Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Экскреция органических веществ водорослями . 9
Глава 2. Липиды водорослей .
2.1. Биологическая роль липидов 15
2.2 Состав липидов сине-зеленых водорослей 17
2.3. Липиды, обнаруживаемые в культуральной жидкости водорослей 28
Глава 3. Возможные причины и пути выделения органических веществ и экологическая роль метаболитов в биоцинозах 34
Экспериментальная часть
Глава 4. Объекты и методы исследования- 41
Результаты исследований
Глава 5.1. Краткая характеристика объектов исследования 54
5.2. Ростовые характеристики сине-зеленых водорослей A. variabilis и A.nidulans 55
Глава 6. Выделение органических веществ в среду культурами A. variabilis и A.nidulans 60
Глава 7. Биологическая активность культуральной жидкости A. variabilis 65
Глава 8. Выделение веществ липиднои природы сине-зелеными водорослями
8.1. Содержание липидов в среде сине-зеленых водорослей 70
8.2. Состав внеклеточных веществ липиднои природы в фильтратах A. variabilis и A.nidulans 73
8.3. Исследование жирнокислотного состава суммарных липидов A.variabilis и A.nidulans 86
8.4. Изменение состава жирных кислот общих липидов сине-зеленых водорослей в процессе развития культур A. variabilis и A.nidulans 93
8.5. Исследование состава жирных кислот отдельных фракций липидов A. variabilis 100
8.6. Жирнокислотный состав липидов, выделяемых в среду клетками и сферопластами A.variabilis культивируемыми при пониженной температуре 109
Глава 9. Обсуждение результатов
Выводы 127
Список цитируемой литературы 128
Приложение
- Липиды, обнаруживаемые в культуральной жидкости водорослей
- Ростовые характеристики сине-зеленых водорослей A. variabilis и A.nidulans
- Состав внеклеточных веществ липиднои природы в фильтратах A. variabilis и A.nidulans
- Жирнокислотный состав липидов, выделяемых в среду клетками и сферопластами A.variabilis культивируемыми при пониженной температуре
Введение к работе
Эволюционно сине-зеленые водоросли являются древнейшей группой, которая и на сегодняшний день сохраняет доминирующее положение в некоторых биоценозах. Эта уникальная в морфологическом и физиологическом отношении группа водорослей распространена в природе повсюду: в планктоне стоячих и медленно текущих вод, в прибрежном бентосе, как эпифиты и обрастания на различных твердых субстратах, в горячих источниках, на поверхности снега и даже льда, на влажных скалах, на поверхности и в толще почвы, в симбиозе с другими организмами.
Сине-зеленые водоросли являются единственной группой организмов, сочетающих прокариотное строение клетки с фотосинтезом окси-генного типа. Они представлены одноклеточными, колониальными и нитчатыми формами, которые сходны между собой по ряду существенных признаков. Среди представителей Cyanophyta есть гетеротрофы, мик-сотрофы, автотрофы, азотфиксаторы и виды, не способные к азотфикса-ции, термофилы и мезофилы. Сине-зеленые водоросли /син.цианобакте-рии/ являются удобным объектом для биологических исследований, особенно при изучении процессов фотосинтеза и азотфиксации. Эта группа водорослей оказалась весьма перспективной в решении практических задач в народном хозяйстве, таких как повьшение плодородия почв, биологическая очистка бытовых и производственных вод, получение кормового и технического сырья, создание автономных систем жизнеобеспечения, основанных на регенерации воды и воздуха.
Многие явления в природе, например, "цветение" водоемов с последующим приобретением водой токсичности, а также состав и стабильность естественных водных биоценозов связывают с массовым распространением сине-зеленых водорослей, с их способностью выделять вещества, обладающие биологической активностью благодаря которым стабили- зируется состав окружающей и сопутствующей микрофлоры. Накопление в среде органических веществ в процессе роста водорослей происходит как в естественных популяциях, так и в лабораторных и промышленных культурах.
Внеклеточные продукты сине-зеленых водорослей представлены углеводами, белками, аминокислотами, нуклеиновыми кислотами, липида-ми и др. Исследовано влияние различных факторов на процесс выделения водорослями органических веществ в среду. Однако до сих пор дискутируется вопрос о происхождении внеклеточных продуктов водорослей и причинах выделения их в среду. Необходимость изучения этих причин имеет теоретическое и практическое значение. Выделяемые сине-зелеными водорослями и другими гидробионтами разнообразные органические соединения могут служить источником органического вещества в водной среде, играть регулирующую роль в формировании биоценозов, а также определять биологическую полноценность воды.
В составе внеклеточных продуктов водорослей присутствуют и вещества липидной природы. По современным данным в результате гидролитического расщепления и свободнорадикального окисления из липи-дов могут образовываться токсические соединения /кетоны, перекиси, гидроперекиси/, способные угнетать рост как самих водорослей-продуцентов, так и других сопутствующих организмов.
Несмотря на то, что ведется интенсивное изучение процессов выделения органических веществ водорослями как в природных популяциях, так и в лабораторных культурах, до сих пор многие вопросы не ясны. Недостаточно изучен липидный состав сине-зеленых водорослей, его зависимость от таксономического положения, физиологического состояния и возраста культуры, В литературе практически отсутствуют данные о составе и количестве внеклеточных липидов, выделяемых сине-зелеными водорослями в процессе развития культуры. Сведе- ния о внеклеточных продуктах экскретируемых водорослями малочисленны, а основные закономерности, природа и механизм их выделения неизвестны. В то же время при создании искусственных биоценозов, при разработке аквакультуры необходимо уметь контролировать продуктивность и процессы выделения органических веществ в окружающую среду растительными организмами, что невозможно без знания биохимии и физиологии экскреции, ее причин, а также закономерностей выделения. Изучение способности водорослей прижизненно выделять органические вещества в среду является составной частью исследований в области физиологии и биохимии водорослей. Учитывая необходимость решения данных вопросов, в задачу настоящей работы входило:
I/ Изучить процесс экскреции липидов в окружающую среду культурами Anabaena variabilis Kutz И Anacy.otis nidulans Richt.
2/ Исследовать вещества липидной природы во внеклеточных продуктах данных водорослей.
3/ Изучить жирнокислотный состав липидов в среде Anabaena variabilis и Anacystis nidulans и сравнить их с внутриклеточными липидами.
В работе показано, что сине-зеленые водоросли выделяют заметные количества органического вещества в среду, причем это количество зависит от вида водоросли и фазы развития. Установлено присутствие во внеклеточных продуктах веществ липидной природы, более половины которых составляют углеводороды. Впервые проведен сравнительный анализ жирнокислотного состава внеклеточных и клеточных липидов и установлены различия этого состава у изученных видов.
Результаты работы могут быть использованы при разработке комплекса мер по управлению массовым развитием водорослей в природных и искусственных экосистемах.
Настоящая работа выполнена на кафедре физиологии растений Биологического факультета. Автор приносит искреннюю благодарность д.х.н. Чижову О.С. и д.х.н. Терентьеву П.Б. за помощь при выполнении структурной идентификации н-нонадеценовой кислоты, гомолога ^З-фенилэтилового спирта и алифатического диола.
0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. ЭКСКРЕЦИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ВОДОРОСЛЯМИ.
Водоросли - один из главных продуцентов метаболитов в водоемах Горюнова, 1950/. По мнению Хайлова /1971/, способность экскретиро-ать и потреблять органические вещества играет значительную роль у изших растений: бактерий и водорослей. Необходимо отметить, что до астоящего времени нет единого взгляда по вопросу о происхождении экс-реции - выделения гидробионтами органических соединений во внешнюю реду.
Большинство исследователей связывают потери ассимилированного летками углерода с прижизненными выделениями водорослей /Горюнова, 950; Fogg, 1956, I962;Lewin, 1956; Hellebust? 1965/. Другие же счи-'ают, что источником органического вещества в воде является мёртвый :ли отмирающий фитопланктон /Duursma 1963; Marker» 1965/. Существует : такая точка зрения, что углерод в среде появляется в результате раз-іушения клеток в процессе мембранной фильтрации /Arthur ,Rigler 1967, Shindies', Halmgren 1971/.
Еще в начале XX века датский ученый Пюттер /putter , 1908/ пред-юложил, что водоросли способны прижизненно выделять органические верства в среду. Однако достаточно точных доказательств в пользу этой члпотезы в то время получено не было.
В настоящее время процесс экскреции органических веществ описан щя многих представителей синезеленых, зеленых, диатомовых водорослей I макрофитов / Nalewajko, 1966; Holm-Hanson, 1968; Sieburth , 1969; att , 1969; Pugg , 1971;Ai-Hasan 1975; Максимова, Горская, 1980; 'амбиев, Кирикова, 1981/. И сам факт такой экскреции считается уже )6iijenpH3HaHHbiM/Jellebust 1974/.
Прежде всего дискутируется вопрос о количестве вещества, выделяемого пресноводным фитопланктоном в окружающую среду. Здесь мнения раз- личались и приводимые значения колеблются от 1-Ю до 50-95% фиксированного углерода. Так, по наблюдениям Фогга над пресноводным фитопланктоном мезотрофного озера Уиндемир в Англии, количество экскре-тируемого вещества в течение 3-24 часов составляло 10-30% /иногда до 95%/ общей ассимиляции углерода. Близкие данные получены для пресноводного фитопланктона и в водохранилищах, где количество выделенного углерода составляло 7-50% от ассимилированного /watt , 1966; Saunders 1972/.
По литературным данным, величина экскреции органических веществ в экспериментах с лабораторными культурами водорослей колеблется в пределах 0,5-20% от ассимилированного углерода. В кратковременных опытах с 24 видами пресноводных водорослей радиоуглеродным методом обнаружено, что доля выделенного за I час углерода от всего фиксированного количества составляла у зеленых водорослей 0,5%; диатомовых 1,2% / Nalewaiko , 1966/, а у Cfrlorella из субарктического озера 2,8% /Nalewaiko et а:ц[963/. В культуральной среде 3-Ю суточных культур разных видов chioreiia обнаружено до 5-10% общего количества синтезированных клетками водорослей веществ /Пименова, Максимова, 1966 а/. По данным Шестерина /1972/ органическое вещество в среде 5-Ю суточных культур накапливалось в количестве 8-200 мг/л у Chio-rella vulgaris И 65-120 МГ/л у Scenedesmus obliguus.
На процесс выделения водорослями органических веществ оказывают влияние различные факторы окружающей среды. Весьма важные наблюдения сделаны Фоггом с соавторами над пресноводным фитопланктоном мезотрофного озера Уиндемир / Fogg et al., 1965/. Ими было обнаружено возрастание относительной скорости экскреции фитопланктона по направлению к ншкней границе эвфотнои зоны, которая обусловлена ослаблением интенсивности света на глубине при одновременном уменьшении уровня фотосинтеза. Подобные результаты при анализе экскреции органического углерода пресноводным фитопланктоном как в природных популяциях, так t в лабораторных культурах при очень низкой интенсивности света, ли-іитирующей фотосинтез, получены Ваттом / Watt, 1966/. По его мнению [изкая интенсивность света вызывает увеличение уровня экскреции в ре-іультате включения темновых процессов, подавляемых на свету.
Увеличение доли выделенного органического углерода от ассимили-юванного водорослями происходит не только при низких интенсивностях :вета, но и при высокой освещенности, ингибирующей фотосинтез. С воз-іастанием освещенности от 10700 до 75300 лк увеличивается относитель-гое количество внеклеточных продуктов от 0,5 до 19% у 24 видов водо-юслей в лабораторных культурах / Nalewaiko, 1966/. Предполагают, [то и в природе при сильном солнечном освещении /10.000-120.000 лк/ ікорость экскреции увеличивается в результате фотоповреждения клеток Hellebust, 1965/.
Показано, что имеет место увеличение уровня экскреции органи-[еских веществ водорослями в естественных симбиотических ассоциациях. Muscatine, 1967,Taylor, 1971/. Тейлор /Taylor,1971/ считает причи-юй увеличения экскреции водорослями изменение мембранной проницае-юсти клеток под действием веществ, выделяемых в окружающую среду сим-:иотическими грибами и беспозвоночными.
Литературные данные свидетельствуют о том, что экскреция органи-:еских соединений разными представителями фитопланктона в лабораторных 'словиях более низка, чем в природных популяциях. Вероятно, это связа-:о с более высокими концентрациями клеток фитопланктона в культурах :о сравнению с естественными популяциями. Впервые зависимость экскре-,ии органических веществ водорослями от концентрации клеток наблюдаюсь Шоггом /Fogg, 1952; 1958/. Им высказано предположение, что как в ультурах, так и в популяциях существует тенденция к установлению рав-ювесия между внутри- и внеклеточными метаболитами. Естественно, что азбавление культуры сдвигает это равновесие и вызывает увеличение 'КСКреЦИИ оргаНИЧеСКИХ Веществ Клетками ВОДОрОСЛеЙ /Nalewaiko et al.,
1963/. Однако исследования Ватта-/ Watt,1966/ показывают существова-ше более сложного равновесия, которое в большей степени определяется взаимодействием отдельных выделенных компонентов, чем просто их [онцентрацией.
При изучении экскреции органических веществ водорослями в провесе развития показано, что количество и состав выделенных продук-юв зависит от возраста. Так, Робергом отмечено, что в среде 4-суточ-[ых культур Chio.rella и Scenedesmus количество углерода составляет 1-3,8%, а в фильтратах Ю-суточных культур возрастает до 11,2-14-3% it сухого веса клеток /Roberg, 1930/. По данным Таутс /1966/, наи-юлыпее количество органических веществ в расчете на I клетку содер-;ится в среде накопительной культуры Chiorelia sp. при переходе в :тационарную фазу развития.
Обогащение среды органическими веществами у представителей зеле-[ЫХ водорослей Chiorelia pyrenoidosa И Chiorelia vulgaris проис-:одило интенсивнее в 3-5 раз в лаг-фазе и начале логарифмической фазы юста по сравнению со стационарной и концом логарифмической фазы /Пи-юнова, Максимова, 1966/, Аналогичные данные получены и для Frits^i-Lia tuberosa у которой в среде в лаг- и стационарной фазах доля глерода составляла 10-20% от сухого веса клеток. Отмечено также, что остав внеклеточных веществ на разных фазах развития данной водоросли азличен. Так, например, белок и углеводы обнаружены в среде в лога-ифмической фазе, тогда как органические кислоты и фенольные вещества -стационарной фазе /Melkonian, 1979/.
По данным Сакевича с соавторами /1979/ сине-зеленые водоросли /-crocystis aeruginosa ,Nostoc muscorum , Anabaena variabilis выде-яли в среду органическое вещество в количестве 30-164 мг/л в зависи-ости от фазы роста. В фильтратах культур, кроме высокомолекулярных еществ, обнаружены низкомолекулярные компоненты, в том числе и лету-ие, количественно преобладающие в период интенсивного увеличения био- іассьі водорослей.
Интересным фактом является наличие ритмичности экскреции веществ юдороелями. Так, суточная динамика выделения метаболитов имеет мес-ю у представителей сине-зеленых водорослей как в лабораторных куль-'урах, так и в природных популяциях /Косенко, 1975; Осипов, 1980/.
Анализируя имеющиеся литературные данные, можно отметить, что Іольшинство авторов доказывают наличие прижизненной экскреции у водо-юслей. В обзорных статьях посвященных процессу экскреции водорослей, выделяемые вещества объединяют в следующие основные группы: азотсодержащие вещества, фенольные вещества, углеводы, органические кислоті, липиды, витамины, ферменты, токсины /Fogg, 1962; 1966; 1971; iellebust,I974; Максимова, Горская, 1980; Тамбиев, Кирикова, 1981/. внеклеточные продукты водорослей представлены как высокомолекулярными веществами - полисахаридами, белками, так и низкомолекулярными -шинокислотами, спиртами, органическими кислотами, карбонильными соединениями, аминами.
В работах, посвященных внеклеточным углеводам, сообщается об экскреции полисахаридов в среду сине-зелеными водорослями Osciiiato- са. ria splendid" a, Anaoaena cylindriH зелеными ВОДОРОСЛЯМИ родов Chlamy- lomonas ,Chlorella ,Chloroccocus , Scenedesrrms ,/Горюнова, 1950; Fogg, l952;Lewin, 1956-Moore ,Tischer , 1965; Косенко, 1975; Vo-gel, Frisch , 1978; Percival , Foyle , 1979/. Моносахара в выделениях зодорослей обнаруживаются сравнительно редко, и не у всех исследовании ВИДОВ. yAnacystis nidulans И Synechocystis aquatili>6lltee КО-шчество выделяемых моносахаров составляло 9-13% от суммы внеклеточ-шх органических продуктов /Карауш, Федоров, 1975/.
Многие пресноводные водоросли выделяют в среду азотсодержащие зоединения, на долю которых приходится около 30% связанного азота кле-гок /Fogg, 1952/. В составе внеклеточных продуктов обнаруживаются свободные аминокислоты, белки, пептиды. В среде сине-зеленых водорослей Nostoc muckorum И Mastigocladus laminosus присутствовали acna- эагиновая кислота, треонин, серии, глицин, аланин, валин/Ржано-за, 1967/. Полипептиды, выделяемые АпаЪаепа cylindrica , легко )бразуют комплексы с различными ионами /cut Zn?+ Fe3+ /, органическими / Fogg , Westlake» 1955/. Из органических кислот в качест-зе внеклеточного продукта у пресноводного фитопланктона обнаружена ?ликолевая кислота / Fogg et al.J965;Fogg , 1964; 1966; Watt, 1966; [969; v/att,Fogg, 1966; colman, 1978/, количество которой составляет у некоторых водорослей до 50% от всего фиксированного клетками /глерода и до 38% от выделенного углерода. Гликолевую кислоту выделяют представители морских и пресноводных водорослей как в лабораторных, так и в естественных условиях /iiellebust , 1965/. Показана способность многих видов водорослей выделять в среду кроме гликолевой делый ряд органических кислот /уксусная, лимонная, молочная, щавеле-зая, пировиноградная/, количество которых иногда составляет 20-25% эт выделенного углерода.
Вещества полифенольной природы найдены в экзометаболитах сине- зеленых водорослей родов Microcystis и Anabaena . В их составе эбнаружены кумарины, коричные кислоты и сложные эфиры /Козицкая, 1974/. Многократно описано-выделение водорослями в среду токсинов, летучих метаболитов /геосмина, в-циклоцитраля/, веществ индольной природы; все эти данные суммированы в обзорных статьях / Hellet>ust, 1965; Henatsch. , Juttner , 1983;Juttner , 1983; Slater f Blok>
1983/. Однако, выделение в среду некоторых внеклеточных метаболитов изучено мало в количественном и качественном соотношении. К таким соединениям относятся вещества липидной природы.
Липиды, обнаруживаемые в культуральной жидкости водорослей
Выделение веществ липидной природы водорослями в окружающую сре-у изучено мало. В литературе имеются лишь единичные работы, посвящение этой проблеме и поэтому многие вопросы, связанные с процессами деления липидов, до сих пор не выяснены.
Первые сообщения о внеклеточных продуктах липидной природы были вязаны с токсическим действием культуры водорослей - по отношению к ругим видам. Пратт и Фонг /Pratt,Pong, 1940/ сообщали, что старая ультураСпіогеїіа выделяет в среду антибиотическое вещество, угне-ающее рост бактерий и свежих посевов той же водоросли. В культураль-ой жидкости оно появлялось уже во время лаг-фазы, исчезало в фазу огарифмического роста и снова накапливалось в стационарную фазу рос-а культуры. Позднее было обнаружено, что это вещество, названное хлореллином", является смесью ненасыщенных жирных кислот /Pratt et al., 944,-Prattf 1948/. По мнению Скутта /Scutt 1 1964/, токсическое "верство" - хлореллин является продуктом деградации ненасыщенных сво-одных жирных кислот. В более поздних исследованиях отмечается, что вободные ненасыщенные жирные кислоты в составе этого "вещества" пределяют токсичностьChlorellaдля других видов /Mo Gralstam et al., 976/. Аналогичное сообщение относительно прижизненного выделения водорослями веЩеСТВ липzидной Природы было сделано проктором /Proctor, [957 а/. Пытаясь исследовать токсичное по отношению к Hn.ematococcus iluvialis вещество, образуемое Ghlamajdomonas reinhardtii Іроктор /Proctor? 1957 б/ установил, что оно липидной природы и ївляется, именно, смесью жирных кислот. Недавно обнаружено, что "ве-цеотво", которое исследовалось Проктором, содержит фракцию свободных кирных кислот, состоящую из 15 компонентов. Подтверждено, что токсичность выделяемого Chlatrujdomonas reinhardtii "вещества" определяют ненасыщенные жирные кислоты, при гидрогенизации которых токсичность уменьшается /Мс Crocen? 1980/. Хеллебаст /Hellebust 1965/ обнаружил в культуральной среде одноклеточных водорослей хлороформрастворимые вещества в количестве 2,8-10,3% от всего выделенного в среду органического вещества.
В последнее время интерес к внеклеточным липидам связан с тем, что липиды, являясь лабильными реакционноспособными веществами, в результате свободнорадикального окисления могут образовывать токси -ческие производные, способные угнетать рост как самих водорослей, так и других организмов /Телитченко, Чернышев, 1971; Арчаков, Владимиров, 1972; Logani, Davies, 1980/. Внеклеточные липиды в старых культурах подвержены реакциям перекисного окисления с образованием продуктов пероксидного типа, .что приводит к появлению токсичных продуктов в среде в стационарной фазе развития культуры /Шестерин, 1972/. Показано, что по мере старения культур зеленых и сине-зеленых водорослей антиокислительная активность их органических выделений по данным экспериментов с 3-4 диоксифенилаланином /ДОША/ заметно уменьшается /Телитченко, Чернышев, 1971; Шестерин, Иванов, 1972; Телитченко и др., 1972/.
Относительно состава и количества внеклеточных липидов водорос в литературе сведений мало. Известно, что количество липидов, экстрагируемых хлороформом из культуральной жидкости 5-Ю суточной культуры Chioreiia vulgaris, составляло 15-50 МГ/л, у Scenedesmus bliquus - 10-35 мг/л /Шестерин, 1972/.
По данным Карауш и Федорова /1975/ в культуральной среде сине-зеленых водорослей Annoystis nidulans И Synechococcus aqua-ilis наибольшее количество липидов определялось на 14 сутки /25-22 мг/л/. При смешанном культивировании этих двух водорослей липиды в среде содержались в несколько меньшем количестве, что объясняется по мнению авторов способностью Anacystis niduians к фотогетеротрофному метаболизму.
Относительно лучше изучен состав внеклеточных липидов представителей зеленых водорослей. Показано, что культуры Chioreiia vulgaris л Scenedesmus obiiquus в логарифмическую и стационарную фазу роста выделяют в среду свободные жирные кислоты, стерины, триацилглицерины и фосфолипиды. Из фосфолипидов были идентифицированы пецитин и кефалин, а в старых культурах обнаруживались неидентифици-рованные соединения. В культуральной среде водорослей присутствовали миристиновая, пальмитиновая, олеиновая, линолевая и эруковая кислоты. Количество ненасыщенных жирных кислот в среде по мере роста уменьшалось С 37,5% ДО 20% у Chioreiia vulgaris и с 35% ДО 12,1% /ОТ СУММЫ КИСЛОТ/ у Scenedesmus obliquus /Шестерин, 1972/.
Внеклеточные ЛИПИДЫ Chioreiia vulgaris и Scenedesmus obliquus накапливались в количестве 20-30% от растворенного органического вещества среды. Методами тонкослойной и газожидкостной хроматографии в фильтрах культур, находящихся в логарифмической и стационарной фазах роста, обнаружены стерины, триацилглицерины, фосфолипиды, свободные жирные кислоты с числом атомов углерода от 4 до 20; среди жирных кислот доминировали миристиновая, пальмитиновая и олеиновая кислоты /Телитченко, 1974/. По данным Плеханова с сотрудниками в культуральной среде Sconedes-mus nuadricciucia в основном накапливаются ненасыщенные ;ирные кислоты. Легкость окисления жирных кислот и образование из [их токсических продуктов определяются степенью ненасыщенности этих ;ирных кислот. На б и II сутки развития в среде культивирования Зсепейезгшя qundricauda доминируют ненасыщенные кислоты. G увеличением концентрации в среде токсических веществ /фенолов/ усили-іается экскреция ненасыщенных жирных кислот. По мнению авторов, это ївязано с тем, что ненасыщенные жирные кислоты наиболее слабо удер-мваются в фосфолипидах и при увеличении количества повреждающего эактора выделяются в среду /Плеханов и др., 1982/.
Жирные кислоты внеклеточных липидов двух штаммов сы.о:гэ11абыли [редставлены пальмитиновой, олеиновой, пальмитолеиновой, стеарино-юй кислотами, суммарное содержание которых составляло от 0,11 до 1,4% от суммы органических веществ. Кроме этих кислот в следовых ко-:ичествах присутствовали миристиновая, пентадекановая, линолевая, ли-юленовая и арахиновая кислоты /Таутс, 1974/.
Из липидной фракции органических веществ культуральной жидкости іинхронной и обычной культуры сы.огэ11а pyrenoidoaa были выделены :аротиноиды, стерины, триацилглицерины эпоксикислот и н-жирных кис-:от, свободные жирные кислоты и А»-токоферол /Грановская-, Телитченко, :978/. Липиды в среде синхронной культуры после 6-часовой экспозиции іа свету составляли 50% от количества выделенного углерода. Авторы Грановская, Телитченко, 1978/ считают, что в момент активного роста юдоросли выделяют липиды, которые под действием света и кислорода ікисляются, образуя перекиси. Образование перекисей в среде в свою ічередь вызывает защитную реакцию водорослей и клетки начинают выде-:ять антиоксиданты - токоферолы, каротиноиды, активно реагирующие с юрекисньїми радикалами и снижающими их концентрацию.
Ростовые характеристики сине-зеленых водорослей A. variabilis и A.nidulans
Сине-зеленая водоросль Anabaena variabilis KUtz 359 является орошо изученным видом Cyanophyta. По существующей классификации тот вид относится к классу гормогониевых, семейство Anabaena орядок Fostocales /Ej&ffiOM, 1936; Голлербах и др., 1953/. Эта нит-атая водоросль способна образовывать цепочки по 8-32 клетки в каж-ой. A. variabilis образует гетероцисты и споры; гетероцисты имеют аровидную форму. Сине-зеленая водоросль A. variabilis обладает гиб-им конструктивным обменом, в частности, показано, что водоросль ожет использовать в качестве единственного источника углерода СОо ли глюкозу /Ohkia,Katoh, 1975/.
Благодаря высокой скорости роста и простоте культивирования ине-зеленая водоросль Anacystis nidulans / Synechococcus Зої Lauterborni-i nidulans / служит удобным объектом исследования отличие от A. variabilis A.nidulans не имеет точного таксономи-еского положения и до сих пор в научной литературе пользуются ста-ым названием A .nidulans, поэтому в нашей работе мы также используем тарое видовое название. Эта одноклеточная водоросль с простым пиком деления имеет форму палочек длиной до 2 мк, черты внутренней рганизации типичны для Cyanophyta . Культура не образует слизи и :е оседает на дно. Одной из физиологических особенностей A. nidulans вляется ее способность использовать на свету как источники углеро-;а органические вещества среды. До 60-х годов считали, что этот вид вляется строгим автотрофом /Kratz,Myers } 1955/, затем появились :сследования, в которых A.nidulans отнесли к фотогетеротрофам, пот-іебляющим на свету ацетат и глюкозу /ноаге,Мооге , 1965; Pearse, :arr , 1967/, аминокислоты /Кузьменко, 1968/, сахара и органичес-:ие кислоты /Гапочка, 1968; Карауш и др., 1972/. Последние работы иппка /Rippka, 1972/ вновь привели к пересмотру представления о ипе питания водоросли. G помощью диурона-ингибитора фотосинтеза, по-:азана возможность A. nidulans существовать только фотоавтотрофно Rippka,I972/.
Исследования проводили с бактериологически и альгологически шстыми культурами фотоавтотрофных водорослей Anabaena variabilis tutz и Anacystis nidulans Richt. в связи с тем, что целью работы івилось изучение процесса прижизненного выделения липидов .водоросями, исследовались активно растущие культуры. Для этого использова-и посевной материал, состоящий из активно делящихся клеток /7-10-невная культура/. Эксперименты с A. variabilis продолжались 30-40 ,ней, с A.nidulans - 22 дня, то есть в течение такого периода вре-:ени, когда культуры проходят активную фазу развития и начинают пе-еходить в стационарную.
Первым этапом работы явилось изучение общих характеристик роста развития культур. Такими характеристиками служили следующие пока-атели: прирост биомассы клеток /оценивался по числу плотности кле-ок суспензии/ и доля жизнеспособных клеток. Из литературы известно Гусев, 1961; Стайниер, 1979/, что кинетика роста микроводорослей писывается характерной для бактерий s -образной кривой. В процессе азвития культуры проходят следующие фазы: I/ лаг-фазу - период тносительной задержки скорости роста, вызванный адаптацией инокуля-а к новой среде и условиям существования; 2/ фазу активного роста, оторая характеризуется активным делением клеток и интенсивным рос-ом биомассы; 3/ стационарную фазу, когда прирост биомассы прекра-,ается в результате исчерпания субстрата и, возможно, выделения в реду токсичных для клеток веществ; 4/. и фазу отмирания и лизиса леток.
Чтобы выяснить продолжительность отдельных фаз роста у A. variabilis и A.nidulans , были получены кривые, характеризующие рост во-;орослей. Результаты исследований представлены на рис.2. В наших словиях фаза адаптации /лаг-фаза/ у A. variabilis продолжалась ме-ее суток /6-10 часов/. Кратковременность лаг-фазы обусловлена, по-идимому тем, что посевная культура в течение нескольких месяцев пе-есевалась строго через 10 дней, в результате чего в посевном мате-иале отсутствовали мертвые клетки и инокулят был представлен актив-:о делящимися клетками. Активный рост культуры в стационарных уеловиях на свету продолжался в течение 26-30 суток, при этом численность клеток достигала максимальной величины - 130 млн.кл/мл /табл.І в прил./. Затем рост культуры приостанавливался и наступала стационарная фаза развития. Морфологически клетки в первые две недели роста были представлены цепочками по 3, 16, 32 клетки, в процессе развития они разъединялись и культура состояла в основном из одиночных или парных клеток.
Рост культуры A.nidulans отличался более высокой скоростью, чем A. variabilis /рис.2, табл.19 в прил./. Лаг-фаза роста у A.nidulans практически отсутствовала. Стационарная фаза наступала раньше, чем у A.variabilis /на 13-14 сутки/, и максимальное число клеток в этот период составляло 310 млн.кл./мл. Морфологически клетки A. nidulans мелкие, представлены ассоциатами, состоящими из 4 или 2 клеток, не склеиваются, не образуют слизи и не оседают на дно.
Накопление сухой биомассы у A. variabilis и A. nidulansпроходило параллельно увеличению числа клеток и максимальные величины веса сухой биомассы совпадали по времени с максимальным количеством клеток в культурах /табл.1?19в прил./. Следует отметить, что при сравнении двух культур, максимальное количество клеток в культуре A.nidulans превышало более чем в 2 раза таковое у A. variabilis, хотя по сухой биомассе данные для двух культур были довольно близкими /0,84 г/л и 0,70 г/л/. Расчеты показали, что вес сухой биомассы 100 млн. клеток у A.niulans равен 0,2 мг, в то время как у A. -variabilis - 0,6 мг /в момент перехода в стационарную фазу/. Это объясняется более крупными размерами клеток в культуре A. variabilis /16 х 5,7 мк/ по сравнению с A. nidulans /3,0 х 0,462 ж/.
Состав внеклеточных веществ липиднои природы в фильтратах A. variabilis и A.nidulans
Бензольная фракция зреды, отобранная в разные сроки культивирования, оказала стимули-эующее или ингибирующее влияние на рост как проростков, так и корешков, в зависимости от возраста водоросли. В фазе активного роста культуры вещества, экстрагируемые бензолом, оказывали ингибирующее действие на рост корешков редиса. В то же время наблюдалось стимулирующее влияние на рост проростков редиса в конце фазы активного рос-га /28 сутки/. Ш фракция, в которой, вероятно, содержатся фенольные зоединения,в период активного роста культуры стимулировала рост корешков редиса, а в стационарной фазе угнетала как рост корешков, так л проростков редиса.
Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что внеклеточные продукты сине-зеленой водоросли A. variabilis обладают биологической активностью. В период активного роста культуры в сре-це обнаруживаются вещества, стимулирующие рост кишечной палочки, золотистого стафилококка и Pseudomonas Sp., а также вещества, ингиби-рующие рост проростков редиса. В литературе есть указание на стимуляцию роста золотистого стафилококка веществами культуральной жидкости цианобактерий /Телитченко, Гусев, 1964/, а также на появление токсичности по отношению к некоторым гидробионтам с переходом культуры сине-зеленых водорослей в стационарную фазу /Тамбиев, Телитченко, 1967/. Кроме того, показано, что рост нефтеокисляющих микроорганизмов замедляется на среде, содержащей культуральную жидкость цианобактерий /Гусев и др., 1982/. Фильтраты A. variabilis различного возраста угнетали рост проростков и корешков риса, причем угнетающее действие усиливалось с возрастом культуры /Чанг Данг Кэ, 1980/. Обнаружено, что ингибирующее действие среды обусловлено веществами бензольной фракции, представляющие собой в основном соединения липид-ной природы. Таким образом, можно заключить, что выявленная нами и известная из литературы биологическая активность веществ, выделяемых водорослями в культуральную жидкость, по-видимому объективно существует и, вероятно, в отношении различных тест- -объектов имеет один и тот же характер.
Исследование выделяемых в окружающую среду водорослями липид-ных соединений является актуальным ввиду проявляемой этими соединениями высокой биологической активности, что имеет большое значение для естественных водных биоценозов. Вещества липидной природы являются субстратом подвергающимся окислению в водной среде с образованием активных гидроперекисных, перекисных и свободнорадикальных продуктов.
В процессе развития исследуемых водорослей в культуральной жидкости нами обнаружено присутствие веществ липидной природы /экзоли-пидов/. В фазе активного роста A. variabilis , когда число нежизнеспособных клеток незначительно, липиды в среде составляли 2,9-12,5 мг/л. С увеличением возраста культуры и числа "мертвых" клеток количество липидов возрастало до 16,3 мг/л /табл.9/.
Внеклеточные липиды A. variabilis составляли 2,9-5,8% от общего количества органического углерода среды, причем максимальная величина отмечалась на 14-е сутки, а именно, в середине фазы активного роста водоросли. С увеличением возраста культуры относительное количество экзолипидов по отношению к общему углероду незначительно снижалось на фоне увеличения общего углерода среды и абсолютного количества липидов А.
Относительное количество липидов в среде культуры в % от веса сухих клеток достигало максимума на 14-е сутки /3,6%/ и затем снижалось до 1,94% на 40 сутки. Данный показатель в фазе активного роста составлял 2,9% и резко уменьшался в стационарной фазе /1,94-1,48%/. Возможно, это связано с тем, что липиды под действием света и кислорода подвергаются реакциям окисления с образованием перекисей, кетонов, альдегидов /Владимиров, Арчаков, 1972/ и поэтому в больших количествах в среде не накапливаются.
При пересчете количества липидов на одну клетку также оказалось, что количество липидов достигает максимума на 14 сутки развития A. variabilis.
Общий характер изменений экзолипидов у A. nidulans аналогичен таковому у A.variabilis. Интенсивное развитие A.nidulans сопровождалось выделением в среду относительно больших количеств липидов /7,7-17,1%/, /в 3-5 раз больше/, чем у A. variabilis.В фазе активного роста внеклеточные липиды A. nidulans составляли 13,9-17,1 от общего количества органического углерода среды, причем максимальное количество липидов в среде содержалось на 4 сутки развития /17,1%/. В стационарной фазе развития количество экзолипидов снижалось до 9,8-7,7% /табл.10/.
В первые сутки роста A. nidulansдоля внеклеточных липидов в составе выделенных органических веществ в пересчете на единицу веса сухой биомассы и одну клетку значительно выше, чем в стационарной фазе, независимо от увеличения доли мертвых клеток /разрушенных клеток/ в этот период. Тем не менее при сравнении двух исследуемых культур можно отметить следующее: клетки A.nidulans выделяют больше липидов в среду, чем A. variabilisHpH4eM наибольшие различия отме- \ чаются при сравнении процента внеклеточных липидов от общего внеклеточного углерода /15,5-9,8% у A. nidulans и 2,9-4,7% у A. variabilis/.
Таким образом, полученные данные показывают, что в составе органических веществ, выделяемых прижизненно сине-зелеными водоросля-ум, присутствуют вещества липидной природы, количество которых зависит от вида водоросли и фазы развития.
Состав и строение внеклеточных липидов сине-зеленых водорослей изучены менее ряда других соединений, выделяемых cyanophyta в окружающую среду. Как было показано выше, в процессе своего развития A.variabilis и A.nidulans активно выделяют вещества липидной природы.
Качественный анализ суммарных липидов, проведенный тонкослойной хроматографией, показал преобладание в составе экзолипидов нейтральных липидов. В результате исследований качественного состава внеклеточных и клеточных липидов данных видов сине-зеленых водорослей обнаружены полярные липиды, стерины, свободные жирные кислоты, триацилглицерины, эфиры стеринов, углеводороды и неидентифицирован-ная хроматографическая зона с Rf = 0,16-0,20. В липидах среды и клеток обнаруживались также пигменты: хлорофилл "a" /rtf= 0,2-0,4/ и каротиноиды / Rf= 0,17-0,18/ /рис.6/.
Жирнокислотный состав липидов, выделяемых в среду клетками и сферопластами A.variabilis культивируемыми при пониженной температуре
В клетках A.nidulans в составе липидов клеток преобладающими являются Cjg-кислоты, которые на всех стадиях развития в сумме составляли более 74% /табл.17/, что согласуется с литературными данными /Holton et al.f 1968/. Жирные кислоты с числом атомов С jg составляли не более 4%, По полученным ранее данным /Parker et al., 1967; Ого et а1.Д967; Holton et al., 1968/ для эндолипидов A.nidulans , A.marine характерным является отсутствие кислот с углеродной цепочкой длиннее 18 атомов С, содержащих более одной двойной связи. Однако, нами обнаружены в некоторых случаях минорные количества линолевой, эйкозановой кислот, отсутствие сведений о которых в цитированных выше работах возможно связано с несовершенством использовавшихся методов анализа, или низкой чувствительностью детекторов. Сумма Cjg.Q, Cjg-I и Cjg.g кислот в эндолипидах в процессе всего культивирования не превышала 18,1%. В отличие от эндолипидов A. variabilis эндолипиды A.nidulans включают более насыщенные ЖК и индекс ненасыщенности в процессе всего развития был ниже 0,500 /в 2 раза меньше, чем у A.variabilis /, причем максимум содержания насыщенных кислот приходится на 10 сутки - в середине активного роста культуры.
Таким образом, результаты представленные в настоящей работе, свидетельствуют о том, что жирнокислотный состав липидов культураль-ной жидкости сине-зеленых водорослей качественно и количественно отличается от состава внутриклеточных липидов. Эти отличия заключаются, прежде всего, в присутствии для экзолипидов н-нонадеценовой кислоты и большим содержанием насыщенных кислот в стационарной фазе. При сравнении двух культур между собой можно отметить значительные различия по уровню ненасыщенности их ЖК: во внутриклеточных липидах A.nidulans на долю насыщенных жирных кислот приходится более 50% от суммы всех кислот, тогда как в липидах A variabilis доминируют ненасыщенные жирные кислоты /более 60%/. В процессе развития водорослей наблюдаются определенные изменения в соотношении жирных кислот: сумма насыщенных ЖК в экзолипидах повышается в основном за счет стеариновой и пальмитиновой кислот, соответственно, индекс ненасыщенности уменьшается и в стационарной фазе составляет /0,326 у A.nidulans и 0,640 у A. variabilis/.
В результате исследований выявлены существенные различия между экзолипидами и эндолипидами A.variabilis. Показано, что для экзо-липидов A.variabilis характерно присутствие гомолога -фенилэти-лового спирта, а также алифатического диола с брутто-формулой /Cr HggOg/ и необычной н-Стд.т кислоты, которая в составе липидов в клетках исследуемого вида практически не обнаружена.
Как правило, в литературе в качестве одного из доказательств процесса экскреции органических соединений из клеток водорослей приводятся различия в химическом составе внутри- и внеклеточных соединений /в случае экскреции макромолекул, витаминов, аминокислот, фенолов/ /Aaronson, 1972/. В связи с этим, чтобы показать разницу в химическом составе отдельных классов липидов среды и клеток A.variabilis провели анализ их жирнокислотного состава. В составе липидов A.variabilis количественно преобладают неполярные липиды, составляя более 80% от суммы липидов. На долю полярных липидов, которые при хроматографировании в тонком слое остаются на старте, при- ходится соответственно менее 20%.
Полярные липиды. В составе полярных липидов A. variabilis. как в клетке, так и в среде обнаружены жирные кислоты, содержащие от Cj4 до CgQ.j. Полярные липиды в клетках А. variabilis/рис. 16/ отличались от $}С ОЛиЛіШщ несколько большим содержанием гексадека уровнем стеариновой /CJQ.Q/ и линоленовой /CJQ.3/ кислот, Преобладающими жирными кислотами во фракции полярных липидов, экстрагированной из культуральной жидкости данной водоросли, являются из насыщенных - пальмитиновая, стеариновая, ненасыщенных - олеиновая кислоты. В незначительных количествах в обеих фракциях обнаружена гептадекановая кислота. Специфическая для экзолипидов н-нонадецено-вая /Cjg.j/ кислота присутствовала в полярных липидах на всех фазах развития, тогда как во фракции из клеток отсутствует.
При исследовании жирнокислотного состава общих липидов среды и клеток A. variabilis нами было отмечено, что в целом для липидов характерно преобладание ненасыщенных жирных кислот. Оказалось, что полярные липиды 2-х экстрактов исследуемой культуры также различаются по уровню ненасыщенности. Если в полярных липидах клетки ИН варьировал от 0,986 до 0,804, то в культуральной жидкости он лежал в пределах 0,872-0,626. Иными словами, в культуральной жидкости в полярных липидах преобладали насыщенные кислоты, тогда как во фракции из клеток более 60% приходилось на долю ненасыщенных /табл.20 прил./.
В процессе развития культуры происходят количественные изменения отдельных жирных кислот, которые определяют изменения индекса ненасыщенности. Отмечено, что уровень ненасыщенности в данной фракции в клетках уменьшается лишь в стационарной фазе /от 0,986 до 0,804/, оставаясь без изменений в период активного роста /0,98-0 ,94/.
