Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Ответные реакции растений на стрессовые воздействия 9
1.1.1. Роль АБК в формировании устойчивости растений 14
1.1.2. Роль про/антиоксидантной системы в ответе растений на стрессовые воздействия 16
1.2. Салициловая кислота - индуктор устойчивости растений 25
1.2.1. Кросс-взаимодействие сигнальных путей гормонов в индукции устойчивости растений 28
1.2.2. СВЧ как проявление программированной гибели клеток у растений при стрессе 34
2. Материалы и методы 41
2.1. Объект исследования 41
2.2. Постановка опытов 41
2.2.1. Постановка лабораторных опытов 41
2.2.2. Постановка полевых опытов 42
2.3. Экстрагирование фитогормонов 42
2.4. Определение содержания фитогормонов методом ИФА 43
2.5. Изоэлектрофокусирование белков 44
2.6. Определение активности пероксидазы 45
2.7. Определение активности супероксиддисмутазы 45
2.8. Определение концентрации супероксид аниона 46
2.9. Оценка генерации перекиси водорода с участием оксалатоксидазы 47
2.10. Определение образования лигнина 47
2.11. Определение концентрации пролина 48
2.12. Определение содержания малонового диальдегида 48
2.13. Определение выхода электролитов в окружающую среду 49
2.14. Определение митотической активности и фазовых индексов меристематических клеток корней проростков пшеницы 50
2.15. Оценка уровня транскрипционной активности генов дегидринов 50
2.16. Определение активности фенилаланин - аммиак - лиазы 52
3. Результаты исследований и их обсуждение 54
3.1. Механизмы влияния СК на интенсивность ростовых процессов растений пшеницы 54
3.1.1. Анализ влияния СК на ростовые процессы проростков в связи с анализом баланса фитогормонов в норме и в условиях засоления 55
3.1.2. Влияние СК на устойчивость пшеницы к возбудителям грибных болезней и ее продуктивность 72
3.2. Роль прооксидантной и антиоксидантной системы в спектре действия СК на растения пшеницы 75
3.2.1. Влияние СК на генерацию АФК и активность антиоксидантных ферментов в растениях пшеницы в нормальных условиях произрастания 76
3.2.2. Влияние СК на активность ФАЛ и накопление лигнина в корнях проростков пшеницы 84
3.2.3. Вовлечение антиоксидантных ферментов в проявлении защитного действия СК на растения пшеницы при засолении 89
3.2.4. Влияние СК на экзоосмос электролитов в условиях засоления 96
3.2.5. Накопление лигнина в корнях предобработанных и необработанных СК проростков пшеницы после воздействия засоления 98
Заключение 102
Выводы 107
Список литературы 108
- Роль про/антиоксидантной системы в ответе растений на стрессовые воздействия
- Кросс-взаимодействие сигнальных путей гормонов в индукции устойчивости растений
- Оценка уровня транскрипционной активности генов дегидринов
- Анализ влияния СК на ростовые процессы проростков в связи с анализом баланса фитогормонов в норме и в условиях засоления
Введение к работе
Актуальность. Изучение молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессовым воздействиям окружающей среды является одной из важнейших проблем в современном растениеводстве, знание которых может позволить целенаправленно и эффективно управлять защитными реакциями с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур.
Салициловая кислота (СК) является характерным для растений на протяжении всего онтогенеза соединением, что предполагает ее участие в реализации разнообразных физиологических процессов [Raskin, 1992]. Однако особое внимание исследователей к СК было вызвано обнаружением ее ключевой роли в индукции системной приобретенной устойчивости (СПУ) растений к инфицированию [Ryals et al., 1994; 1996]. Развитие СПУ коррелирует с системной экспрессией различных семейств генов PR-(pathogenesis-related) белков [Muthukrishnan et al., 2001; Шакирова, 2001], Сигналлинг СК в запуске СПУ интенсивно изучается, хотя мессенджеры, задействованные в передаче сигнала, до конца не выяснены [Тарчевский, 2002; Metraux, 2002; 2004]. Предполагается, что важное значение в развитии СПУ имеет СК-индуцированная генерация активных форм кислорода (АФК) [Chen et al., 1993; Kawano, Muto, 2000; Minibayeva et al., 2001; Ganesan, Thomas, 2001; Kawano et al., 2003]. В то же время, сведения о модуляции под влиянием обработки СК активности антиоксидантных ферментов каталазы [Durner, Klessing, 1996; Chen et al., 1997], супероксиддисмутазы (СОД) [Vuletic et al., 2003], пероксидазы [Janda et al, 1999; Kang, Salveit, 2002] свидетельствуют о возможности проявления СК свойства антиоксиданта, имеющее, по-видимому, особое значение при сильной стресс-индуцированной генерации АФК.
Сейчас уже не вызывает сомнения факт участия СК в развитии защитных реакций в растениях в ответ на неблагоприятные факторы среды не только биотической, но и абиотической природы [Janda et al., 1999; Mishra,
6 Choudhuri, 1999; Senaratna et al., 2000; Singh, Usha, 2003; Tasgin et al., 2003]. К моменту начала нашей работы было выявлено, что предпосевная обработка семян СК способствует повышению устойчивости растений пшеницы к засолению среды [Шакирова, Безрукова, 1997; Сахабутдинова, 2002; Shakirova et al., 2003] и дефициту влаги [Безрукова и др., 2001; Сахабутдинова, 2002], важной составляющей которой является ее влияние на гормональный статус.
На основании вышеизложенного, можно полагать, что в реализации защитного действия СК на растения при воздействии разных по природе стрессовых факторов существенное значение имеют АФК и антиоксидантные ферменты, при этом следует отметить, что в литературе практически отсутствуют сведения в отношении эффекта СК одновременно на обе составляющие про- и антиоксидантной системы, что затрудняет оценку роли состояния прооксидантной и антиоксидантной системы в проявлении антистрессового действия этого регулятора роста. Цель и задачи исследований.
Цель работы состояла в комплексном изучении влияния салициловой кислоты на баланс АФК и активность антиоксидантных ферментов в проростках пшеницы для выявления вклада про- и антиоксидантной системы в СК-индуцированную устойчивость пшеницы к засолению. Для решения этой цели были поставлены следующие задачи.
1. Исследовать влияние СК на баланс АФК и активность антиоксидантных ферментов в растениях пшеницы в нормальных и стрессовых условиях произрастания в сочетании с анализом ростовых процессов проростков и их гормонального статуса: а) провести детальный анализ влияния СК на продукцию 02" и Н202 в проростках пшеницы в норме и при воздействии засоления; б) изучить динамику активности супероксиддисмутазы и пероксидазы в обработанных и необработанных СК проростках пшеницы в норме и при засолении.
7 2. Сопоставить влияние СК на активность фенилаланин-аммиак-лиазы (ФАЛ), анионной изопероксидазы и продукцию Н202 в корнях проростков пшеницы с интенсивностью лигнификации клеточных стенок и экзоосмосом электролитов в норме и при засолении.
3. Оценить характер изменения содержания АБК, транскрипционной активности дегидрин-подобного гена TADHN и концентрации пролина в проростках пшеницы в ходе обработки СК,
4, В полевых условиях провести анализ влияния предобработки СК на устойчивость пшеницы к грибным болезням.
Научная новизна. Обнаружено, что изменения в балансе АФК и активности антиоксидантиых ферментов под влиянием СК имеют важное значение в проявлении ее предадаптиругощего действия на растения пшеницы к засолению. Впервые показано, что обработка СК ускоряет лигнификацию клеточных стенок, чему предшествует активация ФАЛ, анионной изопероксидазы и генерация с участием оксалатоксидазы ЇІ2О2. Предобработка проростков пшеницы СК способствует дополнительному усилению образования лигнина в оболочках клеток корней в условиях засоления и, тем самым, укреплению барьерных свойств клеточных стенок, что отражается в снижении выхода электролитов из тканей растений и степени повреждающего действия стресса на интенсивность ростовых процессов. Получены приоритетные данные об участии СК в АБК-опосредованной индукции экспрессии дегидрин-подобного гена TADHN и накоплении пролина в проростках пшеницы, что указывает на ключевую роль АБК в предадаптирующем действии СК на растения пшеницы к стрессовым ситуациям, вызывающим нарушение водного режима. В полевых опытах впервые получены данные о повышении под влиянием предобработки СК устойчивости пшеницы к возбудителю твердой головни Tilletia caries.
Практическая значимость работы. Полученные результаты об активации про-/антиоксидантной системы, образования лигнина в клеточных стенках,
8 АБК-опосре дує мой экспрессии генов дегидринов и накоплении пролина существенно расширяют знания о механизмах защитного действия СК на растения пшеницы, которые вносят важный вклад в снижение степени повреждающего действия стрессовых факторов биотической и абиотической природы на эту важнейшую хлебную культуру и раскрывают широкие перспективы использования СК для повышения неспецифической устойчивости растений.
Роль про/антиоксидантной системы в ответе растений на стрессовые воздействия
Одним из подходов, направленных на увеличение устойчивости растений к стрессовым факторам абиотической природы, является внесение генов с известными качествами в уже существующие сорта при сохранении всего комплекса их характеристик [Титов и др., 2003]. Примером этому могут служить результаты опытов с трансгенными по HVA1 гену растениями риса, проявившими на фоне накопления его белкового продукта повышенную устойчивость к водному дефициту и засолению, о которой судили по задержке развития у них стресс-индуцированных симптомов поражения и ускорению нормализации ростовых процессов после удаления стрессоров из среды [Xu et al., 1996].
В целом, совокупность рассмотренных данных литературы позволяет заключить, что важной составляющей устойчивости растений к разнообразным стресс-факторам являются неспецифические защитные механизмы, развитие которых в ответ на первичный стресс (в качестве которого можно рассматривать также и обработку защитными соединениями) позволяет растениям «как бы» подготовиться к воздействию последующих, и в зависимости от напряженности следующих стрессов существенно снизить их степень повреждающего действия на растения. 1.1.2. Роль прооксидантной/антиоксидантной системы в ответе растений на стрессовые воздействия
Неблагоприятные факторы среды вызывают окислительный стресс, связанный с накоплением АФК и изменением активности антиоксидантиых ферментов и других соединений со свойствами антиоксидантов [Зенков и др., 2001; Тарчевский, 2002; Чиркова, 2002]. Действительно, имеется большое количество данных, указывающих на то, что стрессовые воздействия абиотической и биотической природы индуцируют генерацию АФК, таких как супероксид-анион CV, гидроксид- анион ОН\ перекись водорода Н2Ог [Prasad et al., 1994; Sgherri, Navari-Izzo, 1995; Fadzilla et al., 1997; Pastori et al., 2000; Лукаткин, 2002; Чиркова, 2002; Jiang, Zhang, 2002; Bandeoglu et al., 2004; Farrant et al., 2004; Lee et al., 2004; Mittova et al., 2004; Rao et al., 1995; Wu et al., 1995; Quartacci et al., 2001; Тарчевский, 2002; Okada et al., 2002; Минибаева, Гордон, 2003].
Образование АФК связано как с неферментативными (например, окислительно-восстановительные реакции фенолов, хинонов, флавинов, автоокисление гем- и SH-содержащих соединений), так и с ферментативными процессами [Дубинина, 1989], например, активацией различных оксидаз [Тарчевский, 2002; Blokhina et al., 2003; Kawano, 2003; Минибаева, Гордон, 2003]. Значительный вклад в образование АФК вносит также функционирование цепей переноса электронов в мембранных структурах клетки [Fryer et al., 1998; Чиркова, 2002; Blokhina et al., 2003; Foyer, Noctor, 2003; Минибаева, Гордон, 2003; Bartoli et al., 2004].
Одним из наиболее опасных для растительной клетки является супероксид анион, образование которого при различных стрессовых воздействиях резко возрастает. Молекула Оз преимущественно играет роль пускового звена в каскаде реакций образования других АФК [Kawano, 2003]. В растительной клетке супероксид радикал участвует в более чем в 200 различных реакциях [Турпаев, 2002]. В отличие от молекулярного кислорода, для которого мембраны не представляет преграды, супероксидный анион, обладая зарядом, окружен молекулами воды, что не дает ему возможности преодолеть мембранный барьер [Чиркова, 2002].
Так было выяснено, что в клетках теплолюбивых растений в отличие от холодоустойчивых при действии низких положительных температур резко возрастала скорость генерации супероксид радикала и перекиси водорода, пусковой молекулы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [Лукаткин, 2002].
Стресс-индуцированное накопление АФК, вызывающее окислительный стресс, приводит к повреждению клеток и одновременно индуцирует защитные реакции в них [Тарчевский, 2001; Чиркова, 2002; Blokhina et al., 2003]. Так, АФК могут приводить к повреждению ДНК [Xiong, Zhu, 2002], накоплению мутаций [Дубинина, 1989], усилению повреждения белков [Rao et al., 1995; Iturbe-Ormaetxe et aL, 1998]. По данным Bartoli et al. [2004], митохондрии являются главными мишенями для АФК, поэтому они содержат в 9-28 раз больше модифицированных белков, чем, например, хлоропласты. При окислительном стрессе нарушается целостность клеточных мембран [Барабой, 1991; Fryer et al., 1998; Kingston-Smith, Foyer, 2000; Чиркова, 2002; Farrant et al., 2004] вследствие множества разных причин: увеличение текучести [Дубинина, 1989] и гидрофильности внутреннего бислоя [Blokhina et al., 2003], активности липоксигеназы, степени свободнорадикального ПОЛ, затрагивающего полиненасыщенные жирные кислоты, о котором можно судить по увеличению уровня малонового диальдегида (МДА), конечного продукта ПОЛ [Fryer et al., 1998; Веселов и др., 2002; Лукаткин, 2002; Mittova et al., 2004; Bandeoglu et al., 2004; Cavalcanti et al., 2004]. Таким образом, при стрессовых воздействиях физико-химическое состояние клеточных мембран изменяется [Удовенко, 1979; Quartacci et al., 1995; Тарчевский, 2001; Чиркова, 2002]. К этим изменениям можно отнести нарушение функциональной активности мембран. Так, накопление перекиси водорода, которое происходит, например, в ответ на засоление, воздействие низкой температуры может служить посредником в снижении гидравлической проводимости корней пшеницы [Ктиторова и др., 2002] и огурца [Lee et al., 2004], соответственно. В стрессовых условиях происходит увеличение выхода электролитов из клеток растений вследствие изменения проницаемости мембран для ионов и органических веществ [Мелехов, 1985; Leprince et al., 2000; Ступникова и др., 2001; Нага et al., 2003; Григорюк и др., 2003; Cavalcanti et al., 2004]. В целом, выход ионов из клеток усиливается с удлинением времени действия стресса [Чиркова, 2002; Лукаткин, 2003]. Причем, устойчивые растения характеризуются заметно меньшим уровнем экзоосмоса электролитов из тканей по сравнению с неустойчивыми [Blackman et al., 1995].
Кросс-взаимодействие сигнальных путей гормонов в индукции устойчивости растений
Одной из интригующих проблем современной физиологии и биохимии растений является изучение комплексного регулирования роста и развития растений гормональной системой, сигналлинг гормонов, перекрест их сигнальных путей, поскольку хорошо известны факты взаимодействия и взаимовлияния фитогормонов в контроле разнообразных физиологических реакций [Bennett et al., 2005; McCourt et al., 2005].
Интересно, каким образом один фитогормон оказывает влияние на протекание непосредственно не связанных с его действием реакций и как происходит координация разными гормонами регуляции одного процесса, например, такого интегрального процесса как рост.
Так, например, ауксин задействован в положительной регуляции деления и растяжения клеток, роста придаточных корней, явления апикального доминирования. Вместе с тем, и другие гормоны участвуют в контроле этих процессов- Так, если рассматривать рост клеток делением и растяжением, то в одном с ауксином направлении функционируют цитокинины, брассиностероиды, гиббереллины, то в случае апикального доминирования цитокинины являются антагонистами ауксину. Кроме того, АБК, как правило, выступает антагонистом фито гормонов — активаторов роста.
Большой прогресс в изучении сигналлинга фитогормонов был достигнут при использовании мутантных растений, дефектных по синтезу и различающихся по чувствительности к гормонам. Это позволило выявить наличие различных путей передачи гормональных сигналов и, вероятно, кросс-взаимодействие их лежит в основе проявления ответа на воздействие конкретного гормона или интегрированного ответа на совместное действие разных гормонов. В связи с этим, важно подчеркнуть способность фитогормонов активно воздействовать на синтез друг друга и служить в качестве компонентов различных сигнальных путей [Gazzarrini, McCourt, 2003].
Выше в обзоре мы уже обсуждали ключевую роль СК в индукции СПУ. Во второй половине девяностых годов 20 века было обнаружено, что в ответ на инфицирование в растениях развиваются СК-независимые пути становления системной устойчивости, так называемой индуцированной системной устойчивости, в реализации которой ключевую роль играют в кооперации этилен и жасмоновая кислота (ЖК) [Pieterse, Van Loon, 1999; Pieterse et al., 2001]. Наличие таких альтернативных путей индукции устойчивости, запускаемых разными сигнальными молекулами, очевидно, является полезным для растений. Например, в силу каких-то обстоятельств может быть задержан или нарушен синтез какой-то из них, кроме того, каждый из этих путей приводит к индукции своего спектра защитных генов, тогда как функционирование различных сигнальных путей может существенно расширить защитный потенциал растений.
В последнее время в литературе принято относить к группе стрессовых гормонов не только АБК и этилен, но и СК и ЖК и их метильные производные [Creelman, Mullet, 1999; Chang, Shockey, 1999; Шакирова, Сахабутдинова, 2003]. Действительно, каждое из этих соединений выполняет в растениях разнообразные характерные для них функции, среди которых важную роль играет их антистрессовая активность по отношению к разным по природе неблагоприятным факторам среды [Pieterse et al., 2001; Gazzarrini, McCourt, 2003]. При этом следует подчеркнуть, что и этилен, и жасмонат способны, также как и СК, к индукции не только локальной, но и системной устойчивости к поранению, патогенам и вредителям. Вместе с тем, в отличие от СПУ, в становлении которой ключевая роль принадлежит СК, развиваемую системную устойчивость в ответ на обработку этиленом и ЖК или вследствие увеличения их уровня в растениях под влиянием раневого стресса, патогенной атаки, воздействия вредителей принято называть индуцированной системной устойчивостью (ИСУ) [Metraux, 2001; 2002].
Стрессовые фитогормоны могут оказывать влияние на количественный уровень друг друга и характер их биохимического действия. Так, например, салицилат вызывает в растениях пшеницы быстрое и обратимое накопление АБК [Shakirova et al., 2003], тогда как в растениях ячменя жасмонат, напротив, приводит к значительному снижению уровня АБК [Lobler, Lee, 1998]. Это говорит о том, что АБК в первом случае может рассматриваться в качестве возможного интермедиата в развитии защитных реакций, тогда как во втором, скорее всего, - нет.
Есть данные об ингибировании экспрессии некоторых ЖК-индуцируемых генов под влиянием СК и ее аналогов, изоникотиновой кислоты и бензодиатиозола [Pena-Coretes, 1993; Bowling et al., 1997; Doherty et al., 1988; Fidantsef et al., 1999; Van Wees et al., 1999]. Кроме того, СК может ингибировать не только действие жасмоната, но и его биосинтез [Doares et al., 1995; Harms et al., 1998], а также продукцию этилена [Leslie, Romani, 1986; Rousta, Latche, 1990]. Причем, эффект СК на синтез этилена проявляет четкую зависимость от используемой дозы: СК в концентрации выше 10"4М подавляет генерацию этилена, зато в меньшей концентрации может усиливать [Nissen, 1994].
В то же время, важно упомянуть данные о возможном участии этилена в повышении чувствительности растений арабидопсиса к СК, о чем судили по накоплению мРНК PR-1 белков, служащих маркером СПУ [Lawton et al., 1994], а также дополнительном к СК-индуцированному увеличению концентрации мРНК PR-1 белков и количества этих белков при совместной обработке растений табака смесью СК и ЖК [Xu et al., 1994]. Интерес представляют также и сведения о белках, играющих важную роль в старении и гибели клеток листьев арабидопсиса, экспрессия генов которых индуцируется АФК [Navabpour et al., 2003], Так, экспрессия гена LSC94 {PR-1) в зеленых листьях арабидопсиса может индуцироваться АФК только в присутствии СК, тогда как ген LSC54, кодирующий металлотионеин, экспрессируется в отсутствии СК [Morris et al., 2000], что, возможно, опосредовано действием на последний ген других стрессовых гормонов. При обсуждении сведений о взаимодействии разных стрессовых гормонов в развитии устойчивости растений интересно упомянуть данные по анализу влияния инфицирования Pseudomonas syringae на количественный уровень СК и ЖК в растениях арабидопсиса [Block et al., 2005]. Инокуляция вызывала продукцию СК, с чем, вероятно, в первую очередь, связано развитие устойчивости, одновременно в растениях наблюдалось и заметное увеличение уровня ЖК, с которой, в свою очередь, связано усиление экспрессии гена дефензина. Это говорит о том, что определенный вклад в развитие общей устойчивости к бактериальной инфекции может вносить и ЖК [Block et al., 2005].
Оценка уровня транскрипционной активности генов дегидринов
Анализ экспрессионной активности генов дегидринов в проростках пшеницы проводили методом дот-блот-анализа с использованием в качестве гибридизационного зонда полученной к.б.н. Ч.Р. Аллагуловой в результате полимеразной цепной реакции нуклеотидной последовательности, гомологичной мРНК дегидринов пшеницы семейства WCOR и гену dhnS дегидрина ячменя, размером 390 п.н. [Шакирова и др., 2005]. Для этой цели РНК выделяли по методу, описанному Booth и др. [1995], с некоторыми модификациями с использованием буфера, содержащего 4М гуанидин-тиоционат, 2% саркозил, 50 мМ трисНСІ (рН 8.0), ЮмМ ЭДТА, 1% р-меркаптоэтанол. Очистку РНК проводили путем 4-5 стадий депротеинизации с использованием равного объема смеси 80%-ный фенол (рН 4.0): хлороформ в соотношении 1:1.
Процедура дот-блот анализа детально описана ранее [Sambrook et al., 1989]. Нитроцеллюлозный фильтр («Schleicher, Schuell», ФРГ) выдерживали в 20-кратном растворе SSC (3 М NaCl, 0.3 М Ка3СбН507) 1 ч при комнатной температуре, помещали в устройство для вакуумного блоттирования (BioRad, США) и промывали 10-кратным раствором SSC.
Образцы РНК смешивали с формамидом, формальдегидом, 20-кратным SSC и инкубировали при 68 С в течение 15 мин, охлаждали, добавляли 2 объема 20-кратного раствора SSC и пропускали через нитроцеллюлозный фильтр вакуумированием. (Концентрацию мРНК в разных вариантах опытов предварительно выравнивали по оптической плотности при 280 нм на СФ Smart Spect Plus (Bio-Rad, США), а также относительно интенсивности полосы, соответствующей 18S рРНК в спектрах образцов при электрофорезе в агарозном геле). После чего фильтр дважды промывали 10-кратным раствором SSC и высушивали при комнатной температуре. РНК, нанесенную на нитроцеллюлозный фильтр, фиксировали в течение 1 ч при 80С.
Фильтры с иммобилизованной на них РНК предварительно инкубировали в гибридизационной смеси, содержащей 5-кратный раствор Денхардта, 10-кратный раствор SSC, 0.1% SDS при 65С в течение 1-2-х ч. Затем в гибридизационную смесь добавляли меченный АТР гибридизационный зонд. Гибридизацию проводили при 65С в течение 18 ч. Фильтры от невключившейся метки отмывали раствором, содержащим 2-кратный раствор SSC и 0.1% SDS при температуре 65С, и высушивали при комнатной температуре. Высушенные фильтры экспонировали на рентгеновскую пленку РМ-В ("Тасма", Казань) в течение 1-7 суток. Работа с рентгеновской пленкой проводилась в темноте или при освещении красным светом. Количественную оценку РНК в точках гибридизации осуществляли сканированием рентгеновской пленки в проходящем свете на денситометре Chromoscan 3 ("Joyce-Loebel", Англия). 2.16. Определение активности фенилаланин — аммиак - лиазы
Активность ФАЛ определяли соответственно Zucker, [1965]. Метод основан на том, что в присутствии ФАЛ фенилаланин превращается в транскоричную кислоту, которая поглощается при 290 нм на СФ-26 (ЛОМО, Россия). Для этого навеску корней растирали в 25 мл охлажденного до -15 С ацетона. Далее гомогенат фильтровали на воронке Бюхнера холодным ацетоном и положили сушиться в колбе Бюнзена под тягу при комнатной температуре. Полученный порошок хранился в морозильной камере. Далее для определения активности ФАЛ 0.05 г сухого ацетонового порошка растворяли в 5 мл 0,1 М боратного буфера (рН 8.8). Проводили экстракцию в холодильнике, в течение 45 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой. После чего центрифугировали 10 мин при 2000 g. Полученный экстракт является очень нестабильным и должен использоваться в очень короткий период времени. Для определения активности ФАЛ к 1 мл экстракта прибавляли 1.9 мл 200 мкМ боратного буфера (рН 8.8) и 0.1 мл 60 мкМ фенилаланина, полученную смесь доводили до 6 мл дистиллированной водой. Контрольная кювета содержала все реактивы кроме фенилаланина. Время замечали по секундомеру и следили за развитием реакции в течение часа, с интервалами значение которых регистрировали: 20, 40, 60 минут. Активность ФАЛ вычислялась в у. е. на г сырой массы корней.
Для определения биохимических показателей: содержания гормонов, активности ферментов использовали растительную навеску, содержащую не менее 10 интактных растений или отделенных от них корней.
Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и четырех-пяти аналитических повтори остях. В иллюстрациях представлены средние арифметические значения и ошибки средних. Статистическую обработку проводили с использованием компьютерной программы Statistica.
Анализ влияния СК на ростовые процессы проростков в связи с анализом баланса фитогормонов в норме и в условиях засоления
К числу белков, синтез которых контролируется АБК, так называемых rab-белков, в частности, относятся дегидрины, относящиеся к разряду LEA-белков, синтез которых приурочен к стадии созревания семян, сопровождающейся обезвоживанием [Close, 1996; Rock, 2000]. Вместе с тем, защитные функции дегидринов, обусловленные их структурными особенностями, проявляющиеся в способности удерживать воду, предотвращать денатурацию клеточных биополимеров, сохранять целостность мембранных структур в условиях обезвоживания [Close, 1996; Danyluk et al., 1998; Аллагулова и др., 2003], оказались полезными и для вегетирующих растений при стрессовых воздействиях, вызывающих нарушение водного режима, для которых экспрессия генов LEA-белков, в том числе и дегидринов, в норме обычно не характерна [Кулаева, 1994]. В связи с имеющимися данными о повышении под влиянием обработки СК устойчивости растений к дефициту влаги, засолению, нарушению температурного режима [Шакирова, Безрукова, 1997; Seneratna, et al., 2000; Безрукова и др., 2001; Tasgin et al., 2003; Ван и др., 2004], вызывающих обезвоживание, важно было оценить, включаются ли в спектр действия СК, опосредованного через ее влияние на накопление АБК, гены дегидринов.
С этой целью совместно с к.б.н Ч.Р. Аллагуловой были проведены опыты по оценке влияния обработки проростков СК на уровень экспрессии дегидр и н -подоб ного TADHN гена пшеницы. Результаты этого анализа приведены на рис. 6. Обработка проростков СК, как видно, приводит к увеличению транскрипционной активности TADHN гена, которое, однако, в значительной мере наблюдается лишь спустя 24 ч от момента действия СК. Это предполагает, что выявленное нами СК-индуцированное усиление уровня экспрессии дегидринового гена может быть следствием вызванного СК повышения уровня АБК, В пользу этого свидетельствуют данные о высокой чувствительности дегидрин-подобного гена TADHN растений пшеницы к экзогенной АБК, обработка которой вызывает индукцию его транскрипционной активности в проростках [Шакирова и др., 2005].
Действительно, сопоставление динамик содержания АБК и концентрации дегидриновых мРНК демонстрирует, что первый показатель по времени предшествует второму (рис, 6). Это позволяет сделать заключение о важной роли СК-индуцированного транзитного накопления АБК в запуске экспрессии генов дегидринов, что, в свою очередь, может иметь большое значение в проявлении в последующем антистрессовой активности СК.
К числу важных осмопротектантов клеток относится также аминокислота пролин, об участии которой в развитии защитных реакций к стрессовым воздействиям, вызывающим нарушение водного статуса, накоплено большое количество данных [Кузнецов, Шевякова, 1999; Tabaei-Aghdaei et al., 2000; Франко, Мело, 2000; Чиркова, 2002; Титов и др., 2003; Колес, Онсел, 2004]. Важно подчеркнуть, что в регуляции накопления пролина участвует АБК [Pcsci, 1987]. В связи с этим, важно было оценить, происходит ли аккумуляция пролина в проростках пшеницы в ходе обработки СК.
Данные, приведенные на рис. 7, демонстрируют способность СК к существенному, почти трехкратному, обратимому накоплению пролина в проростках, с максимумом, приходящимся на 7 ч. И вновь сопоставление динамик СК-индуцированного накопления АБК и пролина указывает на то, что повышению уровня пролина, как и в случае с дегидрином, предшествует транзитное увеличение содержания АБК. Эти результаты подтверждают роль АБК в контроле уровня пролина в растениях [Pesci, 1987; Таланова и др., 1999]. Вместе с тем, нами впервые выявлено участие СК в индукции накопления этого важного осмопротектанта в клетках растений.
Таким образом, полученные данные об усилении уровня экспрессии дегидрин-подобного гена TADHN и накоплении пролина под влиянием СК указывают на вовлечение этих соединений в спектр ее антистрессового действия на растения пшеницы. Учитывая факт участия АБК в регуляции уровня этих эффективных осмопротектантов и подчеркивая индукцию СК накопления АБК в проростках, которое по времени предшествует увеличению синтеза дегидриновых мРНК и аккумуляции пролина, можно сделать заключение о принципиально важной роли гормона стресса АБК в проявлении антистрессового действия СК на растения пшеницы. Вероятно, именно АБК играет роль интермедиата в запуске защитных реакций в растениях пшеницы под влиянием СК (в частности, дегидрина и пролина), лежащих в основе пред адаптирующего действия СК к последующим стрессовым воздействиям.
Следовательно, сочетание ростстимулирующего и антистрессового эффектов в действии СК обусловлено ее влиянием на параллельное транзитное накопление фитогормонов ИУК и АБК, с первым из которых связана активация ростовых процессов, а со вторым — формирование защитных реакций, направленных на снижение степени повреждения, вызванного возможными стрессовыми воздействиями.
Поскольку интегральным показателем физиологического состояния растений в норме и при стрессе является рост растений, далее мы исследовали влияние предобработки в течение 24 ч СК на ростовые процессы проростков пшеницы в условиях натрий-хлоридного засоления. Засоление. Хлоридное засоление сопровождается не только осмотическим эффектом, но и токсическим воздействием избыточного содержания ионов Na+ и СГ на клеточный метаболизм [Кузнецов, Шевякова, 1999; Jia et al., 2002], а также нарушением баланса Na+/K+. Действительно, при засолении в растениях уменьшается концентрация К+ [Tsugane et al., 1999; Babourina et al., 2000], a Na+ и СГ - увеличивается [Rogers et al., 2003; Halperin, Lynch, 2003; Cavalcanti et al., 2004]. Особенно сильно ионный дисбаланс проявляется у неустойчивых сортов растений. Так, например, устойчивый сорт ячменя характеризуется меньшими в сравнении с неустойчивым сортом потерей К+ и накоплением Na+ в цитозоле [Carden et al., 2003]. Ряд авторов придерживаются мнения, что при засолении растения в большей степени повреждаются от токсических действий ионов, чем от осмотического эффекта [Лапина, 1966; 1967; Ганиева и др., 2000].
