Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Сомаклональная изменчивость 6
1.1.1. Причины сомаклональной изменчивости 6
1.1.2. Факторы, влияющие на сомаклональную изменчивость 7
1.1.3. Возможные механизмы сомаклональной изменчивости 14
1.1.4. Изменения, возникающие в процессе сомаклональной изменчивости 15
1.1.5. Практическое использование сомаклональной изменчивости 18
1.2. Молекулярные маркеры, применяемые для изучения сомаклональной изменчивости 21
1.2.1. Белковые маркеры 21
1.2.2. RFLP-маркеры 24
1.2.3. PCR-маркеры 28
1.2.3.1. МААР-маркеры 30
1.2.3.1.1. МААР-маркеры с праймерами произвольной последовательности 32
1.2.3.1.2. МААР-маркеры с праймером, комплементарным микросателлитному повтору 35
1.2.3.2. STS-маркеры 37
1.2.3.2.1. STS-маркеры, основанные на полиморфизме микросателлитов 37
1.2.3.2.2. STS-маркеры, созданные на основе МААР 40
1.2.3.2.3. STS-маркеры, основанные на выявлении точковых мутаций при введении нуклеотидных замен в праймеры 41
1.2.3.3. REMAP-маркеры 43
1.2.3.4. Маркеры, сочетающие рестрикцию, гибридизацию и PCR-методы 44
1.2.3.4.1. Использование в качестве мишени ПЦР-продукта 44
1.2.3.4.2. Использование рестрицированной геномной ДНК в качестве основы для ПЦР 44
1.2.3.4.3. FISH (зонды могут быть получены спомощью ПЦР) 48
1.2.3.5. Комплексный подход к анализу сомаклональной изменчивости с помощью молекулярных маркеров 48
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Исходный материал 51
2.2 Выделение ДНК для PCR-анализа 51
2.3. Амплификация ДНК 52
2.4. Проведение электрофореза в агарозном геле 54
2.5. Качественная и количественная оценка полиморфизма 54
2.6. Выделение фрагмента из геля 55
2.7. Клонирование фрагмента 55
2.8. Выделение плазмиды 55
2.9. Секвенирование 56
2.10. Подбор SCAR-праймеров и амплификация с ними 57
2.11. Синтез праймеров 57
2.12. Выделение ДНК для блотт-гибридизации по Саузерну 58
2.13. Блот-гибридизация по Саузерну 59
2.14. Анализ последовательностей специфических SCAR-фрагментов 60
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Характеристика сомаклонов 61
3.2. RAPD-анализ: первая серия опытов 63
3.3. Воспроизводимость RAPD- и ISSR-спектров 65
3.4. RAPD- и ISSR-анализ: вторая серия опытов 67
3.5. Количественная оценка RAPD- и ISSR-полиморфизма 69
3.6. SCAR-аналиэ 73
3.7. Наследование SCAR-маркеров 76
3.8 Анализ нуклеотидных последовательностей SCAR-маркеров 80
3.9, Блот-гибридизация 94
3.10 Секвенирование участка гена анодной пероксидазы кукурузы (ZmApl) 95
Заключение 102
Выводы 104
Список литературы 105
- Изменения, возникающие в процессе сомаклональной изменчивости
- Использование рестрицированной геномной ДНК в качестве основы для ПЦР
- Анализ последовательностей специфических SCAR-фрагментов
- Секвенирование участка гена анодной пероксидазы кукурузы (ZmApl)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Феномен сомаклональной изменчивости растений представляет собой резкое повышение наследственной вариабельности культивируемых клеток и тканей, выявляемой в потомстве регенерантов (Murashige and Nakano, 1966; Бутенко и сотр., 1967; Sacristan andMelchers, 1969).
Изучение сомаклональной изменчивости может быть интересно как в фундаментальных исследованиях в качестве модели эволюции и дивергенции генов в популяции, так и в практической селекции, как доступный источник генетического разнообразия. В том случае, когда целью служит получение однородного материала, сомаклональную вариабельность желательно свести к минимуму, если требуется дополнительная генетическая изменчивость, необходимо усилить степень вариабельности. Однако для того, чтобы управлять сомаклональной вариабельностью, важно понять причины ее возникновения и размах. С этой целью используют комплексный подход, включающий различные методы и анализы.
При морфологическом анализе регенерантов можно обнаружить лишь те изменения, которые имеют фенотипическое проявление, кроме того, неизвестно, обусловлены ли данные отличия генетическими модификациями или носят эпигенетический характер.
Появление различных фенотипических вариантов может быть связано с грубыми кариотипическими изменениями и хромосомными перестройками, которые позволяет установить кариологический анализ, однако, данный метод не выявляет менее заметные мутации, например, точковые.
На сегодняшний день одним из наиболее доступных и быстрых способов обнаружить вариабельность, а затем выяснить природу сомаклональной изменчивости является применение молекулярных методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и создание с их помощью маркеров ДНК, отличающих сомаклоны от исходного генотипа.
Цель и задачи работы. В связи с вышеизложенным целью данной работы стало выявление полиморфизма ДНК среди ранее полученных и исследованных сомаклонов кукурузы и выяснение природы сомаклональной изменчивости на молекулярном уровне с помощью RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) методов, основанных на ПЦР.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
1. Модифицировать методику постановки RAPD- и ISSR-анализов: определить подходящие условия реакции, подобрать праймеры для работы с образцами ДНК кукурузы.
2. Выявить RAPD и ISSR маркеры, отличающие сомаклоны от исходной линии.
3. Клонировать полиморфные фрагменты, секвенировать концевые участки данных фрагментов для создания SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) маркеров.
4. С помощью SCAR-праймеров подтвердить полиморфность фрагментов, проследить их наследуемость в поколениях R2, R3, R4, полученных при самоопылении, а также в поколениях F і, F2, полученных в результате возвратного скрещивания с исходной линией А188, и в случае успеха секвенировать фрагмент целиком.
5. Полученные нуклеотидные последовательности сравнить с имеющейся базой данных. По результатам сравнения сделать предположения о характере сомаклональной изменчивости.
Изменения, возникающие в процессе сомаклональной изменчивости
Изменение плоидности и числа хромосом. Наиболее часто в культуре in vitro встречаются геномные мутации, связанные с изменением плоидности и числа хромосом. В работе, где изучаемым объектом является картофель, был проведён тщательный цитогенетический анализ регенерантов, который показал: более 80% растений с какими-то фенотипическими отклонениями от нормы характеризуются изменениями числа хромосом. При этом число хромосом у регенерантов тетраплоидного картофеля (4х=48), колебалось от 12 до 96 (Хромова и сотр., 1983).
Огихара на цитологически удобном объекте Haworthia serata (2п=14), у которого легко идентифицируются 4 пары больших хромосом, показал, что из 388 растений-регенерантов 70% сохраняют нормальный диплоидный набор хромосом, а 30% характеризуются изменённым кариотипом. Среди регенерантов было найдено 13,7% тетраплоидов, 2% анеуплондов и 14% растений с хромосомными перестройками (Ogihara, 1981).
Хромосомные мутации. Хромосомные перестройки достаточно часто встречаются в культуре ткани. При детальном исследовании мейоза у регенерантов двух сортов овса Мак-Кой и др. обнаружили, что типичными нарушениями являются делеции, транслокации и разрывы хромосом. При анализе более 300 регенерантов для каждого из сортов оказалось, что около 20% растений несли один или более обменов или разрывов, что следовало из обнаружения гетероморфных пар хромосом в диакинезе (McCoy etal., 1982).
Хромосомные аберрации могут быть нестабильными. Всесторонний генетический анализ нестабильных мутаций кукурузы позволил Мак-Клинток постулировать существование генетических элементов, перемещающихся из одного места генома в другое, или транспозиций. Передвигаясь, транспозируемые элементы могут инактивировать структурные гены, изменять генную регуляцию, возможно, реактивировать молчащие гены и генерировать дупликации и делеции (McClintock, 1982). Существуют примеры, дающие косвенное подтверждение тому, что события в культуре тканей могут быть аналогичны транспозициям. При анализе сомаклональной изменчивости у картофеля, проведённом Шепардом, были обнаружены сомаклоны, отличающиеся от исходного сорта одновременно по 17 признакам. Среди 65 изученных сомаклонов каждый отличался от родительского сорта в среднем по 7 признакам. Такая совпадающая изменчивость может быть объяснена транспозиционными взрывами (Shepard etal., 1980).
Для изменчивости, связанной с транспозициями, характерна нестабильность наследования. Груз и Бингхэм выделили у люцерны белоцветковый сомаклон от пурпурноцветкового родителя. Потеря хромосомы не может объяснить возникновение такого сомаклона. При последующем введении в культуру белого мутанта некоторые регенеранты несли реверсию к типу с пурпурными цветками. Показано, что исходный мутант и ревертанты наследуют свой фенотип. Частота реверсий среди регенерантов составила 50% (Groose and Bingham, 1984). Генные мутации. Наряду с видимыми изменениями числа и структуры хромосом у сомаклонов индуцируются генные мутации. Связь между крупными хромосомными аберрациями и генными изменениями в сомаклонах точно не установлена.
Ортон выявил корреляцию между хромосомными потерями и генетическими изменениями в локусе, контролирующем фосфоглюкомутазу (PGM) в каллусных культурах сельдерея. Однако причинная связь не была установлена несмотря на то, что в локусе PGM-2 наблюдали хромосомные потери и нестабильность. Поскольку хромосомные перестройки и мутации отдельных генов выявляются разными методами, перестройки хромосом и точковые мутации представляются обусловленными разными механизмами. Тем не менее специфические генные эффекты могут быть результатами хромосомных обменов, поскольку эти обмены ведут к инактивации гена, эффекту положения, к изменению хода развития (Orton, 1983).
Эпигенетические изменения. Довольно часто признак, отличающий сомаклоны от исходного растения, не наследуется в следующих поколениях. В этом случае говорят об эпигенетических изменениях, не затрагивающих структуру гена, но влияющих на его экспрессию. К активации или дезактивации генов может привести изменение характера метилирования ДНК, РНК.
Изменения метилирования нуклеиновых кислот наблюдаются на первых этапах индукции каллуса (дедифференциации клеток), сохраняются при дальнейшем его росте и в определенных случаях могут быть переданы растениям-регенерантам. Отдельные гены, например гены рРНК, могут быть как гипо- так и гиперметилированы, что продемонстрировано на каллусных культурах озимой пшеницы (Ковальская и Сидорова, 1990) и петунии (Anderson et ah, 1990), а степень метилирования тРНК может коррелировать с потенциалом дифференциации отдельных тканей (Jones and Scott, 1981)
Анализ нескольких сотен сомаклональных линий кукурузы показал, что у некоторых из них, предположительно в результате гштометилирования, в отличие от интактных растений были активированы подвижные генетические элементы типа Ас (activator) и Spm (supressor-mutator) (Hodgson, 1990), (Peschke and Phillips, 1991).
Классическим доказательством генетической природы сомаклональных вариаций является генетический характер расщепления по исследуемому признаку в потомстве растений, регенерированных из изменённого клона. Изменение считается мутационным, если проявляется у растений-регенерантов и их семенных потомков, полученных при сомоопылении и при гибридизационном анализе. Часто, когда генетический анализ возникших в культуре изменений был проведён, обнаружено расщепление в обычных менделевских соотношениях доминантных и рецессивных форм. Например, устойчивость к гидразиду изоникотиновой кислоты у табака обусловлена доминантной мутацией одного гена. Как моногенная доминантная мутация наследуется также устойчивость к метотрексату, пиклораму, карбоксину, оксимочевине у табака; устойчивость к лизину и треонину у кукурузы. Устойчивость к хлорату у кукурузы наследуется как дигенная рецессивная мутация (Долгих и Шамина, 1991).
Изменения цитоплазмона. Изменчивости в культуре подвергается не только ядерный геном, но и ДНК хлоропластов и митохондрий. Например, мужская стерильность и высокая чувствительность к Helminthosporium maydis и токсину этого гриба, наблюдаемые у сомаклонов кукурузы с Т-типом (техасская) мужской стерильности, обусловлены мутацией в мтДНК (Kemble et ah, 1982). Появление сомаклонов-альбиносов из культуры пыльников злаков объясняется делециями пластидной ДНК, причем, делегированные районы могут достигать 40-80% генома хлДНК (Day and Ellis, 1984), (Annil and Noel, 1985). Генетический анализ позволяет определить, где произошла мутация, так как изменения в хлоропластных и митохондриальных генах передаются только от материнского растения. Например, устойчивость к стрептомицину Nicotiana sylvestris может вызываться мутацией в ядре и в хлоропластах. Фенотипически они проявляются одинаково, но ядерная мутация наследуется как моногенная рецессивная, а хлоропластная - по материнскому типу наследования.
Использование рестрицированной геномной ДНК в качестве основы для ПЦР
ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) (Kantety et al., 1995); ISA (Inter-SSR Amplification), или амплификация между повторами простых последовательностей. ISSR - метод, в котором единственный праймер длиной 15-16 нуклеотидов представляет собой микросателлитную последовательность из 2-4 оснований, повторяющуюся от 8 до 4 раз, например, (СА)8, (GTG)5, (GGCT)4- Праймер может содержать несколько нуклеотидов на 3 -конце, т.е. так называемую заякоренную последовательность, например (AC)gG, (AGQ3Y, (CA RY, где R соответствует пуриновым основаниям (G, A), a Y - пиримидиновым (С, Т). Благодаря заякоренной последовательности фрагменты, получаемые с помощью ISSR-метода, расположены между соседними инвертированными микросателлитами. В том случае, если в ПЦР используют праймеры или нуклеотидтрифосфаты, меченные флуоресцентными красителями, и анализ продуктов амплификации проводят в автоматическом секвенаторе, метод называют FISSR (Fluorescent ISSR) или флуоресцентные ISSR (Nagaraju et al., 2002). По мнению авторов FISSR вследствие флуоресцентного способа детекции более информативны, чем ISSR.
Таким образом «ISSR» является наиболее распространенным названием для МААР-маркеров с праймером, комплементарным микросателлитному повтору. ISSR-анализ, с одной стороны, сочетает высокую разрешающую способность RAPD-метода, а с другой - из-за большей длины праймера и его комплементарное микросателлитному району, по мнению некоторых авторов, обладает большей воспроизводимостью спектра (Кочиева и др., 2002). Таким образом, как и RAPD, ISSR-анализ все чаще применяется для исследования сомаклональнои изменчивости, а именно, для выявления полиморфизма среди клонов и выяснения природы генетических изменений, происходящих при сомаклональнои изменчивости. Leroy et al. анализировали ДНК каллусов Brassica oleracea var. botruyis с помощью 4 ISSR-праймеров. Из 38 каллусов полиморфизм выявили у трех. Один из полиморфных фрагментов содержал три микросателлитных и один инвертированный повтор, а также последовательность белка, гомологичную протеинкиназе арабидопсиса, человека и мыши. По литературным данным авторы выяснили, что протеин-киназа вовлечена в регуляцию клеточной пролиферации. По мнению авторов открытие мутации в этом гене может положить начало дальнейшим исследованиям, целью которых станет лучшее понимание процессов клеточной пролиферации и дифференциации (Leroy et al., 1998).
В методах MP-PCR (Microsateffite Primed - PCR), или праймированной микросателлитом ПЦР (Meyer et al., 1993), (Perring et al., 1993) и SPAR (Single Primer Amplification Reaction), или реакции амплификации с единичным праймером (Gupta et al., 1994), в отличие от ISSR, используют праймер без дополнительных нуклеотидов на З -конце. В методах AMP-PCR (Anchored MP-PCR), или заякоренной, праймированной микросателлитом ПЦР (Zeitkievicz et al., 1994) и ASSR (Anchored Simple Sequence Repeats), или заякоренных повторах простых последовательностей (Wang et al., 1998) применяют, как правило, только «заякоренный» праймер.
RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism), или случайно амплифицируемый полиморфизм микросателлитов (Wu et al., 1994). RAMP сочетает в себе два метода: RAPD и ISSR. В данном методе используются два праймера в одной ПЦР-смсси, один из которых комплементарен микросателлитному повтору и «заякорен» с помощью 1-3 произвольных нуклеотидов на 5г-конце, а другой - RAPD праймер. Сайт отжига RAPD праймера служит случайной конечной точкой продукта амплификации, основу которого составляет микросателлитная последовательность. dRAMP (digested RAMP), или обработанный RAMP (Becker and Неїш, 1995). Продукты амплификации RAMP могут быть обработаны различными рестриктазами, что позволяет преобразовать доминантные RAMP-маркеры в кодоминантные. Sala et al. использовали RAMP вместе с RAPD, AFLP и SSR для анализа трансгенных растений Orisa sativa L., Populus, Saccharum officinarum L., полученных через культуру клеток и трансгенного Arabidopsis thaliana L., полученного с помощью "макания цветка". Авторы обнаружили полиморфизм во всех исследуемых популяциях, причем вариации спектров амплификации наблюдались как у регенерантов, отличающихся по морфологическим признакам от исходного растения, так и у регенерантов, внешне идентичных исходному генотипу. У пяти клонов Saccharum officinarum L, устойчивых к насекомым, из 39 рассматриваемых морфологических и агрономических признаков, отличия наблюдали по 6 из них. В результате авторы пришли к выводу, что причиной полиморфизма среди трансгенных растений может быть как сомаклональная изменчивость, так и реакция на введение чужеродных генов (Sala et al., 1999). 1.2.3.2. STS-маркеры. STS (Sequenceagged Sites), или сайты, привязанные к последовательностям -маркеры, основанные на классической ПЦР с двумя праймерами, комплементарными определенному участку ДНК и направленными навстречу друг другу, длиной от 15 до 30 нуклеотидов. В данном случае для синтеза праймеров необходимо знать нуклеотидную последовательность концевых участков исследуемого фрагмента. При детекции в агарозном или полиакриламидном геле результат выявляется в виде определенного, чаще единичного, фрагмента. Подобные маркеры, например SCAR, SSR, SSLP, STMS, STR отличаются высокой специфичностью, воспроизводимостью результатов между лабораториями и поэтому применяются при картировании, генотипировании, сортовой паспортизации. В зависимости от природы нуклеотидной последовательности, заключенной между праймерами, STS-маркеры делят на:
Известно, что существенная часть генома эукариот состоит из более или менее протяженных повторов - мини- и микросателлитов, транспозонов, псевдогенов и др.. Микросателлиты представляют собой тандемно повторяющиеся ди-, три, тетра- и пентануклеотиды. По данным Wang et al. микросателлиты встречаются в геномах растений следующим образом, в порядке убывания количества: (AT)n, (A)n (AG)n, (ААТ)п, (ААС)пэ (AGC)n, (AAG)n, (AATT)n, (AAAT)n, (AC)n где n варьирует от 10 до 80 (Wang et al., 1994). Присутствие микросателлитов характерно как для ядерной ДНК, так и для ДНК органелл. По меньшей мере, около 500 микросателлитных локусов описаны для хлоропластного генома растений (Powell et al.? 1995). У сосны и кукурузы ДНК хлоропластов содержит, в основном, мононуклеотидные повторы (А)п средней и малой длины.
Важной особенностью мини- и микросателлитов является то, что они эволюционируют быстрее, чем остальная ДНК, подвергаясь "динамичным мутациям", которые приводят к появлению аллелей с различным количеством повторяющихся единиц (Richards and Suterland, 1992). Как следствие, микросателлиты очень полиморфны. Благодаря этому свойству мини- и микросателлиты часто называют тандемными повторами с изменяющимся числом копий или, VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Высокий полиморфизм в сочетании с повсеместным распространением и мультиаллелизмом делает их очень перспективными в качестве молекулярных маркеров.
Анализ последовательностей специфических SCAR-фрагментов
Амплификация может в свою очередь включать два этапа: предварительную амплификацию, используя праймеры с малым количеством (0 или 1) селективных нуклеотидов и амплификацию, где праймеры имеют в своём составе 3-4 селективных нуклеотида. Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую повторяемость, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. Таким образом, в результате ПЦР из многочисленных рестриктов геномной ДНК отбираются фрагменты определенной длины (200-2000 нуклеотидов), содержащие на концевых участках после сайтов рестрикции нуклеотиды, комплементарные селективным. Продукты амплификации разделяют электрофоретически в акриламидном геле. В основном, с каждой парой праймеров амплифицируются 75—150 фрагментов. Изменения в последовательности ДНК определяются так же, как и при RFLP-анализе, но степень полиморфизма гораздо выше. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, величина генома, анализируемая одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа ДНК. С одного геля, обычно, удается получить до 40 полиморфных локусов. Полиморфизм определяется, как присутствие/отсутствие полосы на фореграмме (эта интерпретация обычна для доминантного типа наследования). AFLP-маркеры часто наследуются, как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров.
AFLP-маркеры были успешно использованы при изучении межсортовых различий Solarium tuberosum L. (Milboume et al., 1997) и для оценки уровня межпопуляционного полиморфизма Cynodon (Zhang et al., 1999). AFLP-метод широко использовался для маркирования локусов, сцепленных с хозяйственно-ценными признаками у Capsicum аппиит L. (Tai et al., 1999), Solanum tuberosum L. (Rouppe van der Vort et al., 1997), Brassica napus L. (Schierholt et al., 2000).
Последнее время все чаще AFLP-анализ применяют для оценки и изучения сомаклональной изменчивости. Цель работы Polonco and Ruiz заключалась в исследовании с помощью 12 комбинаций AFLP-праймеров полиморфизма 51 сомаклона Arabidopsis thaliana L., полученных из 5 каллусов. Среди иследованных растений 34 содержали как минимум одну вариацию, и количество изменений на регенерант составляло от 1 до 18. Однако, распределение изменчивости было неоднородным: три регенеранта аккумулировали 40% полиморфизма. При оценке уровня дивергенции между сомаклонами выяснили, что регенеранты группировались в 5 кластеров, согласно происхождению. Практически в каждом кластере встречалось одно растение, существенно удаленное от других, что, однако, не коррелировало с установленными фенотипическим отличиями. По мнению авторов выявленные для этих растений полиморфные AFLP-фрагменты могут маркировать гипервариабельный район в геноме арабидопсиса. Авторы уверены, что AFLP является надежным методом для изучения полиморфизма, возникающего при сомаклональной изменчивости, и собираются продолжить свои исследования в этом направлении (Polonco and Ruiz, 2002).
Vendrame et al. использовали AFLP-анализ для оценки генетической изменчивости сомаклонов, а также меж- и внутри линейных различий соматических эмбрионов Сагуа illinoisensis Wangenh С Koch. Среди линий обнаружили 368 полиморфных фрагментов. Спектры ДНК эмбрионов, полученных от одной линии, содержали много общих фрагментов. При оценке разнообразия с помощью UPGMA и построения дендрограммы эмбрионы, как правило, группировались в кластеры согласно их происхождению, однако, некоторые из них демонстрировали более высокий уровень полиморфизма и выделялись из своих групп (Vendrame et al., 1999).
С помощью AFLP-анализа каллусных клонов и растений Arabidopsis thaliana L. Bardini et al. выяснили, что добавление в среду культивирования канамицина, как селективного агента при трансформации, способствует гипо- и гиперметилированию генома, причем, чем выше доза, тем значительнее эффект (Bardini et al., 2003).
Целью Singh et al. было обнаружить различия между сомаклонами Elaeis guineensis Jacq.y нормальными и мутантными ("mantled") по строению цветка, применив AFLP-анализ. Полиморфизм не обнаружили, когда использовали стандартнный AFLP с 10 различными комбинациями праймеров. Различия выявили, применив AFLP, чувствительный к изменению метилирования. Наибольшее число полиморфных фрагментов (0,3%) было получено с рестриктазой НраІІ, что указьгеает на потерю метилирования для внутреннего цитозина в сайте рестрикции НраІІ 57-CCGG-3 (Singh et al, 2002). Полученные результаты совпадают с данными Jaligot et al., обнаружившими различия в характере метилирования между нормальными и мутантными сомаклонами Elaeis guineensis Jacq. с помощью RFLP-анализа (Jaligot et al., 2002).
TD (Transposon Display), или выявление транспозонов (Van den Broeck et al., 1998). В качестве молекулярных маркеров в TD-методе используют мобильные элементы, относящиеся к классу MITE (Miniature Inverted Repeat Transposable Element) или миниатюрные транспозоны, фланкированные инвертированными повторами (Casa et al., 2000). TD является разновидностью AFLP-анализа. На первом этапе проводят рестрикцию геномной ДНК? на втором - лигирование обоих концов рестрикционных фрагментов ДНК с адаптерной последовательностью, на третьем - предварительную амплификацию. В предварительной амплификации один из праймеров (AFLP-праймер) включает в свой состав длинную адаптерную последовательность и последовательность сайта рестрикции, а второй (МІТЕ-праймер) - длиной 20-25 нуклеотидов комплементарен последовательности транспозона. На последнем этапе, селективной амплификации, к AFLP-праймеру на 3 -конец добавляют селективный нуклеотид, а МІТЕ-праймер может быть в большей степени направлены внутрь транспозона. Используя TD-анализ были картированы 213 полиморфных фрагментов в 100 рекомбинантных инбредных линиях Zea mays Z,., полученных от скрещивания В73 и Мо17 (Casa et ah, 2000). С помощью MITE, названных авторами mPing (miniature Ping) и Pong были выявлены отличия между культурой клеток Orysa sativa и исходным сортом С5924 (indica) (Jiang et al., 2003).
FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), или флуоресцентной гибридизации in situ. Метод FISH широко используется для картирования последовательностей нуклеотидов на хромосомах. В этом случае в качестве зонда используют фрагменты ДНК, меченные флуоресцентной меткой, которые могут быть получены с помощью ПЦР, а в качестве мишени - препараты фиксированных хромосом. После отмывания несвязавшейся метки оставшиеся меченые молекулы нуклеиновых кислот оказываются ассоциированными с участками хромосом, содержащими последовательности, комплементарные исследуемым меченым последовательностям нуклеотидов, что позволяет локализовать изучаемые последовательности нуклеотидов на хромосомах. В своей работе Lee et al. исследовали корреляцию между хромосомными и генными изменениями, происходящими в результате сомаклональнои изменчивости. Авторы получили 195 регенерантов Allium суапеит, 98% из них, как и исходные растения, были диплоидными (2п=16), 8% - отличались по плоидности. Используя в качестве зондов 5S рРНК и 18S-26S рРНК гены, авторы сравнили FISH аутотетраплоидных регенерантов с исходным растением. 5S рРНК ген был выявлен в интерстициальном районе в коротком плече хромосомы 4 и в интерстициальном районе в обоих плечах хромосомы 7. 18S-26S рРНК гены обнаружены в терминальном районе короткого плеча, включая сателлит хромосомы 5 и часть хромосомы В. Локализация обоих рРНК генов на хромосомах аутотетраплоидных регенерантов соответствует их расположению у исходных растений, таким образом изменение плоидности оказалось не связанным с положением данных генов (Lee et al., 1998).
Секвенирование участка гена анодной пероксидазы кукурузы (ZmApl)
Анализ изменчивости ДНК-маркеров выявил многочисленные отличия всех проанализированных регенерантов от исходной линии кукурузы А188. При изучении сомаклонов с помощью морфологического и биохимического анализов было показано, что некоторые признаки подвергаются сомаклональнои изменчивости у всех растений (Долгих и др., 1992; Хавкин и Забродина, 1994). С помощью молекулярного анализа также обнаружили маркер QR-2 (1018 п.н.), характерный для всех сомаклонов. Наличие общих признаков, характерных для независимо полученных групп сомаклонов и регистрируемых различными методами, позволяет предположить, что в процессе сомаклональнои изменчивости уже на ранних этапах культивирования происходят сходные генетические преобразования, способствующие адаптации растительной клетки к условиям жизни in vitro. С другой стороны, возможен отбор клеток, имеющих преимущества при культивировании, которые и дают затем начало регенерантам.
По ряду других морфологических признаков разные по происхождению группы сомаклонов различались. Среди используемых праймеров некоторые также выделяли две анализируемые группы. Сомаклоны второй группы, регенерированные после более продолжительного культивирования каллусов, характеризовались большим полиморфизмом фрагментов ДНК, что полностью соответствуют морфологическим данным. Наличие общих фрагментов у сомаклонов внутри группы (Q-20 и М-10) вероятно, связано с общностью их происхождения. Кроме того, были найдены праймеры, выявляющие специфические ампликоны у отдельных сомаклонов второй группы (NO-15 и Leb), что может свидетельствовать о накоплении изменений ДНК на более позднем этапе культивирования. RAPD- и ISSR-анализы подтвердили закономерности сомаклональнои изменчивости, показанные другими методами, а также мутационную природу вариаций.
На основании определения последовательностей нуклеотидов SCAR-маркеров можно сказать, что наиболее вариабельными являются повторяющиеся последовательности. Обнаружение ретротранспозона в одном из фрагментов (М-10) соответствует предположению о возможной активизации мобильных элементов в культуре in vitro как одной из причин возникновения генетических изменений (Swarncar etal, 1986).
Итак, в результате проделанной работы показано, что RAPD- и ISSR-методы могут служить быстрым и достаточно надежным способом выявления на молекулярном уровне генетических различий между исходной линией кукурузы и регенерантами, полученными из каллусных культур, а также позволяют проследить динамику возникновения данных различий. Обнаружение специфических RAPD- и ISSR-фрагментов, характерных для сомаклонов в целом, каждой из групп сомаклонов, отдельных регенерантов, преобразование их в SCAR-маркеры и секвенирование способствуют, по нашему мнению, лучшему пониманию молекулярной природы сомаклональной изменчивости. 1) Отработаны методы применения молекулярных маркеров для изучения сомаклональной изменчивости у кукурузы. Выявлен высокий уровень ДНК полиморфизма сомаклонов. 2) Показано, что сомаклоналъные варианты отличались от исходной линии на молекулярном уровне. Выявлены ДНК-маркеры, характерные как для индивидуальных растений, так и для групп сомаклонов. 3) Исходя из степени генетических различий, полученных по результатам анализа RAPD- и ISSR-данных, сомаклоны разделялись на 2 кластера. Распределение сомаклонов по кластерам соответствовало их происхождению. Регенеранты, полученные после более продолжительного культивирования, отличались большим уровнем дивергенции от исходной линии, а также большим разнообразием внутри самого кластера. 4) Выявленные у регенерантов изменения наследуются при самоопылении и гибридизации их с исходной линией по доминантному и кодоминантному типам наследования. 5) На основании специфичных фрагментов были созданы SCAR-маркеры, которые дают возможность идентификации сомаклонов и исходной линии. Проведенное секвенирование SCAR-маркеров и сравнение их нуклеотидных последовательностей с имеющейся базой данных показало наличие в данных фрагментах повторяющихся последовательностей. 6) При сравнении фрагментов QR-A, характерного для исходной линии, и QR-2, характерного для сомаклонов, в последовательности QR-A обнаружена делеция с 490 по 944 позицию, которая, вероятно, является результатом сомаклональной изменчивости. 7) На основании сиквенса гена пероксидазы ZmApl на участке 165-1043 п.н. в геноме регенеранта R11, по сравнению с исходной линией А188 обнаружили точковые мутации, которые являются результатом сомаклональной изменчивости.
