Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА ПСОРИАЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 12
1.1. Общие сведения 12
1.2. Эпидемиология псориаза 13
1.3. Генетические детерминанты псориаза 15
1.4. Роль программируемой клеточной гибели в развитии псориаза 19
1.5. Белки семейства каспаз 23
1.6. Полиморфизма генов семейства каспаз как объект исследования при изучении молекулярного патогенеза псориаза 28
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 33
2.1. Группы пациентов и контролей 32
2.2. Оценка встречаемости полиморфных генетических вариантов в группах больных псориазом и здоровых доноров 36
2.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов 36
2.2.2. Генотипирование 37
2.2.2.1 .Аллель-специфическая ПЦР 37
2.2.2.2.Анализ результатов ПЦР-амплификации 40
2.2.2.3.Аллель-специфическая ПЦР в режиме «реального времени» 40
2.2.2.4. Анализ результатов ПЦР-амплификации в режиме «реального времени» 44
2.3. Статистический анализ 46
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 5 0
3.1. Выбор полиморфных генетических вариантов 5 0
3.2. Полиморфизмы, не обнаруженные в изучаемых группах или исключенные из исследования по техническим или иным причинам
3.3. Распределение частот генотипов по изучаемым полиморфизмам среди больных псориазом и в контрольной группе 53
3.4. Встречаемость генотипов полиморфных генов семейства каспаз в группах больных псориазом с псориатическим артритом и без артрита 59
3.5. Распределение частот генотипов по изучаемым полиморфизмам среди больных псориазом с различной тяжестью заболевания 65
3.6. Встречаемость генотипов полиморфных генов семейства каспаз среди больных псориазом с отягощенным и неотягощенным анамнезом 66
3.7. Распределение частот генотипов по изучаемым полиморфизмам среди больных псориазом с интермиттирующим и непрерывно рецидивирующим течением 68
Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 71
ВЫВОДЫ 77
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 78
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 80
- Генетические детерминанты псориаза
- Группы пациентов и контролей
- Выбор полиморфных генетических вариантов
Введение к работе
Формирование, развитие и проявление заболеваний человека является результатом сложной цепи взаимодействий всего двух факторов: генотипа и окружающей среды. Завершение проекта по расшифровке генома человека открыло совершенно новый спектр знаний. Геномные исследования дали потрясающие возможности для идентификации генетической предрасположенности к развитию многих болезней. В изучении наследственных заболеваний наибольший интерес сосредоточен на исследовании мультифакториальных болезней. Среди предполагаемых практических результатов этих работ необходимо отметить изучение оценки вклада генетических факторов в формирование риска развития заболеваний, профилактические меры на основе генетического тестирования, прогнозирование развития и течения болезней, генетически детерминированный индивидуальный подбор фармакотерапии и дозы лекарственных препаратов [Баранов B.C., Айламазян Э.К., 2001; Хуснутдинова Э.К., 2001; Янковский Н.К., Боринская С.А., 2004; Venter J.C. et al., 2001].
Псориаз - мультифакториальное полигенное заболевание с преимущественным поражением кожи, основная роль в иммунопатогенезе которого отводится Т-лимфоцитам. В настоящее время необходимость изучения молекулярных основ псориаза стала очевидной. Интенсивный поиск специфических для псориаза генов обусловлен наличием наследственной предрасположенности, присутствием аутоиммунного компонента и отсутствием целостного представления о патогенезе заболевания. Идентификация специфических для псориаза генетических детерминант позволит понять биологические механизмы этого дерматоза, даст возможность для разработки новой и индивидуальной специфической терапии [Владимиров В.В., Владимирова Е.В., 2006; Кубанова А.А. и соавт., 2006; Самцов А.В., Барбинов В.В., 2008].
Программируемая клеточная гибель является процессом противоположным пролиферации клеток и направлена на поддержание клеточного гомеостаза. Роль нарушений программируемой клеточной гибели в патогенезе псориаза признается многими исследователями [Клеменова И.А., 2007; Хайрутдинов В.Р. и соавт., 2007; Reefman Е. et al., 2005; Kastelan М. et al., 2006; Raj D. et al., 2006; Raymond A.A. et al, 2007]. Увеличение количества клеток, демонстрируемое в области псориатических высыпаний, может являться результатом нарушения, как пролиферации, так и апоптоза. Чрезмерная активация Т-клеточного звена иммунитета, приводящая к избыточной продукции медиаторов воспаления и факторов роста, рассматривается при псориазе как дефицит активности апоптоза. Снижение интенсивности программируемой клеточной гибели Т-клеток может являться ключевым звеном в развитии псориаза. Разрешение псориатических высыпаний происходит вследствие элиминации активированных Т-лимфоцитов путем программируемой клеточной гибели [Кубанова А.А. и соавт., 2007; Victor F.C., Gottlieb А.В., 2002; Reefman Е. et al., 2005; Strober B.E., Menon K., 2007; Fluhr J.W. et al., 2008; Yazdi M.R., Mrowietz U., 2008]. Популяционная вариабельность интенсивности апоптоза, изменяясь в широком диапазоне, может объяснять существенные различия в ответе больных псориазом на проводимую терапию. Индивидуальные различия индивидуумов обусловлены их генетической разнородностью. Наиболее распространенной причиной вариации генома являются замены единичных нуклеотидов в последовательности ДНК - генные полиморфизмы. В отличие от мутаций, приводящих к патологическим изменениям и снижающих жизнеспособность, генный полиморфизм имеет менее отчетливые фенотипические проявления. Вместе с тем, генный полиморфизм далеко не всегда является нейтральным для организма. Полиморфизм нуклеотидов может приводить к замене аминокислот в первичной структуре белка и появлению белковых продуктов с несколько измененными физико-химическими свойствами и, соответственно, параметрами функциональной активности этих молекул. Стабильность и распространенность генных полиморфизмов делают их перспективными для поиска ассоциаций с заболеванием. Ассоциативные исследования, направленные на установление связи генотипа с фенотипическими проявлениями, позволяют оценить роль генетических факторов в патогенезе заболеваний [Ляхович В.В. и соавт., 2004; Глотов А.С. и соавт., 2005; Imyanitov Е. et al., 2005; Bromberg Y., Rost В., 2007; Lee P. H., Shatkay H., 2008].
Число генов, продукты которых вовлечены в инициацию, реализацию и регуляцию апоптоза, достаточно велико. Представители семейства цистеиновых каспаз являются ключевыми и наиболее важными участниками программируемой клеточной гибели. Путем каскадного взаимодействия эти ферменты приводят к значительному усилению начального сигнала гибели клеток. Гены семейства каспаз играют важную роль в реализации лечебного эффекта излучения ультрафиолетового спектра при терапии псориаза [Imyanitov Е. et al., 2005; Enjuanes A. et al., 2008; Lee P. H., Shatkay H., 2008].
Цель исследования.
Оценить роль полиморфных аллелей генов апоптоза семейства каспаз в формировании риска развития псориаза и псориатического артрита.
Задачи исследования:
Выявить все кодирующие несинонимичные полиморфизмы генов семейства каспаз, встречающиеся в популяции Северо-Западного региона РФ, частота которых верифицирована и составляет не менее 1%.
Проанализировать распределение частот генотипов и аллелей генов апоптоза семейства каспаз в группах больных псориазом и здоровых доноров.
Выявить варианты генов каспаз с достоверно различающейся частотой в группах больных псориазом с псориатическим артритом.
Рассчитать прогностическую ценность метода генотипирования полиморфных генов апоптоза семейства каспаз с целью определения риска развития псориаза и псориатического артрита.
Научная новизна полученных результатов.
Выполнено систематическое молекулярно-эпидемиологическое исследование, направленное на изучение распределения полиморфных генов семейства каспаз у больных псориазом.
Установлено, что частота гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp среди больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), носители аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%) встречаются чаще, чем в контроле (55,2%).
Встречаемость носителей аллеля Leu полиморфного гена Casp2 LeuHlVal у больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%), частота носителей аллеля Asp полиморфного гена Casp7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%о).
Прогностическая ценность генотипирования полиморфных генов Casp8 His302Asp и CasplO Ile479Leu с целью оценки риска развития псориаза имеет умеренную чувствительность (51-67%) и высокую специфичность (73-81%) метода, генотипирование полиморфных генов Casp2 LeuHlVal и Casp7 Glu255Asp, с целью определения риска формирования псориатического артрита, имеет чувствительность от низкой до умеренной (34-70%) и высокую специфичность (81-82%).
Научно-практическая значимость.
Выявлены новые генетические маркеры псориаза - полиморфизмы Caspase-8 His302Asp, Caspase-10 Leu479Ile и псориатического артрита -полиморфизмы Caspase-2 LeuHlVal, Caspase-7 Glu255Asp, что позволяет включить их в генетическое тестирование, выполняемое лицам, предрасположенным к псориазу.
Установлено, что риск развития псориаза у лиц с генотипом His/His гена Caspase-8 His302Asp повышается в 5,5 раза. Наличие аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile в генотипе обследуемого повышает у него риск развития псориаза в 4,3 раза, что необходимо учитывать при прогнозировании развития заболевания у родственников больного.
Присутствие в генотипе больных псориазом аллеля Leu гена Caspase-2 LeuHlVal повышает риск развития псориатического артрита в 9,9 раз, наличие аллеля Asp гена Caspase-7 Glu255Asp повышает риск развития псориатического артрита в 2,4 раза, что позволяет прогнозировать у них развитие псориатического артрита.
Основные положения, выносимые на защиту.
Полиморфные гены апоптоза семейства каспаз Caspase-2 LeuHlVal, Caspase-7 Glu255Asp, Caspase-8 His302Asp, Caspase-10 Leu479Ile играют важную роль в формировании риска развития псориаза и псориатического артрита.
Частота гомозигот His/His гена Caspase-8 His302Asp у больных псориазом (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров (1,2%), носители аллеля Не гена Caspase-10 Leu479Ile среди пациентов с псориазом (80,4%)) встречаются чаще, чем в контроле (55,2%>), встречаемость носителей аллеля Leu гена Casp2 LeuHlVal у больных псориазом с псориатическим артритом (28,6%>) выше, чем в группе больных без псориатического артрита (3,9%>), частота носителей аллеля Asp гена Casp7 Glu255Asp среди пациентов, имеющих псориатический артрит (61,9%), выше, чем у больных без псориатического артрита (32,9%). 3. Прогностическая ценность генотипирования полиморфных генов Casp8 His302Asp и CasplO Ile479Leu с целью оценки риска развития псориаза имеет умеренную чувствительность (51-67%) и высокую специфичность (73-81%) метода, генотипирование полиморфных генов Casp2 Leul41Val и Casp7 Glu255Asp, с целью определения риска формирования псориатического артрита, имеет чувствительность от низкой до умеренной (34-70%о) и высокую специфичность (81-82%).
Реализация и внедрение полученных результатов работы.
Полученные результаты и рекомендации успешно используются в лечебно-диагностической и учебно-методической работе кафедры кожных и венерических болезней Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова, ФГУ «442 Окружной военный клинический госпиталь Ленинградского военного округа» МО РФ.
Апробация работы.
Основные положения диссертации были представлены на II Всероссийском Конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007 г.), II Российской научно-практической конференции «Санкт-Петербургские дерматологические чтения» (Санкт-Петербург, 2008 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008 г.), Итоговой конференции военно-научного общества слушателей и ординаторов I факультета Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова, (Санкт-Петербург, 2008 г.), Российской конференции по фундаментальной онкологии «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2008 г., 2009 г.).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, получено 2 удостоверения на рационализаторские предложения.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 100 страницах и включает введение, обзор литературы, 3 главы собственных наблюдений, включающих материалы и методы исследования, полученные результаты и заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы, содержащий 201 источников (в том числе 64 отечественных и 137 иностранных). Диссертация иллюстрирована 13 рисунками, содержит 13 таблиц.
Генетические детерминанты псориаза
Формирование, развитие и проявление заболеваний человека подчинено сложной цепи взаимодействий только двух факторов: генотипа и внешнего влияния окружающей среды. Многие работы, направленные на исследование монозиготных близнецов показали, что в тех случаях, когда близнецы конкордантны по псориазу, начало заболевания, распространенность и тяжесть заболевания очень похожи. Так, в исследовании, проведенном в 1982 г. Brandrup F. и соавт. были получены следующие показатели конкордантности при псориазе: парная конкордантность у монозиготных близнецов составила 64%, у дизиготных близнецов - 14% [Brandrup F. et al., 1982]. В ретроспективном исследовании, проведенном Farber Е.М. и Nail M.L., получена частота конкордантности у МЗБ - 72%, у ДЗБ - 14% [Farber Е.М., Nail M.L., 1991]. Позже, в исследовании Duffy D. с соавт. была выявлена более низкую конкордантность - 35% у монозиготных и 12% у дизиготных близнецов [Duffy D. et al., 1993]. Более высокая конкордантность у монозиготных близнецов, чем у дизиготных, указывает на важную роль генетических факторов при псориазе, которые контролируют развитие и характер течения болезни. В то же время, конкордантность среди близнецов никогда не достигала 100%, даже когда производили обследование пожилых пациентов, что свидетельствует о безусловном влиянии условий окружающей среды, действие которых необходимо для развития заболевания. Таким образом, манифестация болезни рассматривается, как результат воздействия неблагоприятных средовых факторов на генетически предрасположенный организм с формированием иммунозависимого патологического процесса, сохраняющегося на протяжении жизни индивидуума [Владимиров В.В., Владимирова Е.В., 2006; Brandrup F. Et al., 1982; Duffy D.L. et al., 1993; Krueger G.G., Duvic M., 1994; Grjibovski A.M. et al., 2007]. Исследование генетических основ болезни подразумевает установление характера его наследования. Для псориаза характерен клинический полиморфизм, что может свидетельствовать об ассоциации не с одним геном, а рядом генетических дефектов, сходных фенотипически. В связи с тем, что это заболевание полигенно, установить характер его наследования крайне сложно. Гетерогенность клинических проявлений псориаза, наличие его разнообразных фенокопий в значительной степени затрудняет поиск генетических маркеров болезни, так как сходные в клиническом отношении формы заболевания могут не являться генетически гомогенными. Наследование может носить доминантный или рецессивный характер. При доминантном типе наследования фенотипические проявления псориаза характеризуются необычно низкой частотой проявления доминантного признака. В своем большинстве изучаемые случаи псориаза не укладываются в законы менделеевской генетики [Мошкалов А.В., Имянитов Е.Н., 1995; Мошкалов А.В., Имянитов Е.Н., 2002; Азарова В.Н. и соавт., 2003; Мошкалов А.В.,2008].
В настоящее время проведены многочисленные исследования, которые выявили ряд генетических детерминант псориаза. Большой интерес исследователей привлек полиморфизм генов комплекса HLA (хромосома 6р21.3) в связи с предполагаемой аутоиммунной природой псориаза и непосредственным участием этих генов в иммунологических реакциях организма. Предрасположенность к развитию псориаза рассматривалась с позиции формирования особого иммунного статуса под влиянием генов HLA. Специфический набор аллелей генов главного комплекса гистосовместимости определяет иммунологическую чувствительность к некоторому спектру антигенов, активирующих Т-клеточно опосредованный иммунный ответ, и детерминирует развитие псориаза. В этих случаях у лиц, несущих определенную антигенную специфичность, могут провоцироваться иммунопатологические реакции, ведущие к срыву естественной толерантности. Генам комплекса HLA, расположенным на хромосоме 6р21.3 дали название PSORSl. В дальнейшем, многочисленные исследования генетического полиморфизма главного комплекса гистосовместимости выявили значительные количественные и качественные расхождения полученных результатов. Наиболее часто выявлена связь псориаза с антигенами I класса - HLA-A2, А24, АЗО, ВІЗ, В27, В37, В39, Cw2, Cw6, Cw7, Cw8, Cwll; II класса -HLA-DR1, DR2, DR7, DQ9. В разных этнических группах наиболее часто обнаруживается ассоциация с псориазом аллелей Cw6, В27 и DR7. Генетические исследования демонстрируют отличия в распределении генов главного комплекса гистосовместимости у больных псориазом с ранним и поздним началом заболевания, наличием или отсутствием псориатического артрита, различным ответом на УФ-терапию [Мошкалов А.В., Имянитов Е.Н., 1995, 2002; Шилов В.Н., 2001; Russel T.J. et al., 1972; Henseler Т., 1998; Barker J.N., 2001; Capon F. et al., 2002, 2004; Cassia F.F. et al, 2007; Valdimarsson H., 2007; Lehman J.S., Rahil A.K., 2008; Shiina T. et al., 2009].
На сегодняшний день найдены ассоциации антигенов HLA со многими мультифакторными заболеваниями, что может свидетельствовать об их участии в иммунопатологических изменениях. В то же время, нельзя исключить и то, что указанные гены могут служить лишь своеобразными генетическими маркерами предрасположенность к развитию заболевания, не участвуя непосредственно в патогенезе болезни. Так, на участке хромосомы 6р21.3, включающем большой комплекс гистосовместимости, располагаются другие гены-кандидаты HCG22, HCG27, OTF3, TCF19, SEEK1, SPR1, STG, CDSN и HCR, однако ни для одного из них не описаны значимые мутации [Гинтер Е.А., 2003; Allen М.Н. et al., 1999; Asumalahti К. et al., 2002; Brewerton D.A., 2003; Shiina T. et al., 2009].
По мере открытия новых генов предрасположенности к псориазу им присваивали следующий порядковый номер. Кроме упомянутого PSORSl, известны PSORS2 на 17q, PS0RS3 на 4q, PS0RS4 на lcen-q21, PS0RS5 на 3q21, PSORS6 на 19р, PSORS7 на 1р и PSORS9. В рамках изучения генетики псориаза может представлять интерес ассоциация с псориазом полиморфного гена S100. Отмечается высокая активность этого гена в кератиноцитах псориатических бляшек, что позволяет считать его причастным к патогенезу псориаза [Азарова В.Н. и соавт., 2003; Галимова Э.С. с соавт., 2008; Guerrin М. et al., 2001; Eckert R.L. et al., 2004].
Найдены ассоциации псориаза с некоторыми полиморфными генами иммунного ответа. К ним относятся гены комплемента (С2, С4, BF), IL-1, IL-23, TNF-a, TNFAIP3 и TNIP1, антигенных транспортеров (ТАРІ, ТАР2) [Barker J.N., 2001; Capon F. et al., 2004].
Маркерами нарушения дифференцировки кератиноцитов в области псориатических высыпаний являются экспрессируемые в этих клетках трансглутаминаза кератиноцитов I типа, антилеикопротеаза, продуцируемая кожей, протеин-8 связывающий фактор, ингибирующий миграцию, инволюкрин, филагрин, кератин Кб и К16. Трансглутаминаза кератиноцитов I типа участвует в основных этапах формирования кератиновых чешуек эпидермиса. Усиление функции этого фермента в коже больных псориазом может является причиной наблюдаемого гипер- и паракератоза. Продуцируемая кожей антилейкопротеиназа обнаружена исключительно в области псориатических высыпаний. Этот белок ингибирует фермент эластазу, отвечающую за деградацию эластина. Протеин-8 связывающий фактор, ингибирующий миграцию, участвует в формировании цитоскелета во время окончательной дифференцировки кератиноцитов. В коже больных псориазом в области высыпаний отмечается высокая концентрация инволюкрина, белка-предшественника, отвечающего за стабилизацию кератина. В нормальной коже этот протеин присутствует только на начальных этапах формирования чешуек. Формирование чешуек кератина в коже больных псориазом ускорено, вследствие чего инволюкрин определяется в большом количестве. При псориазе наблюдается экспрессия кератина, отличающаяся от кожи здоровых людей. Наблюдается повышенная экспрессия кератина Кб и К16, являющихся маркерами усиленной пролиферации, и снижение К1 и К10 - маркеров терминальной дифференцировки. Белок филагрин в норме определяется только в зернистом слое эпидермиса. При псориазе наблюдается отсутствие зернистого слоя, вследствие чего филагрин в эпидермисе больных отсутствует [Schroeder W.T. et al., 1992; Molhuizen H.O. et al., 1993; Goebeler M. et al, 1995; Ishida-Yamamoto A. et al., 1995; Thewes M. et al., 1998].
Геномный анализ позволяет идентифицировать локусы предрасположенности к заболеванию. Несмотря на убедительность представленных аргументов, приходится констатировать, что этиология псориаза продолжает оставаться неизвестной. Гены-кандидаты предрасположенности к развитию псориаза, которые должны присутствовать у всех больных и отсутствовать у подавляющего большинства здоровых лиц, до сих пор не идентифицированы.
Дальнейшее исследование генетических детерминант псориаза будет способствовать более глубокому пониманию молекулярно-биологических механизмов развития этого дерматоза и разработке принципиально новых и эффективных подходов к лечению псориаза [Мошкалов А.В., Имянитов Е.Н., 1995; Баранов B.C. и соавт., 2000; Вавилин В.А. и соавт., 2002; Мошкалов А.В., Имянитов Е.Н., 2002; Мошкалов А.В., 2008].
Группы пациентов и контролей
Для выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови использовался модифицированный соль-хлороформный метод [Mullenbach R. et al., 1989]. Гипоосмотический лизис эритроцитов достигался посредством 3-кратного разведения 5 мл крови дистиллированной водой, охлажденной до +4 С. Затем лейкоциты осаждали центрифугированием. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Трис-НС1 (рН = 8.3), 1 тМ ЭДТА. Для разрушения цитоплазматической мембраны клеток к суспензии добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1%. Ядра осаждали центрифугированием. Осадок вновь ресуспендировали в 1 мл Трис-HCl (рН = 8.3) и лизировали посредством добавления л аури л сульфата натрия до конечной концентрации 1%. Протеолиз белков и деградация комплексов «белок-ДНК» осуществлялась посредством инкубации пробы в присутствии протеиназы К (200 мкг/мл) при +60 С в течение 12 часов. Затем к лизату добавляли раствор NaCl до конечной концентрации 1.5М и равный объем хлороформа. Экстракция проводилась в течение 30 минут при медленном покачивании с целью удаления из раствора ДНК нерастворимых компонентов клеточного лизата - белков и липидов. При необходимости процедура повторялась дважды. Последующее центрифугирование приводило к образованию в пробирке трех четко различимых фаз. Верхняя водная фаза содержала растворенную ДНК и неорганические соли, промежуточная и нижняя, хлороформные, - гидрофобные компоненты. Для осаждения ДНК к осторожно отобранной верхней фазе добавляли равный объем изопропанола и оставляли на 20 минут при температуре -20 С. Осадок затем собирали центрифугированием в течение 5 минут при 15000 g. Для получения более чистого препарата ДНК промывали в 1 мл 70% этанола и растворяли в 0.5 мл 200 мМ раствора Трис-ЭДТА (рН = 7.6). Полученный раствор ДНК хранился при температуре -20 С до использования в эксперименте.
Оптимизация условий ПЦР: подбор концентрации MgCb и температуры отжига праймеров - производилась эмпирически с целью увеличения специфичности и исключения ошибочных результатов. Первоначально условия для всех проводимых реакций были оптимизированы с помощью аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Те реакции, которые показали высокую специфичность, т.е. амплификация неспецифического продукта происходила с большим отставанием, можно было проводить методом «простой» аллель-специфической ПЦР. При этом количество циклов реакции сокращали настолько, чтобы продукт ошибочной амплификации невозможно было визуализировать обычным путем. Генотипирование каждого образца требует постановки двух ПЦР реакций одновременно, в двух разных пробирках. В первой пробирке находится одинаковый общий праймер и праймер, специфичный к одному из возможных аллелей, во второй - все тот же общий праймер и второй аллель-специфический. Результаты такой ПЦР оценивались по наличию или отсутствию продуктов реакции после проведения электрофореза в полиакриламидном гелеАллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени проводилась на приборе «iQ iCycler» («Bio-Rad») и использовалась для оптимизации условий всех ПНР-реакций, а также для генотипирования образцов по тем полиморфизмам, для детекции которых не удалось подобрать приемлемые условия аллель-специфической ПЦР (см. выше). Кроме того, в режиме «реального времени» проводили детекцию редко встречающихся однонуклеотидных замен.
В случае аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени к описанной выше ПЦР-смеси добавляли интеркалирующий краситель SYBR-Green I (20х раствор, добавляется из расчета 1/100 объема реакции), который флуоресцирует при связывании с малой дорожкой (minor groove) двухцепочечной ДНК. Еще одним компонентом Realime PCR, не участвующим в реакции, но необходимым для корректной работы прибора, является другой флюорофор FAM (fluorescein) (400 пМ раствор, добавляется из расчета 1/50 объема реакции). Количество циклов в этом варианте ПЦР больше чем в описанном выше, поскольку у нас нет задачи «не увидеть» неспецифический продукт [Улыбина Ю.М., 2008]. Напротив, его амплификация является внутренним контролем правильности постановки реакции. Таким образом, в случае накопления продукта уровень флюоресценции будет зависеть от количества двухцепочечной ДНК, и, соответственно, увеличиваться с каждым циклом (ПААГ) и визуализации амплифицированных фрагментов.Однако важно отметить то, что увеличение флюоресценции может быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных фрагментов с помощью построения так называемых «кривых плавления» (melting curves) (рис. 7, 9). Для этого после окончания ПНР реакционную смесь нагревают и непрерывно (каждые 5 секунд) измеряют флюоресценцию. При достижении температуры плавления продукта амплификации светимость резко снижается. Представление «кривых плавления» возможно в двух вариантах: первичный график зависимости флюоресценции от температуры и более наглядный и удобный график зависимости отрицательного значения первой производной флюоресценции от температуры (рис. 7-9). По такому графику легко определить Т пиков плавления - это такое значение температуры, при котором амплифицированный фрагмент денатурирует, и которая постоянна для каждой молекулы ДНК, т.к. зависит от ее первичной структуры. Эта методика является альтернативой электрофоретическому способу визуализации ДНК, поскольку мы всегда можем контролировать специфичность реакции, зная Т плавления нашего продукта [Улыбина Ю.М., 2008].
Анализ результатов ПЦР-амплификации разберем на примере определения генотипов по полиморфизму Glu255Asp гена Casp7 -нуклеотидная замена - C/G. Графики амплификации показывают относительную флюоресценцию в каждой лунке на каждом цикле. Одна кривая соответствует одной пробирке. На каждом из рисунков F1, 2, 3 представлены графики амплификации одного фрагмента ДНК, принадлежащей одному человеку, но с помощью двух разных аллель-специфических праймеров. На рисунках 7 и 9 показаны кривые плавления амплифицированных фрагментов.
Выбор полиморфных генетических вариантов
Принцип выбора полиморфных генов, вошедших в исследование, производился на основе изучения публикаций и специализированной электронной базы данных Национального Центра Биотехнологической Информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI,), доступной в сети Интернет [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/1.
Выбор генетических вариантов, потенциально значимых для последующего популяционного молекулярно-генетического изучения, был произведен с учетом следующих критериев:
- изменение должно затрагивать экзон - кодирующую область гена;
- замена должна быть смысловой (nonsynonymous substitution), то есть вариабельность на уровне ДНК приводит к замене аминокислоты и изменению первичной структуры полипептида;
- представленные в базе данные о полиморфизме должны быть получены при изучении последовательности ДНК/кДНК, выделенной из здоровых человеческих клеток, а не из клеток опухолей или клеточных линий;
- заявленная популяционная частота полиморфизма определена и составляет более 1%.
Включение каждого конкретного генетического варианта в исследование определялось совокупностью перечисленных критериев [Улыбина Ю.М., 2008; Imyanitov Е. et al., 2005].
Для выбора полиморфных вариантов генов мы воспользовались базой данных Entrez SNP интернет-ресурса Национального Центра Биотехнологической Информации [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/]. Одиночные нуклеотидные замены, подходящие под наши условия были обнаружены у 8 генов семейства каспаз (по состоянию на 1 июня 2006 года): каспаза-1, -2, -5, -6, -7, -8, -9 и -10. У выбранных генов оказалось 15 полиморфизмов в кодирующей области, приводящих к замене аминокислот в полипептидной цепи Кроме этих полиморфных вариантов среди генов семейства каспаз было обнаружено еще 26 кодирующих несинонимичных однонуклеотидных замен, но в базе данных не было представлено информации о существовании в них верифицированной популяционной частоты. Эти полиморфизмы не были включены нами в дальнейшее исследование. 3.2. Полиморфизмы, не обнаруженные в изучаемых группах или исключенные из исследования по техническим или иным причинам
Пять полиморфизмов из первоначального, списка не были найдены ни в одной из исследованных групп (табл. 6). Это может быть связано с расовыми и этническими различиями популяций. Так, два полиморфизма были обнаружены только при изучении представителей негроидной расы, в основном афро-американцев, и их частота в европейской популяции либо не изучалась, либо, по данным некоторых исследователей, была близка к нулевой. Остальные, не обнаруженные однонуклеотидные замены были достаточно редкими и встречались с частотой ниже 5%. Возможно, что в изучаемой популяции Северо-Западного региона РФ некоторые из них встречаются еще реже и поэтому не были выявлены.
Кроме того, информация базы данных Entrez SNP интернет-ресурса Национального Центра Биотехнологической Информации постоянно корректируется в процессе накопления данных, поэтому нередко сведения о встречаемости того или иного полиморфизма оказываются неточными. Наконец, возможной причиной отсутствия того или иного полиморфного варианта могла быть техническая недоработка, которую можно определить как погрешность метода (неудачный дизайн праймеров, неоптимальные условия проведения реакции, влияние человеческого фактора).
Один полиморфизм не был исследован (табл. 7), поскольку в рамках нашего метода нам не удалось найти оптимальных условий для детекции этой замены. Это объясняется трудностями, возникшими на этапе подбора аллель-специфических праймеров, поскольку нуклеотидная последовательность вокруг интересующих нас точек не соответствовала необходимым требованиям (много CG повторов). Для этой замен мы использовали две композиции праймеров различного дизайна. Тем не менее, результаты оптимизаций не позволили провести детекцию данного полиморфизма и он выпал из работы.
Образцы ДНК 97 больных псориазом и 252 здоровых доноров были подвергнуты анализу по определению генотипов по 9-ти полиморфизмам. Результаты генотипирования были получены для 100% образцов в обеих группах. Все полученные данные, а также рассчитанные статистические параметры сведены в таблицу 8.
Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью с помощью %-квадрат критерия Пирсона, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей.
Анализ тенденций (trend test) проводили, используя Cochran-Armitage trend test с одной степенью свободы (табл. 8). Достоверными считали различия при уровне ошибки р 0.05, то есть допускали 5%-ую вероятность того, что найденная в выборке связь между переменными является лишь случайной особенностью данной выборки.
Показатели OR (odds ratio), рассчитанные относительно группы частых гомозигот, также приведены в таблице 8. Доверительный интервал (95% CI), полученный с учетом стандартной ошибки logc OR, указан в скобках.
Выявлены статистически достоверные различия при сравнении отдельных полиморфизмов между группой больных псориазом и здоровыми донорами.
Так, выявлены статистически достоверные различия при сравнении отдельных полиморфизмов между группой больных псориазом и здоровыми донорами. Анализ распределения генотипов и аллелей полиморфизма Casp8 His302Asp (C/G) показал, что встречаемость гомозигот His/His (С/С) среди больных псориазом - 6/97 (6,2%) выше, чем в группе здоровых доноров -3/252 (1,2%) (OR= 5,47, 95% СІ: 1,19-28,23; р 0,05)
