Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Влияние засоления на растения 8
1.2. Водный обмен растении и его роль в реакции на засоление 16
1.3. Регуляция роста клеток растяжением в норме и при водном стрессе 24
1.4. Роль гормонов в регуляции роста и водного обмена у растений 32
1.4 1. Абсцизоваякислота 32
1.4.2« Ауксины- 37
2. Объект и методы исследования 43
2.1. Условия выращивания растений и проведения экспериментов 43
2.2. Методы исследования. 44
2.2.1. Определение скорости транспирации 44
2.2.2. Измерение роста растений 44
2.2.3. Определение осмотического потенциала 44
2.2.4. Определение устьичной проводимости 45
2.2.5. Экстракция, очистка и концентрирование гормонов 45
2.2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ 46
2.2.7. Определение содержания ионов натрия 46
2.2.8. Экспрессия гена а-экспанснна 46
2.2.9. Статистическая обработка данных 55
3. Результаты и их обсуждение 56
3.1 Добавление ПЭГ в питательную среду как модель для изучения реакции растений пшеницы и ячменя на дефицит воды 56
3.1.1. Изменение транспирации иустьичной проводимости. Роль АБК в быстром закрытии устьиц 60
3.1,2. Определение осмотического потенциала 65
3.1 -3. Изменение растяжимости листа при действии ПЭГ 66
3,1.4. Изменение содержания ИУК в листьях при действии ПЭГ и его потенциальная роль в регуляции растяжимости 70
3 1 .5. Экспрессия гена экспансина в связи с увеличением растяжимости листа при действии ПЭГ на растения кукурузы 72
3-1.6. Влияние ИУК на растяжимость листа и экспрессию гена экспансина 77
3.2 Влияние засоления на растения пшеницы, ячменя и кукурузы 83
3.2 1. Транспирация и у стьичная проводимость растений пшеницы и ячменя при действии засоления 85
3.2.2. Изменение осмотического потенциала при действии засоления 91
3.2.3- Сравнительный анализ растяжимости листа у растений твердой пшеницы и ячменя при засолении 93
3.2.4. Экспрессия гена экспансина при действии засоления 95
Выводы 99
Список использованной литературы 101
- Водный обмен растении и его роль в реакции на засоление
- Роль гормонов в регуляции роста и водного обмена у растений
- Влияние засоления на растения пшеницы, ячменя и кукурузы
- Сравнительный анализ растяжимости листа у растений твердой пшеницы и ячменя при засолении
Введение к работе
Актуальность. Засоление почвы - распространенное явление, которое отрицательно сказывается на росте и урожайности растений. В настоящее время около 20 % всех посевных площадей в мире и около половины орошаемых земель засолены (Munns, 2003). Разрабатываются различные агротехнические приемы уменьшения засоленности почв. Однако даже после их использования на мелиорированных землях все еще должны засеваться устойчивые к засолению растения. Селекция таких сортов связана с выяснением механизма формирования солеустойчивости растений, поиском физиологических признаков солеустойчивости растений, поиском физиологических признаков солеустойчивости и разработкой на их основе биотестов, позволяющих быстро отбирать солеустойчивые формы. Засоление очень быстро подавляет рост как относительно солеустойчивых, так и чувствительных растений. Однако различия между ними по скорости роста можно выявить только через несколько недель после начала действия засоления (Cramer, Bowman, 1993). Это объясняют тем, что на первой стадии действия засоления преобладает осмотический компонент, т.е. реакция на дефицит воды, и лишь затем проявляются различия в способности растений защищать себя от токсического действия ионов (Munns et al, 1995; Passiora, Munns, 2000; Munns, 2003). Поэтому стандартная оценка солеустойчивости по ростовой реакции растений слишком трудоемка, требует времени и площадей для длительного выращивания растений. Вместе с тем, в литературе можно встретить противоречивые данные о времени проявления солеустойчивости при оценке ростовой реакции растений (Neumann, 1997), что указывает перспективность поиска быстрых тестов на солеустойчивость по ростовой реакции растений и указывает на целесообразность более тщательного ее изучения. Дефицит воды в растении сказывается, прежде всего, на росте растений растяжением (Воуег, 1978). Поддержание роста в этих условиях связано как с регуляцией водного обмена, так и с
осмотическим приспособлением и изменением свойств клеточных стенок растений (Cosgrove, Li, 1993). В литературе можно встретить работы, где описаны механизмы поддержания роста при дефиците воды, вызванном как засолением, так и добавлением в питательную среду нейтрального осмотика полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ) (Chazen, Neumann, 1994; Fricke et al, 2004). Однако сравнительные исследования этих воздействий в одном эксперименте не проводились. Также не уделялось должного внимания сравнению быстрых ростовых реакций у растений, различающихся но солеустойчивости. Такие исследования должны помочь четко дифференцировать реакции растений на дефицит воды и токсическое действие ионов и выявить возможные различия в реакции растений с неодинаковым уровнем солеустойчивости.
В связи со сказанным цель данной работы состояла в сравнительном изучении физиологических процессов, от которых зависит рост растений при засолении, и выявлении тех из них, которые могут быть использованы в селекции на солеустойчивость.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие зади чи:
Провести сравнительное изучение реакции относительно устойчивого к засолению ячменя и относительно чувствительной твердой пшеницы на добавление к питательному раствору NaCl и нейтрального не проникающего в растения осмотика полиэтил енгликоля (ПЭГ).
Исследовать влияние NaCI и ПЭГ на скорость роста листа и его растяжимость, транспирацию и устьичную проводимость для выявления физиологических показателей, регуляция которых определяет поддержание роста при дефиците воды и засолении.
Изучить влияние осмотического стресса на экспрессию гена а -экспансина І у растений кукурузы и выявить возможную роль экспансинов в быстрой регуляции растяжимости листьев и поддержании ростовых процессов при дефиците воды.
4, Провести определение содержания гормонов (ИУК и ЛБК) в
растениях при действии засоления и дефицита воды и оценить возможную
роль гормонов в приспособлении растении к действию этих
неблагоприятных факторов.
5. Для уточнения роли ЛБК в приспособлении к засолению
сравнить реакцию исходных и мутантных растений ячменя с пониженной
способностью к синтезу данного гормона.
Научная новизна* Впервые обнаружены особенности в быстрой ростовой реакции на засоление у растении, различающихся по солеустойчивости. У относительно чувствительных растений твердой пшеницы засоление вызывало снижение коэффициента растяжимости листа, а у относительно устойчивых растений ячменя, наоборот, - увеличение. Сравнение реакции растений пшеницы на действие NaCl и нейтрального, непроникающего в растения осмотика ПЭГ показх^ю, что ростингибирующее действие засоления на чувствительные к нему растения определяется не только осмотическим, но и токсическим эффектом- Исследование ростовой реакции на засоление у мутантных растений ячменя с пониженным уровнем синтеза ЛБК, не способных быстро закрывать устьица, подтвердило роль данного гормона в поддержании оводненности и роста растений за счет закрытия устьиц на фоне засоления. Изучение экспрессии гена а-экспансина (ехр І) в побегах растений показало быстрое накопление транскриптов данного гена при осмотическом стрессе, что указывает на возможное участие экспансинов в быстром увеличении растяжимости тканей листа.
Практическая значимость работы. Выявлены механизмы, определяющие быструю регуляцию роста растений при действии засоления, которые заключаются в изменении устьичиой проводимости и растяжимости листьев. Показано, что у чувствительных к засолению растений на первых стадиях ответа удается проследить повреждающее действие не только дефицита воды, но и токсичных ионов. Обнаружены различия в характере
изменения коэффициента растяжимости листа на засолении у растений, различающихся по солеустойчивости. Быстрое проявление этих различий позволяет рекомендовать их в качестве физиологического признака, который может быть использован в селекции на солеустойчивость.
Водный обмен растении и его роль в реакции на засоление
Вода имеет определяющее значение для жизнедеятельности растений. Она составляет от 80 до 95% массы растущих тканей. Вода необходима для поддержания структурной целостности биологических молекул и, следовательно, целостности клеток, тканей и всего организма (Слейчер, 1970), Согласно одному из общих положений биологии, активное проявление жизнедеятельности возможно только в водной среде. Циркулируя по растению, вода доставляет клеткам субстраты и метаболиты и удаляет продукты их жизнедеятельности. Именно благодаря такой циркуляции осуществляется взаимосвязь между отдельными частями растения (клетками, тканями, органами). Растения, живущие на суше, приспособились создавать внутри своего тела непрерывный восходящий ток воды. Этот ток начинается на поглощающей поверхности корней, проходит через все растение и заканчивается на испаряющих поверхностях листьев, причем испарение воды листьями должно быть компенсировано поглощением воды корнями. Таким образом, водообмен у растений складывается из трех этапов: 1) поглощения воды корнями, 2) передвижения ее по сосудам, 3) транспирации, т. е. испарения воды листьями (Полевой, 1989).
Почти вся поглощаемая растением вода поступает в него через корни, В отсутствии транспирации вода поглощается корнями за счет осмотических сил, перемещаясь от участков с высоким водным потенциалом почвы к участкам с более низким потенциалом корня, В транспирирующем растении движущей силой для передвижения воды является градиент гидростатического давления (отрицательного гидростатического давления в межклетниках листа в результате испарения воды). По мнению Е.Штедлс (Steudle, 2000) в транспирирующем растении корни не поглощают, а просто пропускают воду. Их вклад в водный обмен заключается в этом случае в регуляции гидравлической проводимости. Попав в клетки корня, вода должна двигаться дальше. Главное сопротивление току воды в растении создают мембраны клеток корней.
Сложная анатомическая структура корней приводит к комбинированному транспорту воды и растворов (Steudle, Peterson, 1998), Различают апопластныи путь транпорта воды и от клетки к клетке. Последний подразделяют на симпластный (по цитоплазме клеток, через плазмодесмы) и трансклеточный. В случае транс клеточного пути вода последовательно преодолевает мембраны одной клетки за другой. Поэтому гидравлическая проводимость этого пути в большей степени, чем в случае транспорта по симпласту, зависит от проницаемости мембран для воды. В тех участках ткани, где клеточные стенки не содержат водоотталкивающих компонентов, вода идет по апопласту. Например, клетки эпидермиса и коры корня не содержат лигнина или суберина, поэтому, какая-то часть воды, попадая в корень, может двигаться по апопласту. Благодаря присутствию в клеточной стенке сильно гидратпрованных полисахаридов гидравлическое сопротивление такого пути минимально. Лигнификация клеточных стенок, например, клеток эндодермы корня (пояски Каспари), склеренхимы сосудистых пучков приводит к снижению их гидравлической проводимости. Но даже в этом случае апопластныи путь воды возможен в молодых растущих клетках, где пояски Каспари еще не сформированы, а также в местах образования боковых корней, где эндодерма прерывается. Если движение воды по эндодерме становится невозможным, вода двигается по симпластному пути (Steudle, 2000). На долю апопластного транспорта приходится меньший объем по сравнению с симпластным и транс клеточным. При этом гидравлическая проводимость апопласта в отсутствие поясков Каспари или иных гидрофобных барьеров может в 100 раз превышать данный показатель для симпластного и трансклеточного пути (Steudle, Peterson, 1998), Вообще, транспорт воды по симпласту может начаться не только на уровне поясков Каспари, но и ближе к поверхности корня.
Преимущество в движении воды от клетки к клетке состоит в том, что на долю клеток приходится гораздо больший объем корня по сравнению с апопластом. Однако трансклеточный путь может иметь низкую проводимость из-за высокого сопротивления мембран при движении воды через большое количество мелких клеток (Tang, Воуег, 2002). По мнению казанских исследователей симпластный транспорт имеет очень большое значение для водного обмена растения (Анисимов, Раткович, 1992). Предполагается, что за счет работы сократительных белков вода может активно проталкиваться по симпласту за счет неких гипотетических устройств, напоминающих мышечные структуры сосудистой системы животных (Жолкевич и др., 2000; 2001),
В зависимости от условий внешней среды гидравлическая проводимость корней может меняться (Weatherley, 1982; Henzler, Steudle, 1995; Steudle, Peterson, 1998). Она зависит от различных факторов, таких как запрос на воду из транспирирующего побега, недостаток воды и засоление почвы, минеральное питание, температура, тяжелые металлы (Munns, Passtoura, 1984; Radin, Eidenbock» 1984; Azaizeh et al., 1992; Birner, Steudle, І993; Maggio, Joly, 1995; Carvajal et ah, 1996; Peyrano et al., 1997; Schreiber et al., 1999; Henzler al., 1999; Clarkson et ah, 2000). Изменчивость гидравлической проводимости корней Е.Штедле объясняет выбором движущих сил (Steudle, 2000). Рассмотрим различные ситуации: а) растение транспирирует; 6) транспираиия отсутствует (ночь, засуха). В транспирирующих растениях градиент гидростатического давления между почвенным раствором и ксилемой очень высок, вода двигается в основном по агтопласту, а гидравлическое сопротивление корней мало, благодаря низкому сопротивлению апопласта. Это облегчает поглощение воды с увеличивающимся запросом на нее из побега.
Роль гормонов в регуляции роста и водного обмена у растений
По своей химической природе абсцизовая кислота (АБК) является сесквитерпеном (Cis) (Taylor, Burden, 1973). Содержание активной формы АБК так же, как и других гормонов, определяется процессами ее синтеза, распада, компартментализации и транспорта. Скорость этих процессов зависит от внешних условий среды: водного режима (Simonneau et al,, 1998), освещенности (Kraepiel, 1994). До недавнего времени считалось, что предшественником АБК является мевалоновая кислота, потому что инкубация различных частей растений разных видов в растворах, содержащих 2-4С-мевалоновую кислоту, приводила к синтезу АБК из экзогенного мевалоната (Milborrow, 1974). Согласно последним исследованиям предшественниками АБК являются пиру ват и глицеральдегид - 3 - фосфат (Milborrow, Lee, 1998). На начальных этапах синтезируется изопентинилпирофосфат, который служит предшественником для последовательного синтеза ксантофиллов - зеаксантина, виолоксантина и неоксантина. На завершающем этапе происходит окислительное расщепление 9 - цис - неоксантина с образованием ксантоксина, который вначале преобразуется в АБК - альдегид, а затем в АБК (Walton and Li, 1995; Culter, Krochko, 1999).
В растениях АБК может образовывать неактивные конъюгаты, в результате присоединения глюкозильных (сложный эфир глюкозы и АБК) или метальных групп (6-гидроксиметил АБК) к молекуле АБК (Воуег, Zeevaart, 1982), Считается, что такие конъюгаты АБК выполняют функции запасных и транспортных форм- В клетке конъюгированная форма АБК, как правило, локализована в вакуоли (Kaiser et al., 1985). Аккумулирование конъюгированных форм гормона в тканях увеличивается с возрастом растения, а также при действии каких - либо стрессовых факторов. Однако было обнаружено, что накопление конъюгатов ЛБК происходит не только в вакуолях растений. Так, например, показано, что при стрессовых воздействиях на растения в ксилемном соке накапливаются конъюгаты АБК (Bano et al., 1993; 1994; Jeschke et al., 1997; Hartung, Jeschke, !999; Sauter, Hartung, 2000). В частности, обнаружено, что при засухе накапливаются глюкозиды ЛБК (Hansen, Dorffling, 1999). Инактивация ЛБК происходит путем окисления ее до фазеевой кислоты, которая далее превращается в дигидрофазеевую.
В растениях ЛБК синтезируется в листьях побега (Hoad, 1978; Cornish, Zeevaart, 1986; Outlaw et al., 1992) и в корнях (Cornish, Zeevaart, 1985; Кислин, Кефели, 1985; Davies, Zhang, 1991; Parry et al, 1992), Семена растений также богаты абсцизовой кислотой, которая либо поступает из листьев, либо синтезируется в них самих (Brenner, Cheikh, 1995). Физиологическая роль АБК в растениях
АБК влияет на многие жизненно важные процессы, происходящие в растении. Хорошо известно, что экзогенная АБК способна быстро закрывать устьица (Blackmail, Davies, 1983). Накопление АБК было обнаружено при дефиците воды и предполагалось, что это должно приводить к закрытию устьиц (Zeevaart, Creelman, 1988), что позволяет листу контролировать свой собственный водный статус при дефиците воды. Однако оценка динамики накопления АБК и изменения устьичной проводимости показала, что часто увеличение суммарной концентрации АБК происходит только тогда, когда устьица уже закрыты (Trewavas, 1981). Ниже мы еще вернемся к обсуждению роли АБК в закрытии устьиц.
АБК влияет на рост побегов и корней, являясь антогонистом ИУК в регуляции роста растяжением (Leopold, Nooden, 1984; Кефели и др., 1989; Москалева, Каравайко, 1990), участвует в регуляции покоя семян и почек (Wareing, 1978; Bewley, 1997). При этом значительное накопление АБК наблюдается в период развития семян, в этот момент АБК обеспечивает регулирование транспорта ассимилятов (Сахаров, аминокислот) и синтез их запасных форм. К моменту созревания семян уровень ЛБК снижается (Radermacher, Drabe, 1984; Skriver, Mundy, 1990; Шакирова и дрм 1994). Известна роль ЛБК, наряду с этиленом, в опадании листьев, цветков и завязей, которая связана с экспрессией генов белков, необходимых для формирования отделительного слоя при их опадании (Milborrow, 1974; Bleecker, 1999). Кроме того, ЛБК принимает участие в формировании клубней, росте мезокотиля, гипокотиля, формировании эмбриоидов в суспензионной культуре клеток (Шаяхметов, Шакирова, 1996), вызывает партенокарпическое развитие плодов (Нижко, 1983),
ЛБК играет важную роль при каких - либо стрессовых воздействиях на растения, нередко ее называют стрессовым гормоном, поскольку ее концентрация сильно изменяется при резких колебаниях температуры, засолении и водном дефиците. Действительно, многими исследователями обнаружено накопление в тканях ЛБК: при действии засухи (Пустовойтова, 1978; 1981; Quarrie, 1989; Жолкевич, Пустовойтова, 1993; Lang et al., 1994), засоления (Singh et al., 1987; Кефели и др., 1989; Bostock, Quatrano, 1992; Таланова и др., 1993; Moons et al, 1997; Шакирова и др. 1998), осмотического шока (Skriver, Mundy» 1990; Moons et ah, 1995), высоких и низких температур (Ефремов и др. 1992; Шакирова и др., 1995; Hughes, Dunn, 1996; Полевой и др-5 1997).
Экзогенная ЛБК вызывает немедленное закрытие устьиц (Raschke et al,, 1975; Blatt, 1990; Serna, 2001), Под действием ЛБК активируется целый каскад ионных каналов: в цитоплазме устьичных клеток возрастает содержание ионов Са2+ , которые активируют анионные и К -каналы (Schroeder, Hedrich, 1989; McAinsh et al., 1990; Hetherington, Quatrano, 1991; MacRobbie, 1992; Blatt, Thiel, 1993). В результате, при увеличении концентрации ионов К в замыкающих клетках устьица открываются, а при уменьшении содержания К+ закрываются. ЛБК регулирует поступление ионов К+ в замыкающие клетки, что способствует закрытию устьиц, и препятствует их открытию, поддерживая работу калиевых каналов, которые выкачивают ионы К+ из клетки (MacRobbie, 1992).
До сих пор неясно, что является источником повышенного содержания ЛБК в листьях при стрессах, С одной стороны, это может быть связано с увеличением синтеза данного гормона в растении. Многими исследователями было показано, что при необходимости ЛБК может быстро образовываться из каратиноидов через ксантоксин, накапливаться и быстро инактивироваться в фазеевую кислоту, а затем в дигидрофазеевую кислоту (Вгау, 1993; Kende, Zeevaart, 1997; Cutler, Krochko, 1999). Это обеспечивает обратимое торможение процесса, который может полностью нормализоваться после падения концентрации ЛБК (Муромцев и др., 1987). Однако выяснилось, что активация процессов биосинтеза АБК происходит лишь после довольно продолжительного периода стрессового воздействия (Pierce, Raschke, 1981). С другой стороны, накопление АБК может наблюдаться не только за счет активации ее синтеза, но и ингибирования ее распада (Zhu, 2002), или как результат перераспределения этого гормона между зрелыми и молодыми листьями (Zeevaart, Boyer, 1984; Zhang et a!., 1990) и между симпластом и апопластом листьев за счет подщелачивайия аиопласта при стрессе (Sauter, Hartung, 2000),
Влияние засоления на растения пшеницы, ячменя и кукурузы
При добавлении NaCl (до конечной концентрации 100 тМ) в питательную среду наблюдались быстрые изменения ростовых процессов в листьях проростков ячменя и пшеницы (рис. 13). Как видно из рисунков, не было принципиальных отличий между ростовыми ответами на засоление у растений этих видов. Следует лишь отметить, что скорость изменения длины листа после возобновления роста у ячменя была выше, чем у пшеницы. В первые 5 минут воздействия скорость изменения длины листа у обоих видов растений снижалась до отрицательных величин (сжатие листа). Затем в течение примерно часа рост растений не наблюдался (нулевой рост). Примерно к 50 минуте в случае с ячменем и к 60 мин - в случае с пшеницей последовало возобновление роста. Частичное восстановление роста происходило приблизительно через 60 минут после начала засоления.
Также следует отметить, что ростовая реакция твердой пшеницы и ячменя на засоление и дефицит воды не имеет качественных различий. Вместе с тем, следует отметить, что у растений твердой пшеницы степень восстановления роста на засолении была ниже, чем при действии ПЭГ. На фоне засоления листья пшеницы возобновляли свой рост на уровне 30 % от исходного, в то время как при действии ПЭГ скорость роста составляла 50 % от исходной (сравнить рис. 1 и рис. 13), Полученные нами результаты казалось бы соответствуют данным литературы о том, что сначала при действии засоления растения страдают только от недостатка воды, и лишь затем начинает сказываться токсическое действие ионов (Munns et al, 2001). Когда длительное действие засоления приводит к тому, что клетки растений перестают справляться с утилизацией (компартментализация, экспорт или секреция) токсических ионов.
Следующим этапом нашей работы стал анализ ростовых кривых пшеницы и ячменя, полученных на засолении. Как и при добавлении ПЭГ, сразу после добавления 100 mM NaCl в питательный раствор следует падение его водного потенциала, и поэтому поглощение воды растением уменьшается. Вода перестает поступать в корень из-за исчезновения градиента водного потенциала между корневой средой и клетками корня. По этой причине поступление воды в растущие клетки побега затрудняется, и рост прекращается. Наблюдаемое нами сжатие листа, объясняется сжатием молодых клеткок растущей зоны, которые более эластичны, чем дифференцированные клетки (Edelman, 1995),
Как уже говорилось, для возобновления поступления воды и ростовых процессов требуется восстановить разницу водных потенциалов между ксилемой и растущими клетками побега. Это может достигаться за счет увеличения водного потенциала ксилемы путем снижения транспирации (уменьшение потери воды). Поэтому, следующим нашим шагом стало измерение транспирации и устьичной проводимости растений пшеницы и ячменя,
Транспирации иустьичная проводимость растений пшеницы и ячменя при действии засолении.
После добавления NaCl в питательный раствор листья ячменя и пшеницы продолжали в течение первых 10 - 15 минут терять за счет транспирации столько же воды, как и до воздействия (рис. 14). Это должно было приводить к снижению водного потенциала ксилемы и торможению роста, что мы и наблюдали- Затем» как и при добавлении ПЭГ, транспирация снижалась. Измерение устьичной проводимости показало, что снижение уровня транспирации происходит из-за закрытия устьиц (рис- 15),
Таким образом, закрытие устьиц, которое мы наблюдали, приводило к восстановлению баланса между сниженным уровнем поступления воды из корней и ее потерей за счет транспирации. Лист растения начинал терять меньше воды и восстанавливал градиент между ксилемой и растущими клетками и возобновлял рост. Наблюдаемое нами снижение транспирации и устьичной проводимости под действием засоления хорошо описано многими исследователями (Hsiao et ah, 1976; Sohan et al., 1999).
Скорее всего, как и в случае обработки растений ПЭГ, возобновление роста при действии засоления связано с восстановлением водного баланса за счет ограничения потери листом воды. Сигналом для закрытия устьиц являлась АБК, накапливающаяся в побеге.
Хорошо известно, что основным стрессовым гормоном растений является АБК (Кефели и др., 1989; Шакирова, Безрукова, 1998; Zeevaart, 1999). Большое количество работ посвящено изучению роли АБК при воздействии водного дефицита на растения, В частности, показано влияние АБК на работу устьичного аппарата (Mansfild and MsAinsch, 1995), осмотическое приспособление (Griffiths et al, 1996), рост растений (Cramer et ah, 1998). Увеличение содержания АБК в побегах и корнях растений при длительном воздействии засоления было отмечено в работах многих исследователей (Wolf et aL, 1990; Zhao ct al., 1991; Thomas et aL, 1992; Таланова и др-, 1993; He, Cramer, 1996; Munns, Cramer, 1996; Gomez-Caderas et aL, 1998), В нашей лаборатории было ранее показано, что АБК быстро накапливается в побегах твердой пшеницы и ячменя при действии засоления. Повышение уровня АБК в листе, которое ведет к закрытию устьиц и снижению транспирации, являлось одной из причин восстановления роста листа.
Для того чтобы получить еще более убедительные доказательства, что корреляция между накоплением АБК и закрытием устьиц не является простым совпадением, а является фактором, который влияет на транспнраиию и способствует восстановлению роста при действии засоления, мы провели серию опытов с мутантным ячменем (Az34). Такой ЛБК-дефицитный мутантный ячмень имеет пониженную способность к синтезу ЛБК, Многочисленные работы с АБК-дефицитными мутантными растениями показывают, что такие растения характеризуются медленным ростом, а также склонны к завяданию, потому что низкий уровень эндогенной ЛБК не позволяет эффективно регулировать степень открытия устьиц и, следовательно, поддерживать адекватный водный статус листа (Quarrie, 1991; Neill, Morgan, 1985), Оценив содержание ЛБК в мутантном ячмене при действии засоления, мы убедились в том, что существенного накопления ЛБК в листья таких растении не происходит (рис. 16)
Сравнительный анализ растяжимости листа у растений твердой пшеницы и ячменя при засолении
Для того чтобы выяснить, не связано ли возобновление роста с увеличением растяжимости клеточных стенок побега при действии засоления, было проведено, как и в экспериментах с ПЭГ, измерение коэффициента растяжимости побегов твердой пшеницы и ячменя при действии засоления.
Как видно из таблицы 5, через 30 мин после добавления NaCI в питательный раствор коэффициент растяжимости первого листа ячменя увеличивался. Увеличение коэффициента растяжимости говорит о том, что клеточные стенки в листе ячменя стали более рыхлыми. Это позволяет ячменю быстро восстановить свой рост в большей степени, чем пшенице. Следовательно, возобновление роста, которое мы наблюдали у растений ячменя можно объяснить изменением свойств клеточных стенок.
У растений твердой пшеницы, наоборот, мы наблюдали снижение коэффициента растяжимости. Следовательно, клеточные стенки стали более жесткими, чем были до воздействия (их растяжимость уменьшилась). Скорее всего, поэтому скорость роста растений пшеницы после добавления NaCI в питательный раствор была ниже, чем у растений ячменя. Чем же объяснить снижение растяжимости клеточных стенок в листе пшеницы, которое мы наблюдали, и почему в листе ячменя растяжимость увеличивалась? Можно предположить, что твердая пшеница, являясь менее солеустойчивой культурой, чем ячмень, уже в течение часа может накапливать определенное количество токсичных ионов Na+ и СҐ, способных ингибировать действие ферментов клеточной стенки. В этом случае, клеточные стенки растений пшеницы не могут эффективно растягиваться, что должно приводить к снижению их растяжимости. Чтобы проверить наше предположение, мы измеряли концентрацию ионов Na+ в клеточном соке в зоне роста листьев твердой пшеницы и ячменя. Результаты измерений показали» что уже через один час растения пшеницы накапливают в шесть раз больше ионов Na+, чем растения ячменя (табл. 6).
То есть, скорее всего, снижение коэффициента растяжимости у растений пшеницы связано с ингибирующим действием соли. Хотя из данных литературы считается, что разницу в солеустойчивости растений можно почувствовать лишь со временем, спустя несколько дней после начала действия солевого стресса (Munns et al., 2000), наши эксперименты показывают, что она проявляется уже в первые часы. Следующим этапом нашей работы стало измерение уровня экспрессии гена а - экспансина 1 в проростках кукурузы при действии солевого стресса.
Сначала мы должны были проверить ростовую реакцию растений кукурузы на засоление. Из рисунка 19 видно, что существенных различий в реакции растений кукурузы от растений твердой пшеницы и ячменя не наблюдалось.
Затем мы определяли коэффициент растяжимости побега кукурузы при действии засоления. Коэффициент растяжимости листа кукурузы с каждым подвешиванием дополнительного груза практически не изменялся (табл. 7). А если сравнивать коэффициент растяжимости листа кукурузы при действии засоления и при действии ПЭГ, то в случае засоления он был ниже. Нам было интересно узнать, как происходила в этом случае экспрессия гена, кодирующего а - экспансии. Используя дот-блот анализ транскриптов мРНК с 33Р-меченой ДНК пробой, мы обнаружили значительное накопление транскриптов мРНК в побегах кукурузы при действии засоления (рис. 20),
Почему же при таком существенном повышении уровня экспрессии гена, кодирующего а - экспансии мы не наблюдали увеличение растяжимости побегов кукурузы при солевом стрессе?
Возможно, это связано с тем, что кукуруза является солечувствительной культурой, как и твердая пшеница, и даже при кратковременном действии засоления может накапливать токсические ионы, которые снижают активность ферментов клеточной стенки- В результате, несмотря на повышение уровня экспрессии гена экпансина, засоление не приводило к повышению растяжимости листьев. Тем не менее, не было и снижения растяжимости под влиянием засоления. Можно думать, что отрицательное действие ионов натрия на растяжимость листа нивелировалось за счет увеличения содержания в клеточной стенке экспансинов.
Итак, нам удалось обнаружить различия ростовой реакции растений твердой пшеницы и ячменя при действии засоления уже на ранних его стадиях. Известно, что ячмень более эффективно снижает поступление в растение токсических ионов, которые, накапливаясь, могут ингибировать активность белков. В наших экспериментах различия по накоплению ионов между твердой пшеницей и ячменем проявлялись очень быстро. Поэтому неудивительно, что в растениях пшеницы снижалась растяжимость листа. По данным литературы, различия ростовых реакций растений не удается обнаружить раньше, чем через 10 20 дней после начала действия засоления (Munns, Termaat, 1986). Почему же нам это удалось? Скорее всего, это связано с тем, что мы изучали быструю реакцию. Чувствительные к засолению растения способны какое-то время расти с той же скоростью, как и устойчивые, потому что они могут «закачивать» токсичные ионы в вакуоль, И пока растения растут, и их вакуоли увеличиваются в размере, они, таким образом, избавляются от токсичных ионов. Считается, что на начальных этапах засоления растения реагируют лишь на дефицит воды, а токсичное действие ионов не проявляется. Только когда прекратится рост, появляются симптомы отравления, некротические пятна и т.д. Однако наши данные свидетельствуют о том, что существует период, когда токсическое действие ионов проявляется очень рано. Это происходит в первые .минуты действия засоления, когда ионы натрия проникают в цитоплазму чувствительных растений, которые, очевидно, еще не успевают запустить механизм «закачивания» ионов натрия и хлоридов в вакуоль. Об этом свидетельствует обнаруженное нами снижение коэффициента растяжимости листьев у растений пшеницы через 30 минут после начала действия засоления. При этом у устойчивых к засолению растений ячменя уменьшения коэффициента растяжимости листа не было. Она наоборот возрастала. Обнаруженное нами явление может стать основой для разработки быстрого ростового теста на сопеустойчивость растений.
