Введение к работе
"„'"''' і J^lf ^АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Теория фотосинтетической продуктив-
нойтйТ сформулированная А.А. Ничипоровичем, сложилась на основе многолетних и разносторонних исследований, проведенных плеядой отечественных и зарубежных исследователей. Достаточно большое внимание в ней уделено факторам, определяющим и лимитирующим фотосинтетическую продуктивность растений.
Важная задача современной экспериментальной биологии - изучение внутриклеточных регуляторних реакций, выявление физиологических функций и звеньев обмена, взаимосвязь которых определяет потенциальную продуктивность растений и их возможность рационально использовать свет, элементы почвенного и воздушного питания.
В настоящее время в специальных обзорах и монографиях хорошо обсуждены основные принципы биохимической адаптации растений (Хо-чачка, Сомеро, 1977, 1988, Трунова, 1984) . Среди последних особый интерес представляют механизмы биохимической адаптации растений к воздействию низкой концентрации С0г (Alzawa, Mlyachi, 1986; Price, Omata, 1988; Пронина, Семененко, 1991).
Низкая концентрация углекислоты в атмосфере нашей планеты является одним из глобальных, постоянно действующих факторов, ограничивающих фотосинтетическую продуктивность растений. Тем не менее фотосинтетические характеристики показывают, что растения способны адаптироваться к этому фактору и увеличивать эффективность утилизации С02 путем концентрирования неорганического углерода (НУ) в клетках и центрах карбоксижрования.
Открытие в 60-х годах С-4 пути фотосинтеза позволило показать, что С02 концентрирующий механизм функционирует у некоторых наземных высших растений и основан на увеличении отношения С02/02 в зонах карбоксилирования. В настоящее время накопилось достаточно данных о существовании механизма концентрирования неорга-
Сокращенш: КА- карбоангидраза, мсКА - мембраносвязанная карбоангидраза, рКА - растворимая карбоангидраза, НУ - неорганический углерод, L-C02 cells - клетки, выращенные при низкой концентрации (0,03%) С02, Н-С02 cells - клетки, выращенные при высокой концентрации (2) С02, ПП - периплазматическое пространство.
I
нического углерода у растений, метаболизирующих углерод по С-3 пути фотосинтеза. Пока существование этого механизма хорошо обосновано для многочисленной группы одноклеточных фотосинтезирующих организмов, обитающих в водной среде и составляющих важное звено биосферы, на долю которого приходится не менее половины всей фо-тосинтетически образованной биомассы Земли.
Фотосинтезирующие клетки микроводорослей являются чрезвычайно удобным объектом для исследований в области физиологии,. биохимии и молекулярной биологии в силу целого ряда причин. К последним относятся простота организации, что позволяет исследовать адаптивные перестройки микроводорослей, в отличие от высших растений, на клеточном уровне, возможность культивирования в интенсивных полностью контролируемых условиях, относительная простота механизмов репродукции и передачи генетической информации, а также возможность получения генетических модификаций и мутантов. Вместе с тем, микроводоросли являются эукариотическими организмами, структурно-функциональная организация которых сходна с таковой у высших растений. Благодаря своим отличительным особенностям микроводоросли сыграли важную роль в изучении многих сторон фотосинтеза и вполне понятным является интерес к этим объектам и в настоящее время, в частности при изучении механизмов утилизации углекислоты.
Ограничение фотосинтеза связано не только с внешними условиями роста растений в атмосфере низких концентраций углекислоты в воздухе и находящимся в равновесии с ним низким содержанием СОг. растворенного в воде, но определяется также и внутриклеточными, факторами. Хорошо известно, что рибулозобисфосфаткарбоксилаза/ок-сигеназа (РБФК/0) имеет низкое сродство к С02, Км которой составляет у микроводорослей 30- 50 цМ, ay цианобактерий около 300 р. М (Aizawa, Mlyachi,1986). Кроме того сродство РБФК/0 к C0g подавляется альтернативным субстратом - кислородом, который выделяется в-значительных количествах при световых реакциях фотосинтеза.
Тем не менее, микроводоросли, выращенные в естественных условиях, характеризуются высоким фотосинтетическим сродством к С0. Значение полунасыщающей фотосинтез концентрации С0 для многих видов микроводо'рослей и цианобактерий составляет менее 1 д М, т. е. на порядок ниже концентрации растворенного C0g в воде (10/i М С02
при равновесии с воздухом) и на несколько порядков ниже Км(СОг) РБФК/0.
Анализ этих фактов привлек в конце 70-х начале 80-х годов значительный интерес отечественных (Семененко и др., 1977, 1979; Косицин, 1977; Пронина и др.. 1977, 1981; Романова, 1980; Бородин и др.,1983, Рамазанов и др. 1984, Алиев, Гулиев, 1985) и зарубежных (Reed, Graham, 1977, 1979; Miyachl et al, 1979. 1983; Badger. Kaplan, Berry, 1980; Spalding,- Ogren, 1982, 1983; Аврамова и др.. 1984; Moroney et al. 1985) исследователей к изучению биохимических процессов и регуляторних реакций, которые лежат в основе адаптации фотосинтезирующих клеток к условиям углекислотного ограничения, и позволил в настоящее время сформулировать концепцию о существовании С02 концентрирующего механизма у микроводорослей, утилизирующих углерод по С-3 пути фотосинтеза. В деталях механизм накопления неорганического углерода и концентрирования C0g в хлоропластах остается неясным, тем не менее, многие физиологические, биохимические и, в последние годы, молекулярно-биологические исследования позволяют приблизиться к пониманию общей организации такого механизма.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: Основной целью настоящей работы явилось изучение механизмов утилизации низких концентраций углекислоты клетками микроводорослей и адаптивных реакций фотосинтезирующих организмов к условиям углекислотного ограничения, а также исследование клеточной и молекулярной организации С02 концентрирующих систем в фотосинтезирующих клетках.
Достижение цели исследования потребовало решения следующих основных задач:
-
Изучить физиологическое проявление С02 концентрирующего механизма по активности фотосинтетического аппарата микроводорослей в зависимости от условий С02 обеспечения, интенсивности света и сопряженного действия этих факторов.
-
Выяснить механизмы утилизации НС03" и способность клеток к ассимиляции экзогенного бикарбоната, который может служить дополнительным источником неорганического углерода при его концент-
рировании в фотосинтезирущей клетке.
-
Выяснить роль карбоангидразы и компартментации этого фермента в индукции C0g концентрирующего механизма, генерации и фиксации С0г.
-
Охарактеризовать молекулярную организацию С0г концентрирующего механизма и кинетические свойства различных форм карбоангидразы фотоавтотрофных клеток микроводорослей.
-
Исследовать клеточную организацию карбоангидразной системы у представителей различных таксономических групп микроводорослей и их мутантов в зависимости от условий углеродного обеспечения, структурной организации фотосинтетического аппарата и рН градиента в различных компартментах клетки.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА: Б диссертационной работе выдвинуты и экспериментально обоснованы новые представления о существовании в фо-тосинтезирующих клетках карбоангидразной системы, включающей растворимые и мембраносвязанные формы фермента. Детально изучены организация карбоангидразной системы у различных таксономических групп микроводорослей, физиологические и биохимические свойства, регуляция синтеза различных форм карбоангидразы, а также адаптивные перестройки их активности в зависимости от источника и условий С02 обеспечения, а также интенсивности света. Развито представление о наличии в клетках микроводорослей конститутивных и ин-дуцибельных форм КА. Полученные данные восполняют пробел информации об организации С0 концентрирующего механизма и показывают необходимость полностью сформированной карбоангидразной системы, включающей мембраносвязанные (мсКА) и растворимые (рКА) формы фермента, для функционирования процессов накопления неорганического углерода в фогосинтезирующих клетках и для превращения этого пула в форму, необходимую для карбоксилирования.
Показано, что мсКА у Chlorella, Chlamydomonas и Dunaliella является прочно встроенным интегральным белком плазмалеммы и ти-лакоидных мембран. Установлено, что мсКА Chlamydomonas входит в состав полипептидных комплексов фотосистем хлоропласта. Исследована регуляция синтеза мсКА и рКА в клетках Chlorella и показано, что синтез рКА, индуцибельной низкими концентрациями С0, контролируется ядерным геномом клетки.
Впервые вскрыта роль света при включении механизма концентрирования неорганического углерода и индукции активности индуци-бельной низким содержанием С02 формы КА в клетках микроводорослей.
Показано, что способность утилизировать бикарбонатный ион из среды свойственна многим видам микроводорослей, принадлежащих к родам Chlorella и Scenedesmus, и разработана математическая модель, описывающая накопление НУ в клетках эукариот, центральным элементом которой является активный транспорт бикарбоната через плазмалемму, а также модель генерирования С02 из бикарбонатного пула строки хлоропласта, в которой ключевую роль играет мсКА, локализованная в тилакоидных мембранах, и светоиндуцированный градиент протонов в люмене хлоропласта.
Полученные экспериментальные данные и сделанные на их основе обобщения позволили сформулировать представление о клаточной и молекулярной организации С02 концентрирующих механизмов в фото-синтезирующих клетках, как целостных интегрированных системах. Предложенные модели механизмов концентрирования, генерации и фиксации С02 в хлоропласте микроводорослей учитывают наличие активного транспорта НУ, индукцию карбоангидразы. как элемента С02 концентрирующей системы, рН клеточных компартментов. а также внутриклеточную локализацию и топологию КА, РБФ-карбоксилазы и фотохимических систем хлоропласта.
НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ: Сформулированная в работе концепция о механизмах концентрирования С02 расширяет представления о фотосинтетическом метаболизме углерода, рассматривая первичные процессы утилизации, трансмембранного переноса, внутриклеточного накопления и концентрирования НУ в хлоропласте. Становится ясным, что механизм концентрирования С02, включающий метаболические пути неорганического углерода до включения его в органические продукты, является важным регуляторным звеном жизнедеятельности фотосинтезирующей клетки, сохранения ее гомеостаза и адаптации к условиям углекислотного обеспечения.
Практическая реализация исследований заключается в разработке способов культивирования микроводорослей в условиях углекислотного ограничения, а также на бикарбонатсодержащих средах (Про-
нина и др., 1991), что значительно снижает себестоимость биомассы и является новой ресурсосберегающей технологией. Разработанные в ходе проведенного исследования методические приемы могут использоваться для диагностики физиологического состояния клетки и создания регламента углекислотного режима культивирования микроводорослей, которые широко исследуются как объекты для биотехнологии фотоавтотрофных биосинтезов и находят все большее применение в практике народного хозяйства (Семененко, 1985, Дилов, 1985).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ: Результаты исследований по теме диссертации доложены (или представлены) и обсуждены на:
Всес. конф. по регуляции биохим. процессов у микроорганизмов (Пущино, 1972),
Межд.симп."Рост микроорганизмов на С1 соединениях"(Пущино, 1977).
Научно-координационном совещ. СЭВ "Хлорофилл-белковый комплекс" (ВНР, Сегед, 1977),
семинарах ИФР БАН (София, 1977, 1979, 1986),
4-м Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1979),
Конференции молодых ученых ИФР АН СССР (Москва, 1978),
"Круглых столах", посвященных исследованиям механизмов концентрирования С02 в растительных клетках (Ленинград, 1979, Душанбе, 1982, Минск, 1990),
Всес. совещ. по вопросу круговорота веществ в замкнутых экологических системах (Киев-Канев, 1979,1981,1983),
Всес. совещ. "Энергетика, метаболические пути и их регуляция в фотосинтезе" (Пущино, 1981),
Межд. конф. "Кинетика фотосинтетического метаболизма углерода в С-3 растениях (Таллин, 1983),
Межд.симп. "Минеральное питание растений и фотосинтез"(НРБ, Варна, 1987),
Всес научн, конф. "Физико-химическая биология и биотехнология фототрофных микроорганизмов" (Москва, 1987),
Конференции Федерации европейских обществ физиологов растений FESPP (Югославия, 1988),
Международном конгрессе по фотосинтезу (Стокгольм 1989),
Всес. конф. "Преобразование световой энергии в фотосинтези-
рующих системах и их моделях" ( Пущине 1989).
Втором съезде ВОФР (Минск, 1990),
Конференции, посвященной 100-летию ИФР АН СССР (Москва 1990).
Международном совещании "Метаболизм углерода и азота при фотосинтезе" (Пущине 1991),
Международном симпозиуме "Фотосинтез и стресс" (Чешские Буди-евицы, 1991),
Международной конференции "Итоги и перспективы энзимологи-ческих исследований метаболизма углерода при фотосинтезе" (Душанбе. 1991).
Расширенном семинаре ИФР РАН (Москва. 1991)
ПУБЛИКАЦИИ: По материалам диссертации опубликовано в отечественных и зарубежных научных изданиях 42 работы.
