Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время большой поток исследований в физиологии растений связан с изучением процессов на молекулярном и клеточном уровнях. Очевидно такой подход будет и в дальнейшем плодотворным, поскольку жизнь клетки - ее рост, деление и гибель - основа существования любого многоклеточного организма, в том числе высших растений. Индивидуальная программа развития организмов основана на различном сочетании указанных клеточных функций, важнейшей из которых является репродукция.
Создание концепции митотического цикла и открытие его периодов было сделано на клетках растений (Howard. Pelc 1953). однако детальная разработка проблемы долгое время осуществлялась, в основном, на других объектах - бактериях, простейших, дрожжах, культивируемых клетках млекопитащих. яйцеклетках морских ежей и т.д. (см. uuastler. Sherman 1959; Мэзия 1963; Епифанова, Терских 1968; Baserga 1968; Prescott 1968; 1987).
Дальнейший успех в изучении репродукции клеток был связан с получением большого числа условно-летальных штаммов дрожжей - cdc мутантов, что сформировало одно из направлений - изолирование генов, способных исправлять дефекты у этих мутантов. Центральное место среди таких генов занял cdc2. кодирующий 34-кД белок (p34cdc2) - протеинкиназу, активность которой необходима для прохождения границ между G, и S. а также G2 и М периодами клеточного цикла. Другие cdc гены кодируют различные протеинкиназы, протеин-фосфатазы, факторы транскрипции и белки (циклины). модулирующие активность p34edc2 и подобных ей протеинкиназ. Каскад протеинфос-фатазных и протеинкиназных реакций, управляющих клеточным циклом, вероятно является консервативным механизмом для многих организмов (Cross et al. 1989; Hurray. Klrschner 1989; Sherr 1994; Nagl 1994). Принцип универсальности продуктивно сработал, заставив искать функциональных двойников для cdc генов в клетках растений (см. Jacobs 1992; Doerner 1994; Ferrelra et al. 1994). Была обнаружена высокая степень гомологии с<1с2-подобных генов растений и их прототипа из дрожжей, но в тоже время выявлено разнообразие цикли-нов. Кроме того, деление клеток растений имеет ряд особенностей -препрофазные пучки микротрубочек, пространственный контроль процесса и взаиморегулирующие связи с ростом клеток. Все это указывает на то, что обнаружение cdc генов у растений - не финал истории (Francis, Halford 1995).
Знание генетики клеточного цикла безусловно важно. Однако такой подход часто дает исследователю лишь номенклатуру генов, поскольку нередко отсутствует информация о функциях кодируемых, ими белков. Даже в благополучных случаях, когда известна первичная
структура генов и активность их продуктов (порой это только связывание с белками-мишенями или с цис-элементами генома), а также имеются молекулярные зонды и антитела, весьма нетривиальной задачей остается использование всего этого арсенала в повседневной практике физиологии растений.
Встречное направлением в изучении репродукции клеток - исследование биохимии отдельных фаз клеточного цикла, вовлеченных в эти события ферментов и структурных компонентов. Важно отметить, что предположения о наличии связующих звеньев между некоторыми хорошо изученными биохимическими процессами и механизмами, регулирующими клеточный цикл, начинают оправдываться. Яркий пример - репликация ДНК у эукариот (Huberman 1991; Stlllman 1994; Helchman, Roberts 1994; Chen et al. 1995). Давно известным биохимическим маркером активной пролиферации клеток животных, указывающим на репликацию ДНК. служит активность фермента тимидинкиназы (КФ 2.7.1.21.). которая стала одним из диагностических и прогностических признаков в онкологии и других областях практической медицины, этот вопрос ежегодно рассматривается в сотнях публикаций. Кроме очевидной функции, запасного механизма синтеза тимидилата путем АТФ-зависи-мого фосфорилирования тимидина, тимидинкиназа. вероятно, играет специальную роль в регуляции клеточного цикла, участвуя в мульти-ферментном комплексе - "решштаза", сборку которого связывают с периодом репликации ДНК (Reddy, Pardee 1980; Pardee 1989). Однако в нескольких лабораториях были получены результаты, противоречащие "реплитазной" модели (см. Relchard 1988). Тимидинкиназе, вместе с другими нуклеозидкиназами и 5'-нуклеотидазами. отвели роль фермента субстратного цикла, регулирующего потоки дезоксинуклеозидов. направленные в клетку и из неб. Тем не менее, в первичной структуре клонированных тимидинкиназных генов 'животных были обнаружены специфические элементы, связывающие продукты известных cdc генов, и установлено, что экспрессия фермента в определенные периоды клеточного цикла регулируется на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях (Sherley, Kelly 1988; Dou et al. 1992; LI et al. 1993: Chang et al. 1994). Кроме того, новые экспериментальные данные возвращают нас к "реплитазной" модели и подтверждают связь тимидинкиназы с аппаратом репликации ДНК (Xu, Plunkett 1993).
Что касается растений, то ранние работы (Hotta. Stern 1963; 1965) на микроспорах Lilivm iongiflorum продемонстрировали, что тимидинкиназа появляется незадолго до синтеза ДНК, ее активность совпадает с нарастанием пула дезоксирибозидов и индуцируется тими-
дином. В других, немногочисленных к тому времени публикациях также рассматривалась корреляция активности фермента с репликацией ДНК. Однако, для многих организмов, включая растения, было показано, что фосфорилировать тимидин, по крайней мере in vitro, может нук-леозидфосфотрансфераза, КФ 2.7.1.7.7 (Brawerman, Chargaff 1955; Arlma et al. 1971). Этот факт послужил основанием для пересмотра роли тимидинкиназы у некоторых бактерий, простейших и растений. Считалось, что запасной путь образования тимидилата в клетках этих организмов осуществляется благодаря совместному действию АТФ-дег-радирующей и тимидин-АМФ фосфотрансферазной активностей. Само существование тимидинкиназы в высших растениях ставилось под вопрос, либо отрицалось (Deng and Ives 1972; НоГтап and Schwarz 1978).
В настоящее время создалась двойственная ситуация. С одной стороны, до сих пор распространено мнение об отсутствии или малой значимости тимидинкиназы в высших растениях, что сдерживает работы по исследованию роли этого фермента в регуляции клеточного цикла. С другой стороны, в единичных случаях, активность фермента используют как значимый показатель пролиферации клеток растений или их способности реутилизировать тимидин (Georgieva et al. 1994; Wu, King 1994). В связи с этим, а также учитывая возросший интерес к тимидинкиназе клеток животных, решение вопроса о существовании фермента у высших растений и его функциональной значимости является одной из актуальных проблем физиологии клеток растений.
Цель и задачи работы. Основная цель настоящей работы состояла в исследовании функциональной значимости тимидинкиназы в клетках высших растений. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Выявить связь активности тимидинкиназы с пролиферацией клеток, используя различные ткани интактных растений, популяции культивируемых клеток и протопластов, контролируя возможный вклад неспецифической нуклеозидфосфотрансферазы (НФТ).
-
Определить приуроченность активности фермента к отдельным периодам клеточного цикла.
-
Исследовать функциональную топографию тимидинкиназы в клеточном цикле.
-
Провести выделение и очистку тимидинкиназы из проростков Vicia /aba и исследовать основные физико-химические и кинетические свойства фермента.
-
Оценить соотношение тимидинкиназной и НФТ активностей in vivo, используя активно пролиферирующую суспензионную культуру клеток.
Научная новизна. Впервые из высших растений была выделена ти-мидинкиназа и исследованы ее основные физико-химические и кинетические свойства. Предполагается, что в нативном виде фермент существует в форме тетрамера, состоящего из 30-кД субъединиц, и собственно мономеров. Ряд свойств являются общими для тимидинкина-зы из кормовых бобов и других организмов, что позволяет рассматривать эти ферменты как представителей одного семейства.
Получены данные о положительной корреляции между активностью тимидинкиназы и уровнем пролиферации клеток. Показано наличие ферментной активности в ядрах клеток, синхронизированных по S периоду клеточного цикла и в хроматине синтезирующих ДНК клеток. Установлено, что вступление в S период сопровождается подъемом активности тимидинкиназы - раньше в цитозоле, чем в хроматине, где она сохраняется до конца G2 фазы.
Выявлено, что in vivo экзогенный тимидин быстро транспортируется в клетки и фосфорилируется преимущественно за счет функционирования тимидинкиназы. При возрастании наружной концентрации тими-дина выше 100 мкМ предполагается подключение второго механизма фосфорилирования тимидина - неспецифической НФТ.
На основании обобщения собственного экспериментального материала и литературных данных представлена гипотеза о разделении функций между тимидинкиназой и НФТ в клетках растений. Специфичный к тимидину фермент связан с репродукцией клеток, в то время как НФТ осуществляет перераспределение фосфата между нуклеозидами, препятствуя непропорциональному возрастанию концентрации какого-либо одного нуклеотида.
Научно-практическое значение. Представленная работа является фундаментальным исследованием, показывающим структурно-функциональное сходство тимидинкиназы, впервые выделенной из высших растений, с аналогичными ферментами из клеток организмов других систематических групп. Полученные данные вносят новый вклад в представление об универсальности биохимических механизмов вовлеченных в важную для клеток функцию - деление.
Работа может быть адаптирована к повседневной практике физиологии растений, в которой предлагается использовать экспериментально-обоснованный маркерный признак пролиферации "клеток - активность тимидинкиназы. Кроме того.материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии и биохимии растений.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены или преде-
тавлены: на II и V Международных симпозиумах молодых ученых по регуляции метаболизма растений (Варна. 1981; София 1991): I и III Всесоюзных совещаниях "Клеточный цикл растений" (Канев. 1982; Паланга 1986); семинарах Института экспериментальной ботаники (Ческе Будеевице 1982; Прага 1983); IV Всесоюзной конференции "Культура клеток растений и биотехнология" (Кишинев. 1983); Объединенном конгрессе Европейского общества по культуре тканей (ETCS) и (EU-RES) - Ретикулоэндотелиального общества (Будапешт. 1983); Международном симпозиуме "Культура тканей и клеток растений в применении к сельскому хозяйству" (Оломоуц. 1984); II Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Москва. 1986): цитологическом семинаре им. И.Н. Свешниковой (Москва. 1986); VII Международном конгрессе по культуре тканей и клеток (Амстердам. 1990); семинаре научно-исследовательских лабораторий фармацевтической компании Wakunaga (Хирошима. 1991); II Российском симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино. 1993); II Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы. 1993); Конференции "Генетика соматических клеток в культуре" (Черноголовка. 1993): IV Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, 1994); расширенном семинаре ИФР РАН (Москва. 1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объекты и методы исследований, результаты и обсуждение, заключение, выводы, литература. Работа изложена на 215 страницах машинописного текста, содержит 45 рисунков. 16 таблиц, список литературы включает 322 наименования.
