Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
2.1. РОСТ И ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ ДРОЖЖЕЙ 9
Физиология метаболизма и роста дрожжей 10
Регуляция энергетического метаболизма дрожжей 11
Особенности строения дыхательного аппарата дрожжевой клетки 18
2.2. РЕАКЦИЯ ДРОЖЖЕЙ НА ТЕПЛОВОЙ ШОК И СВЯЗАННЫЕ С
НЕЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ ФУНКЦИИ 23
Митохондрии - основной источник АФК в дрожжевой клетке 24
Изменения в углеводном метаболизме 28
Синтез и функции белков теплового шока 30
Hspl04 - ключевой белок толерантности дрожжей
S. cerevisiae к стрессу 41
2.3. РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ СТРЕССОВЫХ ГЕНОВ
S.CEREV1SIAE 47
Элемент теплового шока (HSE) и фактор теплового шока (HSF) 47
Стрессовая реакция и цАМФ-зависимая протеинкиназа А 50
2.4. ВЫВОДЫ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ, ЦЕЛЬ И
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 58
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61
ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ШТАММЫ ДРОЖЖЕЙ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ 61
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОСТОВЫХ ПАРАМЕТРОВ И ТЕМПЕРАТУРНАЯ ОБРАБОТКА 62
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЫХАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ ИНКУБИРОВАНИЯ И
ДЕЙСТВИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ 63
ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ НА ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ 64
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАТАЛАЗНОЙ АКТИВНОСТИ 65
ВЫДЕЛЕНИЕ ДРОЖЖЕВОГО БЕЛКА 65
ОДНОМЕРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 66
ОКРАСКА И ОБЕСЦВЕЧИВАНИЕ ГЕЛЕЙ 66
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВ 66
ИММУНОБЛОТТИНГ 67
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ 68
ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ 68
3.13. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 68
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69
4.1. ТЕМПЕРАТУРНЫЕ ПАРАМЕТРЫ РОСТА ДРОЖЖЕЙ 69
4.1.1. Температурные параметры роста дрожжей и их толерантность
к тепловому шоку 70
4.1.2. Влияние тиамина на термоустойчивость и термотолерантность
дрожжей/), vanrijiae 75
4.2. ЗАВИСИМОСТЬ ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТИ ОТ
ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЙ В ДРОЖЖЕВОЙ
КЛЕТКЕ 78
4.2.1. Роль Hspl04 в развитии термотолерантности дрожжей
S. cerevisiae 78
Термотолерантность дрожжей S. cerevisiae в зависимости от источника углерода в среде культивирования 82
Индукция синтеза Hspl04 в зависимости от функционирования митохондрий в клетках S. cerevisiae 86
Сравнение термотолерантности S. cerevisae родительского типа и
мутанта дыхательной недостаточности 89
ИЗМЕНЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ ДЫХАНИЯ ДРОЖЖЕЙ ПРИ ПОВЫШЕНИИ ТЕМПЕРАТУРЫ. РОЛЬ КАТАЛАЗЫ В ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТИ ДРОЖЖЕВОЙ КЛЕТКИ 94
ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ЭЛЕКТРОН-ТРАНСПОРТНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ НА ДЫХАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ 100
Действие азида натрия и цианида натрия на дыхательную активность D. vanrijiae и R. rubra 101
Действие азида натрия и цианида натрия на дыхательную активность S.cerevisiae и С.albicans 104
4.5. ДЕЙСТВИЕ ИНГИБИТОРОВ ДЫХАНИЯ НА
ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬ ДРОЖЖЕЙ 107
Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей D. vanrijiae 108
Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей R. rubra 108
Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей S. cerevisiae 112
Действие ингибиторов дыхания на базовую термотолерантность дрожжей С. albicans 119
Механизм действия ингибиторов дыхания на термотолерантность дрожжей 121
Действие азида натрия на индуцированную термотолерантность S. cerevisiae 126
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135
ВЫВОДЫ 140
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 142
Введение к работе
Дрожжи являются одними из первых микроорганизмов, которые начал использовать человек. В Ветхом Завете (Исход, Главы 12 и 13) упоминается о закваске, вероятно, смеси различных видов дрожжей и бактерий, которую и поныне используют для выпечки хлеба в удаленных местностях. По этим же историческим причинам вид дрожжей Saccharomyces cerevisiae занял доминирующее положение на научной сцене и для многих людей стал синонимом дрожжей вообще.
Дрожжи очень широко распространены в природе и окружающей человека среде, и S. cerevisiae является одним из 800 описанных видов дрожжей (Kurtzman, Fell, 1998). Сам термин «дрожжи» таксономического значения не имеет. Под «дрожжами» в настоящее время понимают все грибные организмы, находящиеся в одноклеточной форме в ростовой фазе и размножающиеся преимущественно почкованием. Одноклеточные грибы, которые принято называть неноменклатурным термином «дрожжи», в зависимости от наличия и типа полового процесса распределяются по трем классам высших (септированных) грибных организмов: Ascomycetes, Basidiomycetes и Fungi Imperfecti, или Deuteromycetes (Рейвн и др., 1990).
В качестве объекта исследований для специалистов в области биохимии, генетики и молекулярной биологии дрожжи обладают рядом преимуществ и уникальных свойств. Дрожжи - одноклеточные микроорганизмы, растущие на простых по составу средах; к ним применимы почти все методы микробиологических исследований. Вместе с тем дрожжи - простейшие эукариотические организмы, обладающие митохондриями -наиболее совершенной системой превращения энергии окисления субстратов в АТФ и другие формы энергии, используемые клеткой. В этом отношении дрожжи с их полноценным дыхательным аппаратом близки клеткам высших организмов и значительно отличаются от прокариотов. Некоторые виды дрожжей (например, S. cerevisiae) способны расти как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Лабильность дрожжевой клетки, ее зависимость от
6
внешних условий среды и многообразие путей адаптации являются
характерными чертами, свойственными микроорганизмам. Так, если
половина жизни митохондрий растений составляет 5-10 дней, то половина
жизни самой дрожжевой клетки - 1-3 часа. Всего лишь 6-8 часов необходимо
для развития полноценных митохондрий с нормальными кристами при
переходе дрожжей S. cerevisiae от анаэробных условий к аэробным. Однако
появление ферментов дыхательной цепи, отсутствующих у анаэробно
выращенных дрожжей, может быть ясно обнаружено уже через 10-30 мин
аэробной адаптации. Поскольку клетки S. cerevisae могут существовать,
получая энергию не только за счет дыхания, но и за счет брожения, то можно
получать штаммы с разнообразными митохондриальными
(цитоплазматическими) мутациями, причем даже такими, которые полностью блокируют способность клетки к дыханию, что открыло путь для изучения генетики митохондрий (Звягильская, Котельникова, 1991).
Дыхательная цепь дрожжевых митохондрий построена по тому же типу, как у высших организмов и, в частности, содержит классический набор цитохромов. Тем не менее, она обладает и особенностями, отличающими ее от дыхательной цепи растений и млекопитающих. По строению дыхательной цепи разных видов дрожжей можно проследить эволюционное усложнение организации окислительного фосфорилирования: от двух точек сопряжения энергии у факультативных анаэробов (S. cerevisiae) до более совершенного дыхательного аппарата у дрожжей с выраженным аэробным типом обмена (Звягильская, Котельникова, 1991).
Митохондрия - ключевая органелла, определяющая жизнь и смерть клетки. Являясь основным источником энергии для аэробно живущих организмов в нормальных условиях, митохондрии приобретают особое значение для жизнеспособности клетки в стрессовых условиях, в частности при тепловом шоке. В пользу этого утверждения говорит тот факт, что предотвращение денатурации и аггрегации важнейших белковых структур клетки, а также восстановление поврежденных действием высокой
температуры молекул белков осуществляется АТФ-зависимыми шаперонами (Trott, Morano, 2003).
Тепловой шок часто сопровождается повышением концентрации активных форм кислорода (АФК), источником которых являются митохондрии. По этой причине усиление дыхательной активности митохондрий при тепловом шоке может иметь отрицательный результат для клетки. Но при этом в клетке существует многоуровневая защитная система, которая индуцируется при стрессовом воздействии и предотвращает накопление АФК, и подвергает деградации уже появившиеся (Skulachev, 2001).
К настоящему времени в литературе имеются лишь косвенные данные, позволяющие предполагать связь функциональной активности митохондрий и термотолерантности клетки. Показано, что во время теплового шока снижается уровень АТФ в клетке (Findly et al., 1983; Currie et al.,1999; Mallouk et al., 1999; Kabakov et al., 2002), и что митохондриальные ингибиторы вызывают индукцию тех же генов, что и тепловой шок (Ashburner, Bonner, 1979). Но до сих пор нет работ, обобщающих результаты исследований о роли митохондрий при тепловом шоке.
Большинство исследований, касающихся роли митохондрий в термотолерантности дрожжевой клетки, проведены на лабораторных штаммах S. cerevisiae. Результаты этих работ противоречивы и не дают полного представления о связи между термотолерантностью дрожжевой клетки и функциональной активностью митохондрий (Mitchel and Morrison, 1983; Weitzel et al., 1987; Patriarca and Maresca, 1990; Sanchez et al., 1992). Одной из возможных причин этих противоречий может быть наличие у S. cerevisiae альтернативного пути получения энергии - брожения. По этой причине в данной работе мы изучили роль дыхания при тепловом шоке, используя, кроме S. cerevisiae, и другие виды дрожжей, различающиеся по типу энергетического метаболизма.
При изучении процессов термотолерантности дрожжей S. cerevisiae основным предметом наших исследований был белок теплового шока с мол. массой 104 кД (Hspl04). Известно, что этот белок является ключевым компонентом защитной системы дрожжевой клетки S. cerevisiae от повреждающего действия высокой температуры и других стрессовых воздействий. К настоящему времени хорошо изучены структура, функции и локализация этого белка (Schirmer et al., 2001). Кроме дрожжей, гомологи Hspl04 с аналогичными функциями обнаружены в клетках растений, бактерий и у простейших (Lee et al., 1994; Schirmer et al., 1994, 1996; Singla et al., 1997; Wells et al, 1998; Keeler et al., 2000; Campbell et al., 2001; Eriksson et al., 2001; Nieto-Sotelo et al., 1999, 2002). Последние исследования дают основания предполагать, что Hspl04 участвует в регуляции дыхания в клетках S. cerevisiae (Lee et al., 1998; Lee et al., 2001). Чтобы доказать или опровергнуть эти предположения, в нашей работе мы попытались установить зависимость между синтезом Hspl04 и связанной с ним термотолерантности дрожжевой клетки и функционированием митохондрий.
Автор выражает большую признательность и благодарность своим научным руководителям д.б.н., профессору Войникову Виктору Кирилловичу и к.б.н. Рихванову Евгению Геннадьевичу за постоянное внимание к данной работе, а также к.б.н. Варакиной Н.Н., Русалевой Т.М., д.б.н. Боровскому Г.Б. за помощь в проведении ряда экспериментов, д.б.н. Побежимовой Т.П. и д.б.н. Колесниченко А.В. за конструктивные замечания при написании диссертации. Кроме того, автор благодарит весь коллектив лаборатории физиологической генетики за дружеское участие и поддержку.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
