Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы б
3. Объекты и методы исследования 19
4. Генетический контроль числа и размера хлоропластов
4.1. Постановка вопроса 23
4.2. Опыты с сахарной свеклой 23
4.3. Опыты с хлопчатником 33
4.4. Опыты с пшеницей 36
4.5. Заключение 39
5. Геномный контроль ультраструктуры хлоропластов
5.1. Постановка вопроса 40
5.2. Опыты с сахарной свеклой 40
5.3. Опыты с хлопчатником 44
5.4. Опыты с арабвдопсисом 47
5.5. Заключение 50
6. Интенсивность фотосинтеза в зависмости от дозы генома
6.1. Постановка вопроса 52
6.2. Опыты с сахарной свеклой 52
6.3. Опыты с хлопчатником 61
6.4. Заключение 63
7. Влияние уровня плоидности генома на активность рдф-карбоксилазы
7.1. Постановка вопроса 64
7.2. Опыты с сахарной свеклой 64
7.3. Заключение 70
8. Влияние экологического стресса на интенсивность фотосинтеза полиплоидных шорм сахашой свеклы и хлопчатника
8.1. Постановка вопроса 70
8.2. Опыты с сахарной свеклой 71
8.3. Опыты с хлопчатником 78
8.4.. Заключение 85
9. Общее заключение 87
10. Выводы 91
11. Литература 93
Опыты с сахарной свеклой
Количество и размер хлоропластов в растительных клетках служит одним из важнейших показателей фотосинтетической активности листа. В связи с этим большой практический интерес представляет выяснение природы образования пластид и возмояшости управления этим процессом через наследственность.
Для выяснения природы и изучения механизмов генетического контроля образования пластид одним из плодотворных подходов является использование полиплоидов. Полиплоидия дает возможность расчленить роль ядерных и пластидных геномов в биогенезе хлоропластов и локализовать генетические факторы, контролирующие этот процесс по хромосомам. Нами было изучено влияние полиплоидии и гетероплоидии на размер и число хлоропластов в клетках сахарной свеклы, хлопчатника и пшеницы. Из этих данных видно, что с увеличением дозы генома происходит количественное возрастание числа хлоропластов как в усть-ичных, так и в палисадных клетках мезофилла листа. При этом диаметр хлоропластов не изменяется. Наши трехлетние исследования указывают на то, что такая закономерность сохраняется во всех фазах развития растений (табл. 2). Данные таблицы подтверждают точку зрения о ядерной детерминированности репликации ДНК хлоропластов и их размножения (Насыров, 1975). Известно, что наиболее общим свойством полиплоидии является увеличение размеров клеток. Наши измерения палисадных клеток показали, что у три- и тетраплоидных растений объем клеток в 2,0-2,5 раза больше, чем у диплоидных. При этом наблюдается прямая корреляция между увеличением числа хлоропластов и объемом палисадных клеток ( г = 0,73).
В связи с этим возникает вопрос: какие механизмы обуславливают эту корреляцию и лежат в основе детерминации размера популяции хлоропластов в клетке? По мнению некоторых авторов ( Boasscm et al., 1972; Цельникер, 1973), фаза, рост и растяжение клеток являются периодом детерминации числа хлоропластов в клетке. Однако, как отмечают другие авторы (Butterfass, 1973; Агаев, 1977), величина клеток не является лимитирующим фактором пролиферации пластид и что размер их популяции определяется количеством ядерной ДНК. Корреляция между числом хлоропластов в клетке и содержанием ДНК в ядре проявляется столь строго, что изменение количества пластид можно использовать как тест на изменение содержания ядерной ДНК (Butterfass, 1973; Мокроносов, 1981).
Сбалансированность числа пластид в клетке с количеством ДНК в ядре можно объяснить, исходя из того, что увеличение пло идности означает увеличение числа и разнокачественное аллелей, а следовательно, и синтеза белков, в том числе изофермен-тов (Мокроносов, 1981). Известно, что многие белки хлороплас-тов, обладающие четвертичной структурой, образуются в хлоропласте самосборкой из разных субъединиц, кодируемых либо ядерной, либо пластидной ДНК, При такой ситуации увеличение содержания ядерной ДНК и усиление синтеза одной фракции субъединиц белка (например, малых субъединиц РДФ-карбоксилазы), должно быть сбалансировано увеличением синтеза комплементарных субъединиц в хлоропласте ( в данном примере - больших субъединиц РДФК).
Это может быть достигнуто либо за счет полиплоидизации хлоропласта, например, увеличения числа кольцевых хромосом в хлоропласте с 20-30 до 40-60, либо за счет увеличения числа пластид с прежним числом копий ДНК (Мокроносов, 1981). Большинство известных фактов показывает, что реализуется вторая возможность.
Результаты опытов с применением ингибиторов транскрипции и трансляции, а также с энуклеированными клетками показали, что гены и ферменты, контролирующие деление и размножение хло -ропластов, находятся в самих хлоропластах, а их активизация осуществляется ядерными генами нэпосредоствзшо через цитоплазму (Насыров, 1975).
Следовательно, деление и размножение хлоропластов в клетке контролируется кооперативным воздействием ядерных и цито-плазматических генов.
Как мы уже отмечали ранее, полиплоидия вызывает глубокие изменения в анатомическом строении листа растения (Градчанино-ва, 1967; Бормотов, Турбин, 1972; Бычко, 1976). В таблице 3 приведены показатели анатомических параметров листа полиплоидных линий сахарной свеклы. Из таблицы видно, что с увеличением плоидности генома толщина верхнего эпидермиса на третьей паре листьев резко возрастает. Если у диплоидного набора она составляет 15 мкм, то на тетраплоидном аналоге она достигает 30 мкм, а триплоид по этому признаку занимает промежуточное положение. Однако такая картина не наблюдается у нижнего эпидермиса в начале вегетации.
Толщина палисадного слоя мезофилла листа тетраплоидов больше толщины палисадного слоя листа диплоидов почти наполовину, а триплоиды занимают промежуточное положение. В середине вегетации толщина листовой пластинки тетраплоида по сравнению с диплоидом возрастает на 142 %» В конце вегетации растений сахарной свеклы толщина верхнего эпидермиса выравнивается или имеется слабое увеличение у тетраплоидов, а другие параметры остаются, как в начале вегетации.
В связи с этим можно сказать, что с увеличением плоидности генома ядра увеличивается как палисадный, так и губчатый слой паренхимы листа. Это приводит к утолщению листовой пластинки у полиплоидов.
Опыты с пшеницей
В этом разделе приводятся данные исследований по изучению ультраструктуры хлоропластов полиплоидных видов и линий сахарной свеклы, хлопчатника и арабидопсиса.Морфогенез хлоропластов, в частности морфогенез мембранной системы тилакоидов, был предметом многочисленных исследований, обзоров и обсуждений (Тагеева, 1962, 1964, 1972; Ветт-штейн, 1962; Kirk, Tilney-Basset, 1967; Muhlethaler, 1971). С помощью генетических и физиологических экспериментов были установлены последовательные этапы становления мембранной системы хлоропластов, начиная от образования пузырьков-везикул до формирования настоящих гран (Wettstein, 1959; Robbelen, 1957; Frey-Wissling, Munlethaler, 1959, 1971).
Известно, что мутации ядерных и пластидных генов приводят к существенным изменениям структуры и функции хлоропластов (Насыров, 1975, 1978; Хагеман и др., 1974). Что касается роли полиплоидии в формировании ультраструктуры фотосинтетического аппарата, то этот вопрос изучен недостаточно. Поэтому в настоящей работе мы поставили перед собой задачу изучить влияние увеличения плоидности генома на ультраструктурную организацию хлоропластов с использованием перспективного метода - количественной электронно-микроскопической морфометрии. 5.2. ОПЫТЫ С САХАРНОЙ СВЕКЛОЙ
Электронно-микроскопический анализ хлоропластов ди-, три-и тетраплоидных линий сахарной свеклы показал, что они имеют типичное строение, характерное для хлоропластов высших растений в норме ( Lefort, 1957; Wettstein, 1957; Тагеева и др., 1963, 1964, 1972; Генерозова, 1965; Kirk, Tilney-Bassett, 1967; Козубов, Данилова, 1972). Они имеют хорошо развитую мембранную систему с многочисленными гранами, состоящими из 10-15 тилакоидов и связанными между собой межгранными тилакопластид не наблюдается, за исключением накопления большого количества крахмала в хлоропластах тетраплоидных линий (рис. 2, 3).
Многие авторы также не нашли существенных изменений в ультраструктуре хлоропластов при изменении уровня плоидности генома клеток ( Marek, Riman, 1969; Steer, Holden, Gunning, 1970; De Maggio, Stetler, 1971; Гуламов, 1972). Ю.М. Агаев (1976) при изучении ультраструктуры клеток растений полиплоидного ряда рода Morus, начиная от 2 п до 22п, не обнаружил никаких существенных изменений в структуре хлоропластов. Однако некоторые авторы отмечают, что различия в ультраструктуре хлоропластов проявляются при несбалансированных (нечетных) уровнях плоидности генома (Туровский, 1970, 1972; Lee, Hecht, 1975). Эти авторы обнаружили, что гранальность сильнее развита в хлоропластах из диплоидных клеток, чем из гаплоидных.
Таким образом, результаты наших исследований и данных работ многих других авторов свидетельствуют о том, что при увеличении кратного набора хромосом ультраструктура пластид остается без существенных изменений.
Для выявления более тонких различий в ультраструктуре хлоропластов полиплоидных растений нами был использован перспективный метод количественной электронномикроскопической морфо-метрии. Как показали результаты проведенного морфометрического анализа, полиплоидия вызывает значительные сдвиги в количественных параметрах компонентов ультраструктуры пластид (табл. 6). Из таблицы 6 видно, что увеличение дозы генома сопровождается, как правило, уменьшением суммарного объема тилакоидов и увеличением содержания крахмала в хлоропластах. При этом между этими показателями наблюдается обратная корреляция (г =-0,84).
Аналогичная корреляция между содержанием крахмала и количеством мембранной системы хлоропластов была отмечена ранее для хлоропластов мезофилла листьев в условиях азотного голодания и для хлоропластов клеток Acetabularia, выращенных при красном свете (Priol, Bourdu, 1971; Wettermann, 1973).
Из вышеприведенных данных видно, что накопление крахмала происходит как в случае полиплоидии, так и при действии неблагоприятных условий среды. Совершенно ясно, что в любом из этих случаев повышенное содержание крахмала может служить "диагностическим признаком", свидетельствующим о функциональных изменениях хлоропластов.
Для подтверждения результатов морфометрических измерений компонентов ультраструктурной организации хлоропластов нами проводился биохимический анализ содержания крахмала в листьях автополиплоидных линий сахарной свеклы. Как видно из таблицы 7, с увеличением плоидности генома наблюдается повышение содержания крахмала в хлоропластах.
Результаты биохимического анализа содержания крахмала в листьях автополиплоидов сахарной свеклы подтверждают данные, полученные методом электронно-микроскопической морфометрии. Такое изменение компонентов ультраструктурной организации хлоропластов при увеличении плоидности генома характерно также для пластид полиплоидных форм и видов хлопчатника и арабидоп-сиса.
Зеленые листья тетраплоидных (амфидигоюидных) видов хлопчатника G. hirsutum и G. barbadense содержат хорошо развитые хлоропласты, которые по организации мембранной системы мало чем отличаются от хлоропластов диплоидных растений вида G. arboreum (рис. 3). Наиболее характерной особенностью структуры хлоропластов тетраплоидных форм является наличие большого количества крахмала в хлоропластах. Наглядной иллюстрацией этому могут служить данные морфометрии структурных компонентов пластид (табл. 8).
Опыты с арабвдопсисом
Однако не исключено, что при таком способе расчета возможно допущение ошибки, поскольку в листьях, имеющих одинаковую площадь, но различную толщину, может содержаться разное количество мезофильных клеток и хлоропластов. Чтобы избежать такой ошибки, мы проводили расчеты на один хлоропласт.
На рисунке 7 приведены результаты различных способов расчета фотосинтетической фиксации COg - на вес и площадь листа, а также на один хлоропласт у автополиплоидных линий сахарной свеклы. Анализ этих данных показывает, что возрастание дозы генома положительно коррелирует с увеличением фотосинтеза в расчете на единицу веса и площади листа. Однако интенсивность фотосинтеза в расчете на один хлоропласт снижается. Детальный анализ полученных данных позволяет сделать следующие предположения по поводу отмеченных выше различий в фотосинтезе сравниваемых полиплоидных линий.
Если принять за основу общеизвестный факт, что существует прямая корреляция между объемом тилакоидов и интенсивностью фотосинтеза (Кирк, 1970), то полученные экспериментальные данные можно объяснить следующим образом. В разделе 5 было показано, что возрастание числа хромосом приводит, как правило, к закономерному увеличению содержания крахмала и уменьшению суммарного объема фотосинтетически активных мембран в хлоропластах. По данным морфометрического анализа общий объем тилакоидов в хлоропластах диплоидных форм составляет 4,7 миг, а у тетрап-лоида - 3,6 мкм . Следовательно, уменьшение интенсивности фотосинтеза в расчете на один хлоропласт у тетраплоидов является результатом значительно меньшего количества тилакоидов по сравнению с хлоропластами диплоидных линий. С другой стороны, из литературы известно, что накопление крахмала в пластидах до некоторой критической концентрации не влияет на фотосинтез и только превышение этого уровня подавляет фиксацию COr, ( Mil-ford, Perman, 1975; Nafziger, Koller, 1976; Glaussen, Biller, 1977; Mariani et al., 1977; Carmi, Shomer, 1979; Mauney et al.,I979). Причины ингибирования фотосинтеза под влиянием накопления крахмала в хлоропласте обсуждены в работе А.Т. Мокроносова (1982).
Таким образом, высокая интенсивность фотосинтеза листьев тетраплоидных растений обусловлена не столько функциональной активностью отдельно взятых пластид, сколько повышенной численностью их в клетке.
Аналогичные данные нами были получены при изучении фотосинтеза полиплоидных видов и сортов хлопчатника.
В таблице 12 представлены данные по изучению интенсивности фотосинтеза некоторых полиплоидных видов и сортов хлопчатника. Как следует из этих данных, тетраплоидные виды хлопчатника, особенно дикий подвид характеризуются высокой интенсивностью фотосинтеза. У этого дикого подвида обнаружена максимальная интенсивность фотосинтеза. У него, как было отмечено выше, наблюдается наивысшее число хлоропластов в клетке (табл. 12). Повышение интенсивности фотосинтеза с увеличением дозы аллельных генов у хлопчатника, вероятно, происходит не за счет качественных изменений фотосинтетического аппарата, а достигается за счет увеличения числа хлоропластов в клетке. Интенсивность фотосинтеза в расчете на один хлоропласт у мексиканского вида ниже, чем у диплоидных.
Наиболее функционально активные хлоропласты обнаружены у диплоидных видов G. herbaceum и G. агЪогешп. У всех изученных тетраплоидов фотосинтез в расчете на один хлоропласт ниже, чем у диплоидов. Исходя из этого, можно сделать заключение о том, что высокая интенсивность фотосинтеза листьев тет-раплоидных видов хлопчатника обусловлена не столько функциональной активностью отдельно взятых пластид, сколько повышенной их численностью в клетке. Следовательно, число хлоропластов может служить тест-признаком отбора селекционных форм с высокой интенсивностью фотосинтеза.
Таким образом, на основании данных, полученных при изучении полиплоидных линий сахарной свеклы и видов хлопчатника, создается впечатление, что диплоидные растения сахарной свеклы и хлопчатника характеризуются оптимальным уровнем численности функционально активных хлоропластов в клетке. Увеличение их числа выше оптимального, которое уже имеется на диплоидном уровне, может привести к снижению функциональной активности хлоропластов. Таким образом, установление порога оптимальной численности высокоактивных хлоропластов для других видов растений и возможности управления этим процессом через наследственность может служить важным критерием создания новых высокопродуктивных сортов растений интенсивного типа.
Опыты с хлопчатником
Результаты проведенных исследований по изучению влияния уровня плоидности генома на активность фермента РД1-карбоксила-зы позволяют сделать следующее заключение. Возрастание дозы генома сопровождается повышением удельной активности ключевого фермента цикла Кальвина - РДФ-карбоксилазы-оксигеназы, Онтогенетическое изменение активности этого фермента в процессе роста и развития листа хорошо коррелирует с динамикой интенсивности фотосинтеза. Такая корреляция позволяет предложить удельную активность фермента РДФ-карбоксилазы как тест-систему для отбора форм с высоким фотосинтетическим потенциалом. В предыдущих разделах в естественных условиях нами было показано влияние полиплоидии на мезоструктуру и функциональную активность фотосинтетического аппарата. Так как реализация генетической информации происходит во взаимодействии генотипа с внешней средой, то представляет определенный интерес изучение степени проявления эффекта дозы генома при экологическом стрессе. В связи с этим нами изучалось влияние стрессовых воздействий у полиплоидных форм сахарной свеклы и хлопчатника. В качестве фактора экологического стресса было использовано хлоридное засоление.
Проростки растений сахарной свеклы и хлопчатника в условиях гидропоники подвергались действию солевого стресса. Концентрация NaCi в питательном растворе доводилась до 2,0 %. Солевой режим поддерживался на протяжении 10-15 суток, после чего растения переводили в нормальный режим питания. От солевого стресса в наших опытах погибало более 90 % растений. На оставшихся растениях проводились морфофизиологические наблюдения и анализ хозяйственно-ценных признаков.
Как видно из этих данных, экологический стресс вызывает значительное изменение основных показателей мезоструктуры листьев полиплоидных линий сахарной свеклы. При этом отмечается снижение количества хлоропластов как в палисадных, так и в губчатых клетках. Размер хлоропластов существенно не изменяется. Длина палисадных клеток уменьшается, а их диаметр остается почти без изменений, т.е. солевой стресс приводит к развитию мел-коклеточности.
Утолщение листовой пластинки у полиплоидных линий обусловлено увеличением толщины палисадного и губчатого слоев - хлорен-химы, а также верхнего и нижнего эпидермиса (табл. 15). Аналогичные изменения мезоструктуры фотосинтетического аппарата отмечены другими авторами при воздействии на растения таких факторов экологического стресса, как водный и температурный стресс (Федосеева, 1978; Bauer, Senser, 1969; Мокроносов, I98J) и недостаток света (Цельникер, 1978).
После снятия действия фактора экологического стресса в растениях восстанавливается нормальное состояние мезострукту-ры листа (табл. 16).
Из вышеизложенного следует, что экологический стресс приводит к изменению мезоструктуры фотосинтетического аппарата. Эти изменения мезоструктуры рассматриваются как существенное проявление регуляции фотосинтеза на морфогенетическом уровне, обеспечивающей оптимизацию и адаптацию фотосинтетического аппарата при разных экологических режимах (Мокроносов, 1981).
Изменение мезоструктуры листа не могло не повлиять на функциональную активность фотосинтетического аппарата. Из рисунка 10 видно, что хлоридное засоление приводит к резкому снижению интенсивности фотосинтеза сахарной свеклы. После снятия действия экологического стресса деятельность фотосинтетического аппарата у диплоидных и тетраплоидных линий сахарной свеклы восстанавливается и даже превосходит контрольные растения. При этом отмечается сравнительно более высокая устойчивость фотосинтетического аппарата тетраплоидных линий к действию солевого стресса.
Аналогичная картина наблюдается при изучении удельной активности ключевого фермента фотосинтеза РДШ-карбоксилазы (табл. 17). Как видно из таблицы 17, у опытных растений при солевом стрессе происходит падение активности РДФ-карбоксилазы. После снятия стрессового фактора активность этого фермента резко возрастает, причем активность фермента выше, чем у контрольных растений.
