р 0,05).
В ходе исследования было проведен анализ уровня метаболитов оксида азота в зависимости от тяжести розацеа, стажа заболевания и пола пациентов.
При анализе зависимости секреции метаболитов NO от различных факторов (пол и стаж заболевания) не было выявлено закономерности изменения показателей. В свою очередь, была достоверно установлена положительная корреляционная связь между тяжестью заболевания и уровнем стабильных метаболитов оксида азота (г=0,46; Р 0,05). Помимо этого было констатировано, что чем выше уровень NO в сыворотке крови, тем выше уровень основного продукта перекисного окисления липидов -малонового диальдегида (г=0,34; Р 0,05). Таким образом, концентрация оксида азота в системном кровотоке может отражать не только уровень продукции эндотелиального фактора вазодилатации, но и напряженность других механизмов, возникающих при избытке NO, в частности усиление перекисного окисления липидов и снижения антирадикальной активности организма, а оксид азота можно характеризовать как основной медиатор воспаления при розацеа.
Динамика показателей антиоксидантного статуса у больных в результате лечения
При генеалогическом анализе было установлено, что наследственность определялась только у 21 больного из них у 16 по линии материи и у 5-ти по линии отца. Необходимо отметить, что большинство пациентов с розацеа не отмечали наличие заболевания у родственников, хотя при детальном опросе выяснялось, что повышенная чувствительность кожи и периодическое покраснение отмечалось у многих родителей, однако отсутствие медицинской документации не позволило нам зарегистрировать розацеа у этих членов семей.
В зависимости от проводимой терапии все больные были разделены на три группы.
В первую группу больных вошло 27 больных папулопустулёзным подтипом розацеа (6 мужчин и 21 женщина), которые получали традиционную наружную терапию (очищение кожи специальными средствами, комбинация геля с азелаиновой кислотой и 0,75% крема метронидазол) в сочетании метронидазолом по 250 мг 2 раза в день в течение 4-х недель.
Вторую группу составили 30 пациентов с папулопустулёзным подтипом розацеа (11 мужчин и 19 женщин), которым помимо вышеуказанной наружной терапии был назначен приём доксициклина гидрохлорида по 100мг в сутки в течение 4-х недель.
В третью группу вошло 41 больных (6 мужчин и 35 женщин) с папулопустулёзным подтипом розацеа, которым в комплексе с традиционной наружной терапией был назначен препарат из группы синтетических ароматических ретиноидов - изотретиноин по 10мг в сутки для достоверности сравнения клинических и лабораторных результатов в течение 4-х недель.
Отдалённые результаты оценивались через 4месяца после окончания терапии. Всем больным был проведён комплекс клинико-лабораторных исследований. Тяжесть розацеа определяли при помощи шкалы диагностической оценки розацеа (ШДОР) (Адаскевич В.П., 2004) до лечения, через каждые 4 недели от начала лечения (4 месяца). Помимо этого, производилась лабораторная оценка системы «оксиданты-антиоксиданты» у обследованных больных и лиц контрольной группы, где определялись уровни продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), общей антиокислительной активности и отдельных антиоксидантов: каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), трансферрина. В комплекс лабораторных исследований были включены методы определения метаболитов оксида азота и цитокинов ИЛ -ір и ИЛ-6. Статистический анализ производился при помощи компьютерных программ «Excel 7» и «SPSS 17.0».
Анализ симптомов у наблюдавшихся пациентов выявил преобладание жалоб на ощущение жара и «приливов» кожи лица у 60,2% больных и чувство стягивания кожи - у 68,37% человек. Субъективные симптомы отсутствовали у 11,22% пациентов, и все они были мужского пола. Клинические проявления у больных, вошедших в исследование, соответствовали папулопутсулёзному подтипу розацеа и характеризовалась центрофациальной эритемой различной интенсивности: от розового до застойно-синюшного цвета, теленагиэктазиями, папулами и пустулами, которые также располагались преимущественно в центральной части лица, у 18,37% больных основная локализация воспалительных элементов на коже подбородка и у 23,47% - на коже лба. Папулы и пустулы сливались у 12 пациентов (12,24%), а их количество и выраженность эритемы в основном определяло тяжесть заболевания. Таким образом, клинические проявления заболевания являлись причиной обращения к врачу за медицинской помощью, а предшествующий эритематозно-телеангиэктатический подтип розацеа не определял необходимость лечения у больных. Вследствие этого поиск и оптимизация методов лечения розацеа наиболее актуальна для папулопустулёзного подтипа розацеа, когда косметические недостатки, возникающие при этом подтипе, способствуют наибольшему снижению качества жизни пациентов.
Среди больных, вошедших в исследование, преобладали пациенты (74,49%) со средней степенью тяжестью - средний балл по ШДОР составил 9,8±1,3, с лёгкой степенью (14,29%) - ШДОР - 6,5±1,2 и тяжёлой степенью - 11,22%) - ШДОР - 16,4±2,1. Частота обострений при лёгкой степени тяжести составила 6,7±2,1 раз в год, при средней степени тяжести 7,3±2,5 раза в год и при тяжёлой степени - 5,9±1,3 раза в год.
Таким образом, формирование клинических ремиссий и обострений не зависела от степени тяжести розацеа, а среди пациентов с папулопустулёзным подтипом дерматоза преобладает средняя степень тяжести.
При подсчёте ранговой корреляции не было установлено взаимосвязи возраста и стажа заболеваемости от тяжести проявлений розацеа. Наиболее тяжёлое течение было констатировано у больных в возрасте от 41х до 45 лет и в возрасте 46-49 лет, а при исследовании зависимости тяжести течения розацеа от пола было обнаружено, что у мужчин тяжесть течения заболевания достоверно была выше, чем у женщин у женщин (р 0,05).
Всем больным и группе здоровых для сравнительного анализа были проведены различные лабораторные исследования. При изучении состояния системы «оксиданты-антиоксиданты» у больных папулопустулёзным подтипом розацеа были выявлены биохимические изменения, характеризующие наличие оксидативного стресса при данном дерматозе, что выражалось достоверным снижением общей антиокислительной активности и повышением активности супероксиддисмутазы более чем в 2 раза у обследованных больных в сравнении с контрольной группой. Таким образом, при исследовании ПОЛ и АОС констатировано наличие дисбаланса в про- и антиоксидантной системе у больных папулопустулёзным подтипом розацеа с гиперактивацией процессов свободнорадикального окисления, что отражает наличие хронического воспалительного заболевания.
Помимо этого, было установлено, что, чем тяжелее и длительнее течение дерматоза, тем более высокий уровень основного продукта перекисного окисления липидов (малонового альдегида) в плазме крови больных, обуславливая повышение интенсивности оксидативного стресса.
Наиболее значимым звеном патогенеза развития розацеа является нарушение микроциркуляции и эндотелиальная дисфункция кожи лица. Наиболее вероятным звеном, повреждающимся в эндотелии при перечисленных нарушениях, является система синтеза важного эндотелиального фактора — NO. NO отвечает за вазодилататорный эффект релаксирующего фактора, выделяемого эндотелием. В ответ на повреждение эндотелий сосудов вырабатывает семейство аминопептидов, называемых эндотелинами (Keilhoff G., 2005).
![Оптимизация лечения детей, больных контагиозным моллюском, на основе изучения клинических и иммунологических показателей (клинико-лабораторное исследование) [Электронный ресурс]](/i/i/4454/210249.png "Оптимизация лечения детей, больных контагиозным моллюском, на основе изучения клинических и иммунологических показателей (клинико-лабораторное исследование) [Электронный ресурс] Кондрахина Ирина Никифоровна")
