Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Осина (Populus tremula L.) как объект исследований 10
1.2. Клональное микроразмножение 12
1.2.1. Этапы и факторы клонального микроразмножения 14
1.2.2. Индукция развития пазушных меристем 15
1.2.3. Растения рода Populus как объект для получения культуры тканей 16
1.3. Создание трансгенных растений 17
1.3.1. Методы переноса генетического материала 17
1.3.1.1. Трансформация растений на основе агробактериального вектора 18
1.3.1.2. Трансформация inplanta.. 21
1.3.2. Трансформации растений рода Populus 24
1.4. Конъютирование ИУК 29
1.4.1. Гликозильные конъюгаты ИУК 31
1.4.1.1 УДФГ-трансфераза из кукурузы и ген ugt {iaglu), кодирующий этот фер мент 33
1.4.1.2. Трансформация растений геном ugt 35
1.5. Гомеостаз ИУК 39
1.5.1. Особенности инактивации ауксина в культуре клеток и тканей растений 40
1.5.2. Гомеостаз ИУК на разных стадиях онтогенеза 41
1.6. Растения с измененным ауксинсвым гомеостазом 45
1.6.1. Мутантные растения арабидопсиса 45
1.6.2. Трансформация растений генами бактериального пути биосинтеза ИУК 46
1.7. Белки, связывающие ацил-Кофермент А 49
1.7.1. Растительные белки, связывающие ацил-КоА 51
2. Цель и задачи исследований 58
3. Объекты и методы исследований 59
3.1. Объекты исследований 59
3.1.1. Растительный материал 59
3.1.1.1. Стерилизация исходных эксплантов 59
3.1.1.2. Условия клонального микроразмножения растений 60
3.1.1.3. Условия выращивания растений на фитотроне и в открытом грунте...61
3.1.2. Бактериальные штаммы .61
3.1.2.1. Условия культивирования бактериальных штаммов 64
3.1.2.2. Трехродительское скрещивание 64
3.2. Трансформация растений 64
3.2.1. Условные обозначения трансформированных растений 65
3.3. Селекция трансформированных растений .65
3.4. Выделение плазмидной ДНК 66
3.5. Выделение растительной ДНК 66
3.6. Выделение тотальной РНК из растений 67
3.7. Полимеразная цепная реакция 68
3.8. Саузерн блот гибридизация 69
3.8.1. Приготовление ДНК-блотов по Саузерну 69
3.8.2. Приготовление меченого зонда. 70
3.8.3. Гибридизация по Саузерну 71
3.9. Гибридизация РІЖ .73
3.10.Определение активности Р-глюкуронидазы 73
3.11. Количественное определение содержания ИУК 74
3.12. Определение активности УДФГ-трансферазы 75
3.13. Статистическая обработка данных ...75
3.14. Использованные реактивы 76
4. Результаты исследований 77
4.1. Получение трансконъюгантов и их анализ .77
4.2. Получение трансформированных растений и отбор трансформантов по активности маркерных ферментов 79
4.2.1. Введение в культуру in vitro растений осины 79
4.2.1.1. Индукция корнеобразования у растений осины 79
4.2.1.2. Влияние ИМК на корнеобразование осины 80
4.2.1.3. Индукция развития пазушных меристем 81
4.2.2. Устойчивость трансформированных растений к селективному антибиотику 83
4.2.3. Изучение активности маркерного фермента Р-глюкуронидазы в трансгенных растениях осины 86
4.3. Молекулярно-биологические доказательства трансформации 88
4.3.1. Доказательства интеграции гена acb в геном растений осины 88
4.3.2. Доказательства интеграции и экспрессии гена ugt в трансгенных растениях осины 94
4.4. Биохимические подтверждения состоявшейся трансформации 101
4.4.1. Активность УДФГ-трансферазы в трансгенных растениях осины 101
4.4.2. Изучение влияния трансформации на содержание свободной ИУК в трансгенных растениях ...103
4.4.3. Влияние ИУК на рост трансгенных растений осины, 104
4.5. Оценка физиологических параметров трансгенных растений 108
4.5.1. Рост трансгенных растений осины in vitro 108
4.5.2. Трансгенные растения в условиях фитотрона 113
4.5.3. Рост трансгенных растений осины на полевой делянке 116
4.5.4. Фенологические наблюдения за трансгенными растениями, произрастающими на полевой делянке 118
5. Обсуждение 122
Заключение 37
Выводы 139
Литература 141
- Растения рода Populus как объект для получения культуры тканей
- Трансформация растений генами бактериального пути биосинтеза ИУК
- Условные обозначения трансформированных растений
- Фенологические наблюдения за трансгенными растениями, произрастающими на полевой делянке
Введение к работе
Генетическая инженерия растений открывает широкие возможности для изучения функционирования растительных организмов и регуляции протекающих в них биохимических и физиологических процессов. В перспективе это позволит влиять на свойства растений, изменять их характеристики или придавать новые свойства, включая самые разные направления: увеличение продуктивности, усиление резистентности к болезням, пестицидам, стрессам со стороны окружающей среды, качественные изменения состава плодов и семян и т.д. Сегодня накоплен большой опыт конструирования генетически модифицированных растений и имеются примеры успешного решения ряда задач (Кучук, 1997; Ку-рочкина, Картель, 1998; Hansen, Wright, 1999; Hammond et al., 2000; и др.).
Известно, что одну из систем регуляции и интеграции у целого растения представляет собой гормональная система (Полевой, Саламатова, 1991). Процессы роста и развития в целом, а также отдельные этапы онтогенеза и морфо-физиологические явления (регенерация, дифференцировка ксилемы, цветение, завязывание и рост плодов, образование клубней и луковиц) в значительной мере связаны с гормональным балансом, или гормональным статусом, который складывается из содержания и соотношения различных фитогормонов, ведущим из которых является ауксин (Гуськов, 1991).
Лесное хозяйство является перспективной областью применения методов генной инженерии. Одной из основных проблем лесоводства является интенсификация процессов выращивания деревьев (Sennerby-Forsse, 1986; Toivonen et al., 1994; Царев, Мироненко, 1997; Кулагин, Кагарманов, 1997; и др.). В настоящее время проблема управления ростом растений и поиск путей его ускорения относятся к числу наиболее важных.
С развитием технологии переноса генов в древесные растения, модификация баланса эндогенных фитогормонов с помощью генной инженерии является потенциальным инструментом для изучения гормональной регуляции роста, а также для достижения желаемых модификаций свойств древесины.
ИУК является важным морфогеном в дифференциации сосудистой ткани, что было показано как в системе культуры клеток и тканей, так и в интактных растениях (Момот, Смирнова, 1978; Гамбург и др., 1990; Sachs, 1981; Jacobs, 1984; Aloni, 1987; Roberts et al., 1988; и др.). В древесных растениях полярный транспорт ИУК является критическим фактором для поддержания структуры и активности сосудистого камбия, который обусловливает вторичный рост стебля (Федорова, 1982; Меняйло, 1987). Известно также, что процесс ксилогенеза представляет собой одно из центральных по энергоемкости и аккумуляции органического вещества звеньев в онтогенезе древесного растения (Меняйло, 1987). Хотя молекулярные механизмы действия ИУК на эти процессы полностью не раскрыты, очевидно, что статус ИУК в древесных растениях является критическим фактором количества и качества образованной древесины (Tuomi-nenetal., 1995).
Ряд исследователей занимались изучением влияния фитогормонов на рост древесных растений, и была установлена прямая корреляция между интенсивностью роста и содержанием ауксина в органах древесных растений в физиологически оптимальных пределах (Mirov, 1967; Васильева, 1970; Федорова, 1982; Zakrzewski, 1991).
Рядом коллективов авторов были получены травянистые и древесные трансгенные растения, сверхэкспрессирующие гены бактериального пути биосинтеза ИУК (Пустовойтова и др., 2001; Klee et al., 1987; Sitbon et al., 1991; 1992a; 19926; Romano et al., 1993; Tuominen et al., 1995). Большинство полученных растений характеризовались высоким содержанием ИУК и аномальным фенотипом, проявляющимся вследствие гиперауксиноза. По предположению авторов, высокий уровень биосинтеза способствовал накоплению ИУК в токсических концентрациях вследствие того, что эффективность систем инактивации гормона (его конъюгирования) отставала от его биосинтеза.
Использование в данной работе для трансформации гена ugt из кукурузы представляло интерес в связи с тем, что кодируемый этим геном фермент УДФГ-трансфераза осуществляет обратимую реакцию конъюгирования ИУК с глюкозой, контролируя ключевой этап связывания свободного гормона. Интеграция в геном растений осины этого гена и его экспрессия должны приводить к изменению на определенных этапах метаболизма ауксина и оказать воздействие на пул свободной и конъюгированной ИУК, изменяя ауксиновый гомеостаз в растениях и регуляцию ростовых процессов.
Использование для трансформации различных генетических конструкций, содержащих ген асЪ из арабидопсиса, также представляет интерес, поскольку функции белка, связывающего ацил КоА, в растениях мало изучены, и введение дополнительной дозы гена "домашнего хозяйства" может оказать влияние на метаболизм липидов и связанные с ним процессы.
В данной работе представлены результаты трансформации растений оси-ны генами ugt и асЪ. В полученных трансгенных растениях наблюдали увеличение активности УДФГ-трансферазы, содержания эндогенной ИУК, что коррелировало с более высокими ростовыми параметрами ряда вариантов опытных растений при выращивании in vitro и в полевых условиях. Представленные данные согласуются с данными других авторов по результатам получения трансгенных растений арабидопсиса, сверхэкспрессирующих собственный ген ugt (Jackson et al., 2002). Полученные результаты свидетельствуют о том, что трансформация с использованием данных конструкций генов приводит к изменению ауксинового статуса растений и вследствие этого изменению интенсив-ности процессов роста.
Полученные в данной работе трансгенные растения могут являться модельными объектами для изучения влияния трансформации генами ugt и асЪ на древесные растения. Изучение физиологических и биохимических параметров трансформированных растений осины может способствовать пониманию роли белковых продуктов перенесенных трансгенов в метаболизме и процессах роста древесных растений, что обусловливает фундаментальное и прикладное значение работы. Полученные быстрорастущие растения осины могут использоваться для создания коротко-ротационных лесных плантаций. Накопленный опыт может послужить основой при дальнейшей работе с древесными растениями в целях получения форм с новыми полезными свойствами.
Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы члену-корреспонденту РАН доктору биологических наук Рюрику Константиновичу Саляеву, доктору биологических наук Наталье Игоревне Рекослав-ской за постоянное внимание, всестороннюю помощь в работе и ценные замечания при написании рукописи. Сердечная благодарность за обсуждение результатов, помощь в работе и доброжелательную атмосферу всем сотрудникам лаборатории физиологии трансгенных растений СИФИБР СО РАН.
Растения рода Populus как объект для получения культуры тканей
Многие исследователи отмечают высокую каллусообразовательную способность тополей среди всех коммерчески важных лесных пород (Bytchenkova, 1963; Lubrano, 1992). Это обуславливает их использование в качестве удобного модельного объекта исследований по культуре тканей. Еще в 1934 г. R.J. Gauthered показал, что камбиальные ткани P. nigra L. можно культивировать на синтетической среде в асептических условиях и при этом получать активно пролиферирующую меристематическую ткань (Lubrano, 1992). Позже К.Е. Wolter (1968), L.L. Winton (1968; 1970), V. Chalupa (1974) смогли из камбиальных тканей разных видов тополя получить каллусы и добиться регенерации побегов и корней. В 1970 г. L.L. Winton впервые для древесных видов удалось получить из каллусной культуры триплоидной линии несколько растений P. tremuloides (Winton, 1970). С того времени многие исследователи занимались проблемами каллусообразования и регенерации тополей. Были проведены эксперименты по получению растений-регенерантов в культуре пыльников, женского гаметофита, из суспензии клеток (Lubrano, 1992). Были разработаны технологии клонального микроразмножения путем образования побегов из боковых и адвентивных почек стеблевых междоузлий (Coleman, Ernst, 1989; Douglas, 1985; Ernst, Coleman, 1991; Rutledge, Douglas, 1988), а также каллусных культур, полученных из почек и меристем (Lubrano, 1992). O.S. Cheema (1989) исследовал возможность соматического эмбриогенеза в суспензии клеток и каллусной культуре P. ciliata. Также на тополях проводились исследования по выделению протопластов из мезофилла листьев и их слиянию, получению регенерантов и растений (Park, Son, 1992). Таким образом, различные способы клонирования in vitro широко применяются для быстрого получения вегетативного потомства растений. В том числе, объектами этих исследований служат многие виды рода Populus. Но для успешного размножения каждого отдельного вида и клона требуется индивидуальный подход на всех этапах клонального микроразмножения. Цель генетической инженерии растений состоит во введении в растение генов из других организмов, получении продуктов этих генов и, в конечном итоге, изменении наследственности. При этом возникают две основные проблемы.
Первая — это поиск и выделение генов растительного или другого происхождения, введение которых привело бы к желаемым результатам. Наиболее желательными признаками могут быть устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, резистентность к болезням, вредителям, гербицидам и пестицидам, высокая скорость роста, скороспелость и т.д. (Курочкина, Картель, 1998). Трудность состоит в том, что большинство этих свойств кодируется не одним геном, а целым комплексом генов. Вторая проблема заключается в разработке методов переноса чужеродных генов с последующей стабильной экспрессией новых генов в растениях на требуемых стадиях развития. (Пирузян, 1988). Методы переноса генов в растения можно разделить на две группы: биологические - перенос генов с помощью векторных систем и физические - методы прямого переноса генов в растения (McCown et al., 1991). Первая группа методов базируется на создании векторов. Вектор — это рекомбинантная молекула ДНК (или РНК), в которую может быть встроен.чужеродный ген и помещены элементы автономного репликона, а также сигнальные последовательности для обеспечения экспрессии встроенного гена, лишенного, как правило, собственных регуляторных элементов (Пирузян, 1988). Э.С. Пирузян (1988) выделяет четыре категории векторов: 1. полученные на основе природных растительных векторов, способные интегрироваться в хозяйский растительный геном — Ti-плазмиды Agrobacte-rium tumefaciens и Ri-плазмиды A. rhizogenes; 2. полученные на основе растительных патогенов, которые характеризуются естественной способностью к введению чужеродной ДНК (или РІЖ) в растения (фитовирусы, вироиды); 3. векторы, которые могут существовать как независимые репликоны в растительных клетках (митохондриальная или хлоропластная ДНК); 4. полученные на основе нестабильных компонентов генома растений (транс-позоны). Альтернативными являются методы прямого переноса чужеродной генетической информации (переноса "голой" ДНК) путем трансформации, микроинъекции, электропорации, переноса, опосредованного упаковкой в липосомы, путем кокультивации растительных протопластов со сферопластами бактерий, с использованием генной пушки. Преимущество этой группы методов заключается в том, что не требуется получения специальных генных конструкций и можно использовать любой экспрессирующий ДНК-вектор, содержащий желаемый для встраивания в растительный геном ген (Дрейпер и др., 1991). Трансформация растедий посредством агробактерии применяется в генетической инженерии многих видов, поскольку круг растений-хозяев этих патогенов достаточно широк и включает большинство двудольных растений, голосеменных и ряд однодольных. A. tumefaciens — почвенная бактерия из семейства Rhizobiaceae. После контакта поврежденной растительной ткани с агробактериями клетки растений начинают быстро и неорганизованно расти, образуя опухоли - "корончатые галлы". Эти клетки секретируют особые вещества — производные аргинина, называемые опинами. Опины служат источником питания для агробактерий, по их типу вид A. tumefaciens подразделяется на штаммы — октопиновые, нопали-новые, агропиновые и т.д. (Дрейпер и др., 1991). Агробактерия способна переносить и встраивать часть своей большой Ti-плазмиды (от англ. tumour-induced) (около 200 тыс. п.н.), так называемую Т-ДНК (от англ. transfer), в ядерный геном растений, причем в районы хромосом высокой транскрипционной - активности (Кучук, 1997).. Установлено, что при трансформации несколькими агробактериями интеграция трансгенов происходит в один локус (Chen et al., 1998; Gelvin, 1998; Poirier et al., 2000). В ряде трансгенных растений обнаружено присутствие последовательностей ДНК, прилегающих к области Т-ДНК (Frary, Hamilton. 2001). Важную роль в процессе переноса Т-ДНК в геном растительных клеток играют так называемый Vir-район Ti-плазмиды и гены, расположенные на бактериальной хромосоме (chv-гены). Индукторами, активирующими гены F/r-района, являются фенольные соединения ацетосирингон и гидрооксиацетосирингон, выделяемые при поранении растительной клетки (Кучук, 1997). Функционирование генов Г/г-района приводит к образованию однонитевых молекул Т-ДНК. Система переноса этих молекул в растительные клетки, по-видимому, схожа с конъюгативным переносом ДНК у бактерий. Это предположение подтверждается наличием специфических F-пилей у штаммов агробактерий, несущих Ті-плазмиду. У потерявших Ті-плазмиду штаммов, а также в отсутствие индуктора ацетосирингона образования F-пилей не наблюдается. Предполагается, что для осуществления интеграции Т-ДНК в растительный геном необходимы внутриклеточные ферменты растительной клетки, которые участвуют в репарации ДНК (Чумаков, 2001).
Трансформация растений генами бактериального пути биосинтеза ИУК
В Т-ДНК A. tumefaciens присутствуют гены, кодирующие ферменты синтеза ИУК. Несмотря на прокариотическое происхождение, гены Т-ДНК — типичные эукариотические гены. Ген 1 (tmsl или іааМ соответственно от tumour morphology shooty или indolyl acetic acid) кодирует триптофанмонооксигеназу, которая превращает триптофан в индолил-3-ацетамид. Последний затем гидро-лизуется в ИУК индолилацетамидгидролазой - продуктом гена 2 (tms2 или iaaH). Ряд коллективов авторов проводили трансформацию листовых дисков или декапитированных проростков табака бинарными векторами, созданными на основе PCV701 и несущими гены іааМ и iaaH (Inze et al., 1984; Karlin-Neumann et al, 1991; Sitbon et al., 1991; 1992a; 19926; Gaudin et al., 1994). Растения трансформировали конструкциями этих генов под сильными промоторами 19S или 35S, при этом у трансформированных растений было значительно увеличено содержание ИУК. В некоторых работах гены 1 и 2 сшивали с дифференциально регулируемыми промоторами mas (из гена маннопин-синтазы, экспрессирующимся в корнях) и st-lsl (Solanum tuberosum - leaf/stem specific gene, экспрессирующимся в листьях и стеблях). Как правило, растения, трансформированные подобными конструкциями, имели аномальный фенотип, но увеличение количества ИУК было отмечено лишь в некоторых случаях. Л.А. Луговой и др. (1998) был проведен обзор работ по трансформации этими генами и в обобщенном виде представлены фенотипические эффекты, проявляющиеся у трансгенных растений растений табака (Табл. 1). Т.В. Бавриной и др. (1996) также была проведена трансформация листовых дисков табака бинарным вектором рСВ1349 с генами tmsl и tms2. У полученных трансгенных растений в молодом возрасте происходило подавление роста и цветения, у старых - наблюдали усиление вегетативного морфогенеза и одновременное ускорение репродуктивного развития (Баврина и др., 1999). Авторы этих работ отмечают, что обогащение растений ИУК привело к повышению оводненности листьев, усилению роста надземной массы растений, а таюке увеличению стойкости к обезвоживанию и перегреву в условиях почвенной за сухи.
Трансгенным растениям было свойственно повышение уровня осмолитов и содержания свободных аминокислот и амидов, что, по предположению авторов, могло способствовать удерживанию воды в тканях. Также установлено, что возрастание уровня ИУК вызывает увеличение содержания АБК, изменяя в целом гормональный статус растений (Пустовойтова и др., 2001). Полученные результаты позволили авторам сделать вывод о том, что трансформация генами tmsl и tms2 способствует накоплению в растениях ИУК и АБК, активации ос-морегуляции и приводит к формированию механизмов засухо- и жароустойчи-вости. При исследовании мужской стерильности обнаружено, что суперпродукция ауксина не сказывается отрицательно на процесс формирования жизнеспособной пыльцы (Миляева и др., 2001). X. Туоминен с соавт. (Tuominen et al., 1995) трансформировали стеблевые сегменты гибрида P. tremula х P. tremuloides кокультивацией с агробактерией, в которую помещали бинарные векторы, созданные на основе pCV720, со встроенными генами iaaM и iaaH. Трансгенные растения обладали высоким уровнем биосинтеза ауксина и проявляли фенотипические отличия от растений дикого типа: уменьшение высоты побега, размера листовой пластинки, диаметра стебля, а также усиленное апикальное доминирование.
В этих растениях был зафиксирован измененный баланс ИУК, при этом содержание свободной ИУК в апекальной части и взрослых листьях почти не изменялось, в то время как в корнях происходило его увеличение в 2,2 раза. Также зафиксировано увеличение пула конъюгированной ИУК в корнях в 4 раза и в зрелых листьях в 1,5 раза по сравнению с диким типом. Изменения в анатомическом строении стебля проявлялись в уменьшении размера сосудов, увеличении их плотности и измененном развитии ксилемных лучей вследствие высокого содержания эндогенной ИУК. Так авторам этих исследований удалось проследить влияние изменения баланса ИУК на развитие ксилемы в интактной экспериментальной системе, а также показать возможность манипуляций со свойствами древесины путем контролируемых изменений концентрации ИУК и ее распределения. Таким образом, введение в растения генов биосинтеза ИУК в большинстве случаев приводило к фенотипическим изменениям, соответствующим эффекту гиперауксиноза. Как правило, полученные растения имели пониженную скорость роста и более низкие ростовые параметры, по сравнению с нетрансформированными растениями. По результатам экспериментов, авторы сделали предположение, что существует регулирующая ИУК система, которая поддерживает ее концентрацию на нетоксичном или физиологически оптимальном уровне (Sit-bon et al., 1991; 1992a; 19926). Связывание ИУК является одним из регуляторных механизмов, способствующих поддержанию стационарного пула ИУК во время роста и развития растения (Sitbon et al., 1991). Эти выводы были основаны на том, что содержание ИУК в трансгенных по генам 1 и 2 растениях только слегка увеличивалось, тогда как уровни конъюгатов ИУК были значительно повышены. Аномальный фенотип трансгенных по генам 1 и 2 растений, где был использован сильный промотор 19S или 35S, видимо, можно объяснить тем, что защитные механизмы поддержания баланса фитогормонов растения (система конъюгирования) не могут справиться с таким большим подъемом концентрации ИУК (Sitbon et al., 1991; 19926). В связи с этим в данной работе представлялось интересным оценить влияние на растения осины трансформации геном ugt, кодируемый фермент которого катализирует реакцию связывания ауксина.
Условные обозначения трансформированных растений
Черенки трансформированных растений помещали на среду, содержащую селективный антибиотик канамицин в концентрации 10-50 мг/л, при этом каждые 10 дней растения переносили на свежую среду. Устойчивость к антибиотику определяли по способности черенков к корнеобразованию и дальнейшему росту побегов, а также отсутствию признаков хлороза. Как правило, эффективность трансформации составляла 5 - 10 %. Растения, прошедшие селекцию на канамицине, клонировали in vitro и использовали для дальнейших экспериментов.
Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al., 1989). Осадок ДНК высушивали в термостате при 37С и растворяли в 20 - 50 мкл стерильной бидистиллированной воды. Полученный препарат плазмидной ДНК хранили при -20С в центрифужных пробирках типа "Эппендорф".
Выделение растительной ДНК проводили с помощью додецилсульфата натрия (ДСН) и протеиназы К (Sambrook et al., 1989). В качестве объекта использовали клонируемые in vitro контрольные и трансгенные растения, а также молодые побеги с листьями, срезанные с деревьев, произрастающих на полевой делянке. 1 г растительной ткани замораживали в жидком азоте, растирали в порошок, переносили в центрифужную пробирку и добавляли 7 мл экстракционного буфера, содержащего 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 100 мМ ЭДТА; 250 мМ NaCl; 10 мкг/мл РНКазы А; 10 мкг/мл протеиназы К. Затем добавляли 410 мкл 10% ДСН, перемешивали и инкубировали на водяной бане при 55"С в течение 2 ч. Далее пробирки охлаждали на льду и центрифугировали при 5 500 g 10 мин при 4С. Отбирали супернатант, добавляли 0,8 объема холодного изопропанола и оставляли на льду или осторожно перемешивали, вращая пробирку, для осаждения ДНК. Затем либо центрифугировали в течение 20 мин при 5 500 g (4С), либо накручивали образовавшиеся волокна на стеклянный крючок и переносили в свежие пробирки. Дважды промывали 70 % этанолом, образцы высушивали в термостате при 37С и растворяли в 50 - 100 мкл воды. Для выделения растительной ДНК использовали также наборы Nucleon Extraction and Purification Kit или Nucleon Phytopure (Amersham Life Science, Англия). Выделение тотальной РНК проводили по протоколу фирмы Promega (США, 1993) из клонированных in vitro контрольных и трансгенных растений осины.
При подготовке к выделению РНК для освобождения от РНКаз используемую воду обрабатывали 0,1% диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) при 37"С в течение ночи и затем автоклавировали для разложения ДЭПК. Лабораторную стеклянную и пластиковую посуду замачивали в обработанной ДЭПК воде на 2 ч при 37"С, затем тщательно промывали в воде, обработанной таким же способом, и автоклавировали. Растворы, используемые для выделения РНК, обрабатывали 0,1% ДЭПК при 37С в течение ночи и автоклавировали, либо готовили на обработанной ДЭПК воде. Ступки и пестики заворачивали в фольгу и прокаливали в течение ночи в сушильном шкафу при температуре 200 С. Во время эксперимента пользовались стерильными одноразовыми перчатками.
Быстро готовили навески свежего растительного материала массой 1 г и как можно быстрее замораживали их в жидком азоте. Добавляли 0,1 г окиси алюминия и 1 г Polyclar AT согласно методу К. Pawlowski и др. (1994), используемому для тканей, содержащих большие количества фенольных веществ. Пестиком растирали в мелкий порошок, переносили в центрифужные пробирки и добавляли 12 мл денатурирующего буфера, содержащего 4 М гуанидинтиоцианата, 42 мМ цитрата калия, 0,83% N-лауроил саркозина, 0,2 мМ меркаптоэтанола (МЭ). Затем добавляли 1,2 мл ацетата калия рН 4,0 и осторожно перемешивали. В пробирки вносили 12 мл смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25 : 24 : 1), встряхивали в течение 10 секунд, охлаждали на льду 15 мин и центрифугировали при 10 000 g 20 мин при 4"С. Верхнюю водную фазу, содержащую РНК, осторожно переносили в свежие центрифужные пробирки, добавляли равный объем изопропанола и инкубировали образцы при -20С в течение ночи для осаждения РНК. Затем центрифугировали при 10 000 g 15 мин при 4вС. Осадок РНК растворяли в 5 мл денатурирующего буфера, добавляли равный объем изопропанола и повторяли осаждение РНК. После повторного центрифугирования осадок промывали 10-ю мл охлажденного на льду 80% этанола. РНК высушивали в вакуумном эксикаторе в течение 10-15 мин, растворяли в 100-120 мкл воды, свободной от РНКаз, и хранили при -20 С.
Анализ плазмидной ДНК и ДНК растений проводили методом ПЦР. Праймеры к гену acb, имеющему размер 279 п.н., были созданы Р. Паковски (Pacovsky, 1996). На 5 конце прямого праймера находится сайт рестрикции Ndel, 3 конец кодирующей последовательности гена ограничен сайтом рестрикции ВатШ (обозначены строчными буквами), при этом размер продукта амплификации составляет 289 п.н.
Фенологические наблюдения за трансгенными растениями, произрастающими на полевой делянке
В течение вегетационного периода с мая по сентябрь 2001, 2002 и 2003 гг. проводили фенологические наблюдения за трансформированными растениями, произрастающими в полевых условиях. Раньше других начали набухать почки у растений, трансформированных генами ugt и ugt+acb502, причем у первых почки были самых крупных размеров, а у вторых отмечены как самые мелкие. Раньше других листья начали распускаться у осины варианта ugt+acb502 с опережением контрольных растений на 7 дней (Рис. 31, Табл. 15). Так, в 2001 г. 15 мая у контрольных растений отмечали только набухание почек, у опытных растений ugt+acb502 распускались листья на всех побегах. У растений, трансформированных геном ugt, начинали лопаться почечные чешуи. К 22 мая растения варианта ugt+acb502 были полностью облиственными, у остальных растений еще раскрывались почки и начинали распускаться листья. К 25 мая на всех побегах распустились листья у растений вариантов ugt и ugt+acb504. У контроля и ugt+acb304 на нижних побегах еще только раскрывались почки. У растений, трансформированных генами ugt+acb302 и ugt+асЬЗОЗ, все почки раскрылись, но по скорости распускания листьев эти растения отставали от контрольных.
Осенью раннее старение листьев отмечали для растений ugt и ugt+acb504 (Рис. 32, Табл. 16). У контрольных, ugt+acb303, ugt+acb304 растений пожелтение листьев, некрозы появлялись позднее. У растений ugt+acb302, ugt+acb502 старение листьев начиналось на 7 - 9 дней позднее, чем у контрольных растений. Таким образом, трансгенные растения имеют отличия от нетрансфор-мированных растений в наступлении фенологических фаз. В результате проведенных фенологических наблюдений интересными оказались растения ugt+acb502. Весной они распускались раньше других, а листопад начинался позднее. Срок их вегетации, по сравнению с контрольными растениями, был удлинен на 2 - 3 недели.
Осина как древесная порода в последнее время приобретает важность с точки зрения промышленного использования благодаря ее экологической устойчивости, свойствам древесины, а также как объект для получения биомассы и создания энергетических плантаций. Известно, что осина трудно размножается стеблевыми черенками, и вследствие этого лесонасаждения этой породы создаются главным образом из Семян. Семенное потомство,- как правило, генетически разнородно, а качественные характеристики проявляются спустя значительный период времени (по меньшей мере половина возраста ротации и/или зрелости). К тому же, всегда возникают проблемы с эксплантами от зрелых деревьев для микроклонального размножения. Стоимость растений, полученных микроразмножением, в 2 - 3 раза выше стоимости саженцев, выращенных из семян (Lubrano, 1992), но она окупается за счет получения генетически более однородного материала. В связи с этим очевидна необходимость исследований, предшествующих получению генетически измененных древесных растений.
Из существующих способов клонального микроразмножения (пока един- ственно реального в отношении лесных древесных пород) один из наиболее продуктивных основан на черенковании микропобегов. Этот метод в настоящее время применяется в ряде стран для размножения в промышленных масштабах некоторых пород деревьев (Родин, Калашникова, 1995). Тем не менее, опыт показывает, что при работе с каждым отдельным видом и клоном необходимо использовать индивидуальный подход к подбору условий культивирования in vitro и клонирования. Поэтому одной из первых задач было введение в культуру растений осины P. tremula и подбор условий для их клонального микроразмножения.
Для поддержания физиологически оптимального уровня ИУК в тканях и клетках растение располагает эффективными механизмами регулирования скорости синтеза гормона, его конъюгирования и разрушения. Становление оптимального уровня активного гормона, способного обеспечить потребность растения в регуляции протекающих в данный момент гормон-зависимых процессов, связано с целым рядом внутренних факторов, зависящих от реализации поступающей от генетического аппарата клетки информации (Гуськов, 1991). Нами был применен генно-инженерный способ изменения свойств осины в результате переноса гена ugt, выделенного из кукурузы, использование которого для трансформации ряда культурных растений растений приводило к получению форм с ускоренным темпом роста и повышенной устойчивостью к гербицидам и другим ксенобиотикам (см. главу 1.4.1.2), и гена acb, выделенного из арабидопсиса и принимающего участие в биогенезе мембран посредством связывания и транспорта эфиров ацил-КоА (см. главу 1.7).
Поскольку фермент УДФГ-трансфераза (ИУК-глюкоза синтаза) контролирует ключевое звено в регуляции относительного количества свободной и этерифицированной ИУК у кукурузы, предполагалось, что экспрессия внесенного гена ugt приведет к изменениям в содержании ИУК, что позволит проследить влияние изменений баланса ауксина на физиологические и биохимические характеристики древесных растений.
Также предполагалось, что дополнительно вводимая доза гена acb будет способствовать усилению связывания эфиров ацил-Ко-А, что может привести к изменению определенных этапов метаболизма жирных кислот, играющих важную роль в биогенезе мембран. Так как функции белка, связывающего ацил-Ко А, в растениях мало изучены, представлялось интересным оценить эффект использования различных конструкций с этим геном (в том числе и в антисмы-словой ориентации) на рост растений осины при совместном использовании для трансформации с геном ugt.
Из семян осины после получения стерильной культуры, подбора условий культивирования in vitro и клонирования были получены два клона, отличающиеся между собой по скорости роста, размеру листовых пластинок, образованию корней. Для исключения внутрипопуляционной изменчивости для дальнейшей работы были выбраны растения одного клона, которые в условиях in vitro потенциально обладали-более высоким темпом роста.
