Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Эпидемиология 9
1.2. Этиология и патогенез 10
1.3. Клиническая карина .15
1.4. Патоморфология 17
1.5. Особенности клинической картины типичного КПЛ 18
1.6. Течение и прогноз 22
1.7. Диагноз 23
1.8. Лечение 25
2. ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 33
2.1. Общая характеристика клинических групп .33
2.2. Методы обследования больных красным плоским лишаем .38
2.2.1. Клинический осмотр пациентов.38
2.2.2. Метод экстракорпоральной фотохимиотерапии 45
2.2.3. Определение поверхностных дифференцировочных антигенов и адгезивных молекул на клетках периферической крови методом проточной цитофлуорометрии .46
2.2.4. Метод выявления фиксированных антител.47
2.3. Методы статистической обработки полученных результатов 48
3. ГЛАВА III. Результаты собственных исследований 49
3.1. Клинические особенности типичного красного плоского лишая .49
3.2. Иммунологическая характеристика больных типичным красным плоским лишаем83
3.3. Динамика иммунологичских показателей у пациентов в процессе лечения 93
3.4. Результаты иммунологических исследований .96
Заключение .137
Выводы 145
Практические рекомендации .147
Список литературы .148
- Особенности клинической картины типичного КПЛ
- Клинический осмотр пациентов
- Метод выявления фиксированных антител
- Иммунологическая характеристика больных типичным красным плоским лишаем
Введение к работе
Красный плоский лишай (КПЛ) - частый подострый или хронический воспалительный дерматоз с поражением кожных покровов, слизистых оболочек полости рта, пищевода, глотки, конъюнктивы глаза и придатков кожи [Бутов Ю.С. и др.,2011; Lodi G. et al., 2004]. Доля его среди других дерматозов оценивается в 0,5-5%, а популяционная частота КПЛ полости рта - в 0,5-2,2% [Бутов Ю.С. и др.,2011; Al-Hashimi I. et al., 2007]. В связи с возможностью тяжелого течения заболевания, злокачественной трансформации, а также из-за нередкой резистентности к лечению КПЛ является важной клинико-диагностической проблемой, в решении которой участвуют дерматологи, стоматологи и врачи других специальностей [Рабинович О.Ф и др.,1999; Молочков В.А. и др.,2011].
Хотя причина КПЛ не ясна, патогенез его связывают с аутоиммунным разрушением Т-клетками базальных кератиноцитов, измененных вирусными, лекарственными или другими аллергенами [Караулов А.В. и др., .2012; Бутов Ю.С. и др.,2011; Iijima W. et al. 2003]. В то же время, противоречивость данных об особенностях иммунопатогенеза типичного, атипичного, подострого и хронического КПЛ [Рабинович О.Ф. и др., 2000; Panfilis et al.,1983; Iijima W. et al. 2003] препятствует повышению качества его диагностики и лечения [Молочков В.А. и др., 2011; Gupta L.K. et al., 2012]. Поэтому до сих пор при распространенном КПЛ используют системные кортикостероиды, ароматические ретиноиды, циклоспорин, метотрексат, ПУВА-терапию [Молочков В.А. и др., 2011; Ho V.C.et al.,1990; Pittelkow M.R., Daoud M.S., 2012], а за рубежом- и биологические препараты (ретуксимаб, эфализумаб) [Cheng A., Mann C., 2006; Parmentier L. et al. 2008; McAleer M.A. et al., 2010], применение которых не только недостаточно эффективно [Mignogna M.D. et al.,2000; Zaraa I. et al.,2013], но и сопровождается множеством побочных эффектов и осложнений [Петрова Л.В, 2005; Krutmann J., Hnigsmann H., 2009; Zaraa I. et al.,2013].
В связи с этим наше внимание привлекла экстракорпоральная фотохимиотерапия (ЭФХТ) - метод адоптивной клеточной иммунотерапии, основанный на биологическом действии 8-метоксипсоралена (8-МОП) и УФ-A облучения мононуклеарных клеток, отобранных с помощью цитафереза и реинфузируемых пациенту. Он широко применяется за рубежом при Т-клеточной лимфоме кожи [Knobler R.,1995], ряде аутоиммунных заболеваний (пузырчатке, системной склеродермии) и хронических дерматозов (атопическом дерматите, псориазе и др.) [Kerdel F.A. et al. 2005]. Однако его эффективности при КПЛ посвящены лишь немногочисленные исследования, основанные на отдельных наблюдениях [Kunte C. еt al. 2005; Marchesseau-Merlin A.S. et al. 2008].
Цель исследования.
Повышение эффективности лечения больных с типичным распространенным красным плоским лишаем на разных стадиях его развития путем включения в программу терапии метода экстракорпоральной фотохимиотерапии.
Задачи исследования.
-
Изучить особенности клинической картины типичного красного плоского лишая в Московском регионе, оценив частоту при нем кольцевидных, линейных, зостериформных высыпаний, эритродермии и overlap-синдромов с красной волчанкой, буллезным пемфигоидом, склероатрофическим лихеном.
-
Определить роль и значение Т-клеточного иммунитета, а также влияние нарушения межклеточного взаимодействия на основании корреляционного анализа линейных, активационных и адгезивных клеточных маркеров в патогенезе подострого (продолжительностью до 6 месяцев) и хронического красного плоского лишая (более 6 месяцев ).
-
Изучить клиническую эффективность экстракорпоральной фотохимиотерапии, в сравнении с проспективным контролем, у больных типичным подострым (до 6 месяцев) и хроническим (более 6 месяцев) красным плоским лишаем на основании международных стандартов эффективности.
-
Определить механизм иммунотропного действия экстракорпоральной фотохимиотерапии при типичном красном плоском лишае на основании экспрессии маркеров активации (HLA-DR+ и CD25+) и интегриновой молекулы адгезии (СD11b+) на эффекторных цитолитических Т-лимфоцитах и естественных киллерных клетках (СD16).
Научная новизна.
-Проведена оценка клинических особенностей КПЛ у пациентов Московского региона и частоты при нем кольцевидных, линейных и зостериформных высыпаний, эритродермии, а также overlap-синдромов с красной волчанкой, буллезным пемфигоидом и склероатрофическим лихеном
- Выявлены существенные различия в иммунопатогенезе подострого и хронического КПЛ.
- Выявлена высокая клиническая эффективность и патогенетическая обоснованность ЭФХТ в комплексном лечении типичного подострого и хронического КПЛ.
Практическая значимость работы.
Иммунологически обоснована правомочность выделения подострой (до 6 месяцев) и хронической (более 6 месяцев) стадий типичного КПЛ.
Разработан эффективный, патогенетически обоснованный метод комплексной терапии подострого и хронического типичного КПЛ с применением ЭФХТ.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. В подострой стадии КПЛ иммунные нарушения характеризуются преимущественно агрессией со стороны аутореактивного клона цитолитических Т-лимфоцитов, что подтверждается присутствием на них молекул ГКГ HLA-DR+ (r=0,82; р <0,05). В хронической стадии преимущественное значение в развитии иммуновоспалительного процесса приобретают естественные киллерные клетки (CD16+) с сохранением их возможности для трансэндотелиальной миграции к кератиноцитам.
2. Использование при КПЛ метода ЭФХТ в комплексе с рутинной терапией существенно повышает эффективность последней в отношении как ближайших, так и отдаленных результатов.
3. ЭФХТ в комплексе с рутинной терапией подострого КПЛ сопровождается уменьшением интенсивности и количества аутоагрессивного клона цитолитических Т-лимфоцитов, а также снижением их способности к миграции через сосудистый эндотелий. При хроническом КПЛ – происходит уменьшение выраженности агрессии со стороны естественных киллерных лимфоцитов (CD16+) с сохранением их способности к трансэндотелиальной миграции.
Личный вклад.
Автору принадлежит ведущая роль в анализе, обобщении, научном обосновании полученных результатов и выборе направления исследования. Автором лично осуществлялось ведение 80 больных типичным КПЛ и наблюдение пациентов после проведения сеансов ЭФХТ, проводилась работа с архивными материалами (132 истории болезни), забор клинического материала для проведения гистологического и иммуногистохимического исследований, статистическая обработка, интерпретация и обобщение полученных результатов.
Вклад автора также был решающим и во внедрении результатов исследования в практику.
Внедрение результатов исследования.
Полученные результаты внедрены в практическую деятельность отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Московского областного кожно-венерологического диспансера и используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского и кафедре кожных и венерических болезней ФППО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции дерматовенерологов Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы дерматовенерологии и дерматоонкологии » (Москва, МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, 2012-2014 гг.), научно-практической конференции «Новые лекарственные препараты в практике дерматовенеролога» (Москва, ПМГМУ им. И. М. Сеченова, 2013г.), Московском областном научно-практическом обществе дерматовенерологов (Москва, 2014 г.).
Апробация диссертации состоялась 17 апреля 2014 года на заседании кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем работы.
Особенности клинической картины типичного КПЛ
Элементы типичного КПЛ могут располагаться особым образом, в связи с чем выделяют: кольцевидную, линейную, зостериформную, ладонно 19 подошвенный, генитальный, инверсный КПЛ, а также оverlap-синдром с дискоидной красной волчанкой, буллезным пемфигридом и оverlap-синдром со склероатрофическим лихеном [89]. В частности, при инверсном КПЛ отдельные красно-коричневые папулы или узлы поражают подмыщечные впадины, кожу под молочными железами, паховые складки; реже- подколенные ямки и локтевые сгибы. Вовлечение в патологический процесс наружных половых органов часто происходит при распространенном КПЛ. У мужчин половые органы поражаются примерно в 25% и преимущественно в молодом возрасте. Поражаются головка, кожа полового члена члена и мошонка. при этом со временем высыпания могут приобретать кольцевидную форму, но типичные для вульварного КПЛ белые полосы отмечаются редко. У женщин поражается вульва, перианальная область и (в отличие от склероатрофического лихена) влагалище [85]. Вульварные высыпания представлены мелкими полигональными папулами, которые могут сочетаться с очагами лейкоплакии или эритроплакии, иногда - с распространенным десквамативным вагинитом [89] и сопровождаются интенсивным зудом, болью, дизурией, диспареунией и болезненной дефекацией. Эти симптомы часто относят к другим причинам ( например, кандидозу и менопауза) и КПЛ остается не диагностированным многие годы. В целом же поражения слизистой оболочки половых органов: половых губ и влагалища клинически не отличаются от таковых при КПЛ слизистой оболочки полости рта и нередко сочетаются с ними, но в отличие от них, сопровождаются выраженной непрочностью слизистой оболочки, эритемой, зудом или жжением; иногда развивается стеноз влагалища или уретры [120]. Кольцевидная разновидность КПЛ встречается в 10% случаев [15] и формируется путем: 1) обратного развития центра крупных бляшек (с атрофией и западением) и сохранения по периферии слегка приподнятого валика из неразрешившегося инфильтрата (кольцевидно-атрофическая разновидность), 2) слияния мелких папул с образованием дуг, колец, гирлянд (lichen ruber planus marginatus s. serpiginosus), внутри которых сохраняется клинически нормальная кожа; 3) слияния папул в бляшку с последующим разрешением центрально расположенных папул, оставляющих после себя пигментацию. Диаметр кольцевидных очагов варьирует от 1 до 3 см, количество – от 1 до 10. Они чаще встречаются на половых органах (головке полового члена и мошонке), в крупных складках кожи, на спине, ягодицах, боковых поверхностях туловища, шее, веках и практически в каждом случае сочетаются с папулами типичного КПЛ [36] и редко бывают изолированными [130].
Линейный КПЛ представлен слившимися в одну линию папулами или группами папул, расположенных по прямой линии (например, от подмышечных впадин до пояса или нижних конечностей) или линиям Блашко; очаг поражения также может иметь бородавчатую поверхность. Линейный КПЛ возникает спонтанно, чаще локализуется в области конечности (реже - на лице) и может быть связан с анатомическими структурами, располагаясь по ходу нервных сплетений, кровеносных или лимфатических сосудов [81]. Его не следует путать с расположенными линейно папулами КПЛ в местах экскориаций, предствляющих собой результат феномена Кебнера.
Зостериформный КПЛ («сегментарный», «радикулярный») трактуется как феномен Кебнера, индуцированный предшествующей инфекцией Herpes zoster [81;111; 150; 193].
Overlap- синдром с КПЛ (пемфигоидный КПЛ) – редкая форма КПЛ, представленная комбинацией КПЛ и буллезного пемфигоида поражает взрослых и детей. Средний возраст его начала составляет около 44 лет, соотношение мужчин и женщин - примерно 3:2 [133].
Считается, что это приобретенный аутоиммунный дерматоз, лихеноидные элементы которого обычно предшествуют буллезным и везикулезным высыпаниям /96/. Описано его развитие на фоне ПУВА– терапии, облучения УФ-В, приема внутрь каптоприла [86] циннаризина, нестероидных противовоспалительных препаратов [152], а также на фоне злокачественных новообразований [124].
Полостные элементы при нем характеризуются плотной покрышкой и прозрачным желтоватым содержимым. Они редко возникают на непораженной коже и слизистой оболочке полости рта и чрезвычайно редко поражают слизистые оболочки носоглотки, пищевода, неба, вульвы, век и конъюнктивы глаза [203]. Излюбленная локализация – дистальные отделы конечностей, в первую очередь - ладони и подошвы, где пузырьки и пузыри с прозрачным содержимым обычно возникают в местах травмы кожи, а через 2-8 недель в этих местах развиваются зудящие папулезные высыпания, как при типичном КПЛ [162;187]. Процесс часто течет остро, бывает генеразизованным и длительно персистирует. При нем могут быть папулы с центральной атрофией и тотальная дистрофия ногтевых пластинок: продольные гребешки, дистальное расщепление, ногти со временем становятся тонкими и ломкими. У детей изменения ногтей со временем проходят без лечения. При гистологическом исследовании полостного элемента выявляются признаки КПЛ (ортокератоз, гиперкератоз, неравномерное утолщение зернистого слоя, гранулез, акантоз, вакуольная дистрофия базального слоя, коллолидные тельца Сиватта в дерме) с субэпидермальными щелями, сохраненным базальным слоем и наличием в пузырном содержимом нейтрофилов, лимфоцитов и/или эозинофилов. В реакции ПИФ выявляют линейные депозиты IgG n C3 компонент комплемента в lamina lucida базальной мембраны, также могут присутствовать IgM и фибрин; тельца Сиватта, разбросанные вдоль сосочкового слоя дермы, окрашиваются на IgG и М или фибриноген [28; 82]. При оverlap-синдроме c красной волчанкой очаги поражения чаще располагаются в дистальных отделах конечностей, имеют синюшно-красный или фиолетовый цвет, с гипо- и гиперпигментацией, телеангиэктазиями, атрофией, иногда с бородавчатыми, буллезными высыпаниями, шелушение незначительное, фолликулярный гиперкератоз непостоянен и нередко выражен [100;116]. При гистологическом исследовании закономерно выявляются признаки обоих заболеваний, а при ПИФ – патогномоничнеое для красной волчанки линейные депозиты IgG вдоль базальной мембраны и типичные для КПЛ зернистые отложения IgМ, фибриноген и С3 компонента комплемента в сальных железах [75].
Клинический осмотр пациентов
Осмотр пациентов проводился автором диссертационной работы совместно с высококвалифицированными врачами дерматовенерологами, ведущими лечебно - консультативный прием больных в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ. Врачи, проводящие диагностику и лечение пациентов с КПЛ, прошли специализированную подготовку по лечению данной патологии в ведущих российских медицинских образовательных учреждениях (ПМГМУ им.И.М. Сеченова и др.). При проведении клинико-лабораторных исследований соблюдались этические принципы, принятые Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000 edit.).
Проводимое во время исследовательской работы клиническое обследование больных, а также все полученные клинические и лабораторные данные заносились в индивидуальную регистрационную карту пациента, разработанную на кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ.
Клиническое обследование пациентов осуществлялось по общепринятой схеме и включало: сбор паспортных данных, выявление жалоб пациента, тщательный сбор анамнеза жизни и анамнеза заболевания, осмотр преддверия полости рта и непосредственно полости рта. Помимо этого, все пациенты направлялись на консультацию к другим специалистам (терапевту, кардиологу, гинекологу, невропатологу, урологу, эндокринологу, гастроэнтерологу и стоматологу), для исключения тяжелой декомпенсированной соматической патологии, не позволяющей им принимать участие в исследовательской работе. Полученные данные регистрировались в протоколах клинического исследования.
Во время сбора анамнеза болезни выяснялись жалобы пациента, связанные с зудом, чувством напряжения, стянутости, жжения, кожи. Изменение цвета, формы, рельефа, необычный вид слизистой оболочки полости рта; также оценивались общие жалобы больного – недомогание, субфебрильная температура тела, раздражительность, нарушение сна, беспокойство, наличие и эффективность проводимого ранее лечения, сроки возникновения рецидивов. При сборе анамнеза жизни и анамнеза заболевания особое внимание уделялось сопутствующей патологии, перенесенным ранее заболеваниям, наличию аллергических реакций, роду деятельности пациента и связанным с ней профессиональными вредностями, вредным привычкам. У женщин регистрировалась регулярность менструального цикла, время наступления менопаузы.
Осмотр больных проводили в естественном и искусственном освещении. Внешний осмотр включал в себя оценку внешнего вида пациента, тщательно осматривались кожные покровы (цвет, наличие патологических элементов на коже, состояние ногтевых пластин, волосистой части головы) и красная кайма губ (цвет, осмотр углов рта, наличие патологических высыпаний), оценивалось состояние регионарных лимфатических узлов. После оценки состояния полости рта выявлялись наличие или отсутствие первичных морфологических элементов: пятно (эритема, розеола, геморрагии, телеангиоэктазии, пигментные пятна), папула (круглая, полукруглая, остроконечная, овальная, кеглеобразная), пузырек (характер содержимого – серозное, гнойное, геморрагическое, смешанное), бляшка, бугорок, узел, пузырь (состояние покрышки), киста (содержимое кисты), а также вторичные патологические элементы (эрозия, язва, корка, рубец).
При осмотре преддверия полости рта и слизистой оболочки оценивались цвет (бледно-розовый, желтушный, цианотичный, бледный, наличие гиперемии), влажность (сухая, умеренно увлажненная, влажная), консистенция (нормальная, слегка отечная, отечная), гигиеническое состояние, наличие или отсутствие ортопедических конструкций, особое внимание обращалось на наличие металлических протезов из разнородных металлов. Внимательно осматривался язык пациента, есть ли на нем отпечатки зубов, налет. Оценивалось состояние нитевидных сосочков (в нормальном состоянии, гипертрофированы, сглажены). Диагноз КПЛ устанавливался на основании жалоб, анамнеза и визуальной оценки патологического процесса с использованием классификации С.И.Довжанского и Н.А.Слесаренко (1991), и А.Л. Машкиллейсона (1984), усовершенствованной на кафедре кожных и венерических болезней МГМСУ им. А.И. Евдокимова в 2002 году.[57]
Для оценки тяжести состояния и оценки эффективности лечения использовался разработанный А.А. Шахнович (2012) индекс тяжести процесса при КПЛ-ILP (Index Lichen Planus).
ILP рассчитывался с учетом основных клинических проявлений заболевания: папулы, инфильтрация, эритема, ксероз, гиперкератоз, с учетом распространенности процесса, вовлечения в патологический процесс ногтевых пластин и поражения слизистых. Расчет ILP осуществлялся суммацией баллов, максимальное значение -24 балла. На табл. 5 указан расчет тяжести течения заболевания с учетом индекса ILP.
Метод выявления фиксированных антител
Взятие крови проводили из вены локтевого сгиба после соответствующей обработки кожи в стерильные пробирки с раствором гепарина (500 ед./мл). Гепаринизированную кровь разводили в 2 раза средой 199 и наносили на Ficoll-Paque (Pharmacia, Sweden) в следующих соотношениях: 3 объема лейкоцитарной массы на 1 объем фиколла и центрифугировали при 1500 оборотах в минуту 45 мин. при комнатной температуре. Мононуклеарные клетки собирали из интерфазы пастеровской или автоматической пипеткой. Клетки отмывали первый раз в среде 199 20 мин при 1500 оборотах в минуту, а затем еще 2 раза по 10 минут при 1000 оборотах в минуту при комнатной температуре. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Для иммунофенотипирования клеток периферической крови больных применяли широкую панель моноклональных антител серии ICO (производства НПЦ “МедБиоСпектр”, Россия). Проточную цитофлуорометрию проводили в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции. Для этого 5х105 отмытых в PBS клеток в объеме 50 мкл инкубировали с 20 мкл МКА при комнатной температуре в течение 30 мин. После однократной отмывки в PBS центрифугированием в течение 7 минут при 1500 об/мин, клетки инкубировали при 4С в течение 30 мин с 20 мкл FITC-меченной антисыворотки барана против иммуноглобулинов белой мыши (производство НПЦ “МедБиоСпектр”). Затем клетки дважды отмывали и ресуспендировали в PBS, содержащий 1% формалин и 0,1% азид натрия. Экспрессию антигенов на лимфоцитах определяли на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson) с использованием панели моноклональных антител (BeckmanCoulter) с реактогенной направленностью против большого спектра дифференцировочных антигенов и маркеров активации: CD3+, CD4+, CD8+, CD16+,CDllb+, HLA-DR+, CD25+, CD38+.
В каждой пробе анализировали от 5000 до 10000 событий в зависимости от цели исследования. Для анализа экспрессии антигенов на определенных популяциях клеток (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы) устанавливали “окна дискриминации” или гейты, которые соответстсовали определенным физическим параметрам. За экспрессию маркера принимали клетки, дающие сигнал флюоресценции с интенсивностью выше порогового значения.
Антитела выявляли при помощи реакции прямой иммунофлюоресценцими с использованием моноспецифических люменисцирующих сывороток против IgG, IgA, IgM и Сз компонента комплемента ( НИИ ЭЭМ им Н.Г.Гамалеи).
Серийные криостатные срезы помещали на предметное стекло и подсушивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем исследуемый материал промывали в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером, рН 7,0-7,4 в течение 10 минут для удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывали люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против IgG, IgM, IgA и Сз-компонента комплемента в течение 30 минут. Затем вновь промывали в изотоническом растворе хлорида натрия с фосфатным буфером в течение 10 минут и помещали под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. С целью предохранения препарата от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляли кристаллик пара-фенилендиамина. Для контроля одновременно проводили изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином в световом микроскопе.
Показатели, полученные в ходе исследования, были внесены в электронную базу данных. Полученные результаты обрабатывались статистическими методами cтатистического и корреляционного анализа с использованием пакета анализа MS Office 2007 для Windows 7 и программы Statistica v. 6.0.
Благодаря методам вариационной статистики определялось среднее арифметическое (М), ошибка среднего арифметического (m) и вероятность их отличия (р). Достоверность различий между двумя группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Статистически значимым считался Р95% (P0,05; P0,01). Точную значимость различий оценивали по методу Фишера.
Иммунологическая характеристика больных типичным красным плоским лишаем
Исходя их данных литературы о зависимости характера иммунных нарушений от сроков КПЛ [132] и исходя из подразделения КПЛ в зависимости от продолжительности болезни на подострый (до 6 месяцев) и хронический (более 6 месяцев) [24], иммунологическое обследование проводилось в двух группах пациентов, страдавших подострым типичным (продолжителностью до 6 месяцев- I группа из 20 больных) и хроничнеским (продолжительностью более 6 месяцев -II группа из 20 больных) типичным КПЛ. Таблица 12. Экспрессия линейных, активационных и интегриновой молекулы адгезии у больных КПЛ обоих групп (M+m) Обследуемые группы Больные КПЛ Как видно из табл.12, абсолютное количество СD3+ клеток было увеличено уже на начальных этапах КПЛ (1,33 + 0,14х10/л, р 0,05 при норме 0,75+0,01х109/л); увеличение сохранялось и на более позднем этапе болезни, хотя и было недостоверным( 1,23+0,24, р 0,05) (рис. 35).
- р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы I в абсолютных значениях. Рис. 35. Экспрессия CD3+ у пациентов I и II групп
При этом абсолютное повышение уровня Т-лимфоцитов было обусловлено как за счет хелперной, так и за счет супрессорной субпопуляций этих клеток, но в процессе прогрессирования болезни абсолютное количество CD8+ клеток имело тенденцию к снижению(с 0,74+0,14х10/л, р 0,05, на ранних этапах до 0,69+0,1510/л, р 0,05, на более поздних этапах при норме 0,31+0,009) (рис. 36).
- р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы I в абсолютных значениях. - р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы II в абсолютных значениях. Рис. 36. Экспрессия CD8+ у пациентов I и II групп
Экспрессия HLA-DR+ была не только выше вначале болезни, но и существенно повышалась по мере ее прогрессирования (HLA-DR+ при норме 0,12+0,006х109/л в I группе составляла 0,34+0,14х109/л, р 0,05, а во II 0,31+0,11х109/л,р 0,05 )., а экспрессия CD25+ была в одинаковой степени повышена на обоих этапах болезни(при норме 0,05+0,002х109/л в подостром периоде составляла 0,38+0,19х109/л,р 0,05, а на более позднем этапе 0,27+0,09х109/л, р 0,05)(рис. 37,38).
- р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы I в абсолютных значениях. - р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы II в абсолютных значениях. Рис. 37. Экспрессия HLA-DR+ у пациентов I и II групп
- р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы I в абсолютных значениях. - р 0,05 между здоровыми донорами и пациентами группы II в абсолютных значениях. Рис. 38. Экспрессия CD25+ у пациентов I и II групп С целью уточнения механизмов межклеточного взаимодействия на разных стадиях КПЛ нами проводился корреляционный анализ экспрессии линейных маркеров с молекулами активации и адгезии в каждой из групп пациентов. Наличие высокой степени корреляционной зависимости между экспрессией молекул второго класса гистосовместимости HLA-DR+ и экспрессией цитолитических лимфоцитов (CD8+) (г=0,82;р 0,05) (рис.39) в подострой стадии КПЛ не только указывало на повышенное присутствие этих клеток на начальном этапе заболевания, но и на повышенную активность этих клеток, что свойственно клону аутореактивных Т-лимфоцитов. У больных II группы такая зависимость была менее выражена.
Достоверная корреляция (r=0,58, p 0,05) между CD8+ и интегриновой молекулой адгезии CD11b+ вне зависимости от срока болезни свидетельствовала о возможности трансэндотелиальной миграции аутореактивных Т-лимфоцитов (CD8+) к клеткам-мишеням - кератиноцитам. Однако в 1 группе была отмечена более выраженная степень корреляционной зависимости этих показателей (r=0,69, p 0,05), указывающая на более агрессивный аутоиммунный процесс со стороны аутореактивного клона цитолитических Т-лимфоцитов в подострой стадии заболевания (рис.40).
Полученные данные позволяют предположить, что биохимическая модификация антигенной структуры кератиноцитов на начальных этапах КПЛ приводит к индукции специфического клона CD8+ Т-лимфоцитов с агрессией против собственных клеток. Нами показано, что эти клетки способны мигрировать через сосудистый эндотелий благодаря экспрессии на их мембране интегриновой молекулы адгезии CD11b+, атакуя клетки-мишени - кератиноциты, индуцируя в них процессы апоптоза.
Дальнейшее сдерживание аутоагрессивной атаки цитолитического клона лимфоцитов (о чем свидетельствует уменьшение степени выраженности корреляционной зависимости HLA-DR+/CD8+), возможно, происходит за счет увеличения количества и активности T-reg клеток, имеющих фенотип CD3+CD4+CD25hlehFOXP3, которые поддерживают периферическую иммунологическую толерантность, вызывая апоптоз аутореактивных клонов. Косвенным подтверждением этого может служить отмеченное нами увеличение экспрессии молекулы CD25+ (рецептора к интерлейкину-2), чаще всего присутствующей на Treg клетках, что подтверждается рядом других авторов [155].
В противоположность этому, абсолютное количество естественных киллерных лимфоцитов (CD16+) возрастало по мере перехода заболевания в хроническую стадию. Так, если в I группе это увеличение было незначительным (0,37+0,16х109/л, при норме 0,23+0,018х109/л, р 0,05), то во II– достоверным (0,5+0,16х10/л, р 0,05)(рис.41).
