Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 6
1.1. Роль фотосинтетических пигментов в защитных механизмах фотосинтетического аппарата растений 6
1.2. Фотосинтетический аппарат растений в условиях природного стресса 20
1.2.1. Фотосинтетический аппарат хвойных растений при переходе к зиме и в условиях зимнего стресса (низкая температура и высокая освещенность) 20
1.2.2. Фотосинтетический аппарат травянистых растений при действии закаливающих и повреждающих температур 25
1.3. Фотосинтетический аппарат растений в условиях антропогенного стресса 31
1.3.1. Фотосинтетический аппарат хвойных растений в условиях промышленного загрязнения и на урбанизированных территориях 31
1.3.2. Фотосинтетический аппарат Festucapratensis Huds. на урбанизированных территориях 34
1.4. Мутанты в изучении фотосинтетического аппарата растений в условиях стресса 35
Глава 2. Объекты и методы исследования 43
2.1. Объекты исследования 43
2.2. Краткая характеристика районов исследования 44
2.3. Схемы экспериментов 46
2.4. Методы исследования 49
2.4.1. Биометрический метод 49
2.4.2. Определение пигментного состава 49
2.4.3. Определение интенсивности фотосинтеза по выделению кислорода 50
2.4.4. Определение параметров флуоресценции 51
2.4.5. Определение активности электронного транспорта фотосистем I и II 52
2.4.6. Статистическая обработка данных. 53
Глава 3. Результаты и обсуждение 54
3.1. Фотосинтетический аппарат хвойных растений под воздействием различных неблагоприятных факторов 54
3.1.1. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. в условиях зимнего стресса (условия низкой температуры и высокой освещенности) 54
3.1.2. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. и Pinus sylvestis L. в условиях антропогенного загрязнения 60
3.1.2.1. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. и Pinus sylvestisL. в зоне действия Мончегорского комбината 60
3.1.2.2. Фотосинтетический аппарат Pinus sylvestris L. в зоне действия Костомукшского ГОКа 71
3.1.2.3. Состояние фотосинтетического аппарата Picea abies L. на территории г. Петрозаводска 74
3.2. Фото синтетический аппарат злаковых растений под воздействием различных неблагоприятных факторов 80
3.2.1. Фотосинтетический аппарат Triticum aestivum L. cult. Рото под воздействием различной температуры и освещенности 80
3.2.1.1. Низкотемпературное закаливание 80
3.2.1.2. Высокотемпературное закаливание 81
3.2.1.3. Действие отрицательных температур в условиях различной освещенности ...83
3.2.2. Состояние фотосинтетического аппарата естественных популяций Festuca pratensis Huds. на территории г. Петрозаводска 87
3.2.3. Состояние пигментного аппарата Festuca pratensis Huds., подвергнутой воздействию радиации 90
3.2.4. Характеристика фотосинтетического аппарата хлорофиллдефектных мутантов Festuca pratensis Huds ...91
3.2.4.1.Определение пигментного состава и композиции каротиноидов в условиях оптимума, температурной нагрузки и в ходе восстановления 91
3.2.4.2. Изучение активности фотосинтетического аппарата в условиях температурного оптимума и нагрузки 101
Заключение 115
Выводы 120
Список литературы 122
Приложение 150
- Фотосинтетический аппарат растений в условиях природного стресса
- Фотосинтетический аппарат растений в условиях антропогенного стресса
- Определение интенсивности фотосинтеза по выделению кислорода
- Фото синтетический аппарат злаковых растений под воздействием различных неблагоприятных факторов
Введение к работе
Актуальность. Фотоингибирование у растений возникает в условиях, когда поглощение световой энергии хлорофиллом превышает ее использование в фотосинтезе. "Избыточное" освещение может быть как при высокой, так и при низкой освещенности в условиях стрессов, снижающих активность фотосинтеза (недостаток кислорода, неблагоприятная температура, загрязнение) (Winter, Demmig, 1987; Маслова и др., 1996; Smirnoff, 1996; Ciorapi et al., 1997; Montane, 1998; Liu et aL, 2001; Tsonev et al., 2003 и др.). Интерес к механизмам защиты фотосинтетического аппарата растений от повреждений, возникающих вследствие действия неблагоприятных факторов, огромен, особенно это касается функционирования антиоксидантных систем (Krinsky, 1966; Lichtenthaler, Schindler, 1992; Schubert et aL, 1994; Tausz et al., 1999, 2001; Baroli et al., 2002; Miiller-Moulle et al., 2003 и др.). Одной из таких систем является открытый в 1957 г. виолаксантиновый цикл (Сапожников и др., 1957), функциональной активности которого посвящено большое число обзорных работ (Sieferman-Harms, 1977; Yamamoto, 1979; Hager, 1980; Demmig-Adams, Adams, 1992; Pfumdel, Bilger, 1994; Маслова и др., 1996; Gilmore, 1997; Young et al., 1997; Niyogi et al., 1998, 1999; Havaux, Niyogi, 1999; Demmig-Adams et al., 1999; Frank, 2000; Gilmore, Ball, 2000; MOller et aL, 2001; Ладыгин, 2002; Govindjee, 2002; Oquist, Huner, 2003 и др.). Большой вклад в эти разработки внесли исследования с использованием генетически модифицированного материала, которые показали место генов, ответственных за работу виолаксантинового цикла (Runge, 1995; Dauborn, Bruggemann, 1998; Hartel, Grimm, 1998; Ладыгин, 1998; Havaux et al., 2000; Niyogi et al., 2001; Govindjee, 2002; Elrad et al., 2002; Walters et al., 2003; Peng, Gilmore, 2003; Jin et al., 2003; Havaux et al., 2004 и др.). Растения с генетическими изменениями рассматриваются как мощный инструмент для изучения регуляции процессов фотосинтеза и сети механизмов, вовлеченных в различные ответные реакции на стресс.
Однако при всех блестящих работах на молекулярно-генетическом уровне остается много нерешенных проблем на уровне организма и тех физиологических механизмов, которые обеспечивают включение защитных реакций и их функционирование в различных условиях среды. Особое внимание в современной литературе уделяется проблеме влияния на растение неблагоприятных климатических условий и факторов антропогенной природы. Насколько универсальны те системы, которые природа вложила в растительные организмы для реакции на природные факторы, и как они будут справляться с антропогенным воздействием? Этот вопрос остается открытым. Спектр стрессовых воздействий очень широк и даже на уровне одного фактора возникает очень много принципиальных отличий в реакции различных видов растений, которые могут решаться только экспериментальным путем. Кроме того, многие аспекты, связанные со скоростью развития и длительностью действия защитных механизмов и их зависимостью от вида и жизненной формы растения, остаются до конца невыясненными. Все эти вопросы ставят проблему изучения реакции растительного организма на стрессовые воздействия в число современных и актуальных.
Целью данной работы явилось сравнительное изучение фотосинтетического аппарата и механизмов его адаптации у хвойных древесных и травянистых злаковых растений при действии неблагоприятных природных и антропогенных факторов. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- изучить роль пигментов виолаксантинового цикла в защите фотосинтетического аппарата Picea abies L. при действии низких отрицательных температур и высокого уровня освещенности в зимний период;
- исследовать содержание фотосинтетических пигментов и биометрические показатели листа (хвои) у древесных хвойных (Picea abies L. и Pinus sylvestris L.) и травянистого злака Festuca pratensis Huds. в условиях антропогенного загрязнения;
- изучить активность фотосинтетического аппарата Triticum aestivum L. при действии низких и высоких закаливающих температур, а также при отрицательной температуре и различном уровне освещенности;
- исследовать содержание пигментов и активность фотосинтетического аппарата контрольной (сорт Карельская) и мутантных линий Festuca pratensis Huds., обладающей хлорофиллдефектностью в условиях высокой температуры.
Научная новизна.
Впервые показана функциональная активность пигментов виолаксантинового цикла у древесных хвойных растений в условиях суровых зим северо-таежных зон при быстрых изменениях погоды - оттепель и мороз, сопряженный с высокой освещенностью.
Впервые дана физиологическая характеристика фотосинтетического аппарата (по содержанию пигментов, интенсивности фотосинтеза, параметрам переменной флуоресценции ХЛЙИ спектрам излучения ФС I и II при 77 К) температурозависимых хлорофиллдефектных фенотипов контрольной и мутантных линий Festuca pratensis Huds.
Практическая значимость. Полученные экспериментальные данные дополняют и расширяют современные представления об адаптивных возможностях фотосинтетического аппарата древесных хвойных и травянистых злаковых растений при действии неблагоприятных природных и антропогенных факторов и могут быть использованы при чтении базового курса и спецкурсов по физиологии растений в вузах.
Результаты исследования ассимиляционного аппарата двух видов хвойных в условиях слабого и сильного загрязнения могут быть использованы в экологическом мониторинге.
Фотосинтетический аппарат растений в условиях природного стресса
Фотосинтетическпй аппарат хвойных растений при переходе к зиме и в условиях зимнего стресса (низкая температура п высокая освещенность) Сезонная динамика. Хвойные растения имеют многолетнюю хвою, ассимиляционный аппарат которой должен быть адаптирован к условиям среды во все сезоны года. Эта адаптация включает как длительные сезонные изменения, так и способность к быстрым перестройкам в экстремальных условиях, которые имеют место и в зимний период.
Известно, что хвойные растения испытывают сезонные изменения в уровне содержания пигментов (Царегородцева, 1970; binder, 1972; Новицкая, 1971; Adams, Demmig-Adams, 1992, 1994; Ottander et aL, 1995; Vogg et aL, 1998; Garcia-Plazaola et aL, 1999), которые различаются в хвое разного возраста (Новицкая, 1971). У однолетней хвои ели и сосны самое низкое содержание пигментов отмечено в июне, в то время как в двухлетней и трехлетней хвое в июне содержится сравнительно высокое количество пигментов. В течение года в зависимости от возраста хвои можно отметить несколько максимумов в содержании зеленых пигментов: летне-осенний (Новицкая, 1971; Ottander, 1995; Vogg, 1998) и весенний (Новицкая, 1971). Е. Ф. Марковская (1976, 1978) показала, что накопление хлорофиллов в двухлетней хвое сосны имеет два максимума — в июне и в конце июля, а в начале июля их содержание снижается. Автор связывает наблюдаемые изменения с перераспределением пластических веществ по органам дерева: в конце июня — начале июля идет энергичное накопление зеленых пигментов в хвое текущего года, в зеленых тканях генеративных органов и в тканях стеблей при снижении уровня пигментов в хвое прошлого года. Минимум в содержании пигментов отмечается в зимний период (binder, 1972; Новицкая, 1971; Ottander, 1995; Adams, Demmig-Adams, 1994; Garcia-Plazaola et aL, 1999), причем значительное снижение происходит уже осенью и уровень содержания пигментов остается практически неизменным в течение холодного периода. Предполагается, что зимнее снижение пигмеїггов скорее всего не связано с действием мороза, а контролируется длиной фотопериода (Heide, 1978; Vogg et aL, 1998). Выращивание растений в условиях длинного дня в этот период привело к увеличению содержания пигментов. Возможность синтеза пигментов в зимний период показана Ю. Е. Новицкой (1978) в опытах с затенением. Увеличение хлорофилла в этих условиях может быть связано с его превращением из хлорофиллида или это может быть результатом синтеза пигментов de novo в зимний период, а также с превращением хлорофилла а в хлорофилл в. Аккумуляция хлорофилла начинается уже в марте, но полностью завершается только к июню (Ottander et aL, 1995). При этом важно подчеркнуть, что в летний и зимний периоды года хлорофилл а сильно различается по максимуму поглощения (Новицкая, 1978), что может быть обусловлено различной степенью агрегации молекул пигмента и свидетельствует об изменении качественного состояния хлорофилла а в зимний период.
Обнаружены сезонные различия и в составе каротиноидов. Так, зимой отмечается увеличение содержания лютеина и дезэпоксиксантофиллов почти в два раза (Adams, Demmig-Adams, 1994; Ottander, 1995; Garcia-Plazaola et aL, 1999). Количество а-каротина уменьшается примерно на 50%, что объясняется усиленным синтезом из него лютеина в течение зимы (Adams, Demmig-Adams, 1994). Неоксантин и Р-каротин, предшественник зеаксантина, изменяются менее значительно в течение всех сезонов, уменьшаясь до 20% зимой (Ottander et aL, 1995), или увеличиваются постепенно с середины лета до зимы, достигая максимума в январе (Garcia-Plazaola et aL, 1999). Отношение эпокси-ксантофиллов к деэпоксиксантофиллам значительно снижается, начиная с октября, что отражает превращение виолаксантина в зеаксантин в течение осени и ранней зимы.
Адаптация хвойных растений к условиям стресса в зимний период. Известно, что фотосинтетическая способность хвойных растений сильно снижена в течение холодного периода (Oquist, 1983; Strand, Oquist, 1985; Oquist, Ogren, 1985; Groom, 1991; Ottander et aL, 1995; Gilmore, BaU, 2000; Oquist, Huner, 2003). Это в основном приписывается фотоингибированию при низких температурах (Oquist, Strand, 1986; Oquist, Huner, 1991; Huner et aL, 1993; Gilmore, Ball, 2000), и, возможно, в зимних условиях именно фотопериод играет важную роль в адаптивном снижении фотохимической активности (Vogg et aL, 1998).
Механизмы, позволяющие хвойным растениям в осенний период подготовиться к суровым условиям зимы, связаны со структурными и функциональными изменениями фотосинтетического аппарата, клеток и тканей в целом. Защитные механизмы поддерживают целостность клетки, но необязательно обеспечивают прохождение биохимических процессов в морозные периоды. И. И. Туманов (1979) выделяет 2 фазы закаливания древесных растеїшй (в том числе и хвойных). Сосна резко увеличивает морозостойкость еще осенью. Медленнее идет подготовка к зиме у ели. Переход в период покоя у хвойных растений происходит в конце лета и сопровождается смещением баланса гормонов. Во время первой фазы закаливания низкими положительными температурами (до 0 С) происходит прекращение роста, накопление защитных веществ (сахара, растворимые белки и другие органические вещества), увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот в мембранах, снижение точки замерзания цитоплазмы, уменьшение внутриклеточной воды, изменения в структуре хлоропласта и др. Во время второй фазы закаливания, на фоне понижения температуры до —10, -20 С и ниже происходит закаливание отрицательными температурами. На этом этапе в межклетниках происходит образование льда и включаются механизмы защиты от обезвоживания. При быстром и глубоком охлаждении может происходить витрификация воды, предотвращающая кристаллизацию воды и возникновение внутриклеточного льда. Способность витрифицироваться усиливается после первой фазы закаливания, резко возрастает после 2-й фазы и зависит от структурных изменений в протопласте. Вторая фаза обеспечивает своевременный отток в межклетники почти всей воды, и лед сначала образуется в них. При понижении температуры вследствие снижения водопроницаемости мембраны условия для оттока воды из клетки могут ухудшаться, что приводит к переохлаждению протопласта. Вследствие оттока воды паренхимные клетки сжимаются, а клеточные мембраны подвергаются осмотическому стрессу. Ранее считалось, что клеточные мембраны в первую очередь повреждаются морозом (Heber, Santarius, 1964). В настоящее время выявлено, что плазматические мембраны и тонопласт — наиболее чувствительные к замораживанию компоненты клеток (Ziegler, Kandler, 1980; Leborghe et al., 1992). В течение зимы хлоропласта и другие органеллы агрегируются по углам клетки. Ультраструктурные изменения клеток пареігхимьі включают увеличение тяжей и цистерн гладкого эндоплазматического ретикулума, митохондрии содержат менее развитые кристы, в хлоропластах более развита строма и меньше число гран и ламелл (Туманов, 1979). Надо отметить, что результаты, касающиеся организации тилакоидных мембран в зимний период, достаточно противоречивы. Для сосны и ели обнаружена зимняя дезорганизация тилакоидных мембран, сопряженная с уменьшением размеров, стромальных и гранальных тилакоидов и увеличением количества осмофильных глобул (Senser et aL, 1975; Martin, 1979). Увеличение количества липидов и ненасыщешпых жирных кислот приводит к повышению текучести мембран (Oquist, 1982; Senser, Beck, 1982). С. Соиккели (SoikkeU, 1980), однако, сообщает, что оболочки хлоропластов, ламеллы гран и стромы остаются интактными в течение зимы.
Фотосинтетический аппарат растений в условиях антропогенного стресса
Эффект вредного воздействия промышленных выбросов на хвойные растения особенно сильно проявляется в районах действия промышленных предприятий. Два рода - Picea и Pinus - весьма чувствительны к загрязнению (Кайбияйнен и др., 1994, 1995; Ярмишко, 1997). Хвоя вечнозеленых растений - самый повреждаемый загрязнением орган. Рост и развитие хвои во многом определяются внешними условиями (Правдин, 1964; Кищенко, 1987; Isik, 1990). Эффект загрязнения визуально может вызывать изменение цвета, размеров хвои, сокращение продолжительности ее жизни. Известно, что загрязнение воздуха отрицательно влияет на размеры хвои из-за торможения стадии растяжения клеток (Stern et al., 1984). Еще более четко прослеживается влияние загрязнения на показатели фитомассы хвои (Ярмишко, 1997). При этом под воздействием поллютантов нарушаются закономерные изменения этих показателей в зависимости от года жизни хвои. Так, в районе сильного загрязнения средняя длина и масса хвои в верхней части кроны ничем практически не отличаются от этих характеристик в нижней трети кроны (Ярмишко, 1997), тогда как в фоновых условиях эти показатели уменьшаются к основанию кроны.
Воздействие на растение токсиканта - биохимическое явление, затрагивающее в первую очередь метаболические и физиологические процессы и разрушающее ультрамикроскопические структуры листа (Николаевский, 1979). Низкие концентрации сернистого газа усиливают устьичную проводимость, благодаря деструкции примыкающих к устьицам эпидермальньгх клеток (Загрязнение воздуха и жизнь растений, 1988), но степень повреждения хвои зависит от количества и плотности кутикулы вокруг устьиц (Focke, 1990). Ткани, а также органеллы клетки обладают различной чувствительностью к действию загрязнения. Так, клетки мезофилла наиболее уязвимы в отношении действия SO2, а из клеточных органелл — хлоропласты (цит. по: Барахтенова, Николаевский, 1988), у которых изменяются не только размеры (Гетко, 1989), но и ультраструктура. В хвое сосны обыкновенной были выявлены следующие типы повреждений (SoikkeU, 1981): 1) редукция тилакоидов гран; 2) просветление пластоглобул и появление липидоподобного биоматериала в цитоплазме; 3) разбухание и скручивание тилакоидов. Сообщается о расщеплении мембран тилакоидов под воздействием сернистого газа (Барахтенова, Николаевский, 1988).
Изменения в фотосинтетическом аппарате под воздействием атмосферного загрязнения определяются высокой реакционной способностью хлорофилл-белковых комплексов и переносчиков электрон-транспортной цепи, а также лабильностью мембранных структур хлоропластов и выражаются в трансформации биохимических процессов и пигментного аппарата. Хроническое загрязнение по-разному влияет на содержание и соотношение пигментов в ассимиляционных органах древесных растений. Эти изменения могут выражаться в увеличении количества пигментов (Гетко, 1989; Saarinen, 1993; Лазарева, Габукова, 1990), что может быть связано с накоплением продуктов окисления углеводов — органических кислот цикла Кребса, продуктов гидролиза белков (глицин, пролин), необходимых для синтеза этих пигментов. Под воздействием высокой концентрации поллютантов происходит снижение содержания хлорофиллов айв (Гетко, 1989; Lichtenthaler, Rinderle, 1989; Барахтенова, Николаевский, 1988; Saarinen, 1993; Кирпичникова и др., 1995), причем трехлетняя хвоя повреждается в большей степени, чем двухлетняя. Происходит повышение отношения Хл а к Хл в, что указывает на преимущественное выцветание светособирающего комплекса по сравнению с хлорофилл-белковым комплексом РЦ (Кривошеева и др., 1991). Надо отметить, что пигментный аппарат сосны менее чувствителен к загрязнению по сравнению с елью (Кирпичникова и др., 1995).
Изучение антиоксидантных и фотозащитных систем Pinus ponderosa (Tausz et al, 1999, 2001) в условиях повышенного содержания озона выявило в растениях снижение содержания хлорофилла, увеличение содержания каротиноидов по отношению к содержанию хлорофиллов, увеличение дезэпоксидированного пула каротиноидов, что, возможно, связано с включением таких антиоксидантных систем, как виолаксантиновый цикл.
Под воздействием загрязнения снижается фотосинтетическая активность хвойных. Была высказана гипотеза, по которой поллютанты влияют двумя путями: непосредственно, нарушая процесс фотосинтеза, или косвенно, путем выщелачивания элементов питания (Makela et al., 1981). В зависимости от дозы и природы токсиканта отличается и их действие на фотохимическую активность хлоропластов (Барахтенова, Николаевский, 1983). Сернистый ангидрид обладает специфичностью действия на фотосинтетический аппарат (Барахтенова, Николаевский, 1988; Somersalo, 1993). Изучение ингибирующего действия этого поллютанта проводилось многими исследователями (Hallgren, Gezelius, 1982; Winner et al., 1988; Кайбияйнен и др., 1994; Кособрюхов, Мудрик, 1997). Специфичность действия заключается в трехфазном изменении интенсивности фотосинтеза (Николаевская, 1992; Кособрюхов, Мудрик, 1997). В течение первой фазы происходит слабое подавление в результате ингибирования реакции карбоксилирования, катализируемой карбоксилазой. В следующую фазу происходит активация, связанная с эффектом раздражения за счет изменения тонкой структуры и функции мембран хлоропластов путем регуляции протонного градиента, активацией фосфорилирования и работы электрон - транспорной цепи. При действии SO2 происходит изменение соотношения нециклического и циклического путей транспорта электронов и синтеза АТФ, возрастание роли циклического фотофосфорилирования и, за счет этого, энергообеспечение ассимилирующей клетки (Барахтенова, Николаевский, 1988). В третью фазу происходит длительное и устойчивое подавление фотосинтеза, что связано с образованием химически активных сернистой и гидросернистой кислот, которые вызывают значительное подкисление стромы хлоропластов. Однако скорость прохождения отдельных фаз, интенсивность активации и подавления зависят от концентрации углекислого газа в воздухе (Кособрюхов, Мудрик, 1997). Использование в качестве показателя скорости нециклического транспорта электронов реакции Хилла показало ее зависимость от концентрации поллютанта. Действие низких доз проявляется в активации этой реакции (Барахтенова, 1993), повышение концентрации снижает степень активации, а в дальнейшем происходит подавление фотосинтетического нециклического транспорта электронов. SO2 инактивирует ферменты цикла Кальвина (Hallegren, Gezelius, 1982). С помощью флуоресцентного анализа было показано (Shimazaki, 1984), что сернистый газ ингибирует систему фотосинтетического расщепления воды.
Определение интенсивности фотосинтеза по выделению кислорода
Как известно, одним из следствий загрязнения является уменьшение рН клеточного сока, а пигменты растений с более кислым клеточным соком менее устойчивы к загрязнению и, следовательно, быстро деградируют. В нашем эксперименте не обнаружено этого эффекта на скорость распада пигментов и их содержание в хвое при длительном хранении, что может быть связано с особенностями метаболизма хвойных растений. Таким образом, данное исследование показало возможность использования обоих способов хранения растительного материала в зависимости от условий эксперимента. Спектрофотометрическое определение. Спектральный анализ. Снятие спектров поглощения хлорофиллов а и в, а также отдельных каротиноидов (зеаксантин, неоксантин, виолаксантин, лютеин + антераксантин, каротин) проводилось на регистрирующем спектрофотометре UV-VIS "Specord" с целью проверки совпадения максимумов поглощения пигментов мутантных линий Festuca pratensis Huds. с описанными в литературе. Спектрофотометрическое количественное определение проводилось в 80% ацетоне на КФК-3 и СФ-10, согласно Д. Арнону (1949). Поправочные коэффициенты для формул Арнона приведены в работе Р. Г. Порра с соавторами (Рогга et al., 1989). Расчетные формулы на 100% ацетон приведены у А. А. Шлыка (1968). Для более точного определения суммы каротиноидов были учтены сдвиги максимума поглощения хлорофилла а, как описано Т. Г. Масловой с соавторами (1986).
Метод тонкослойной хроматографии. Этот метод позволяет разделить все имеющиеся каротиноиды в ацетоновой вытяжке (Хагер, 1957 в модификации Корнюшенко, Сапожникова, 1969) по удельным коэффициентам поглощения пигментов и оптической плотности, измеренной при максимуме поглощения. Разделение основано на разном сродстве пигментов к адсорбентам (углекислый кальций, окись магния, гидрат окиси кальция) и смеси растворителей (высокооктановый бензин, хлороформ, ацетон). Для омыления хлорофиллов используется гидрооксид калия. Интенсивность выделения кислорода определялась при помощи лист-дискового электрода (Hansatech, модель LD 2, Kings Lynn, Norfolk, UK), согласно С. Сомерсало и Г. X. Краузе (Somersalo, Krause, 1989). Измерения проводили при 22 С с начальной газовой смесью 5% СОг : 21% О2: 90% N2, полученной при помощи 1М карбонат-дикарбонатного буфера (Oquist et al, 1993). Свет обеспечивался фотодиодами (Hansatech; Xmax 660 нм). Каждому измерению предшествовала преадаптация в темноте. Продолжительность одного измерения — 7 - 8 минут. Количественные значения определялись по наклону кривой скорости выделения 02. Флуоресценция хлорофилла часто используется как очень чувствительный метод изучения фотосинтетических реакций (Papageorgiou, 1975; Lichtenthaler, 1988; Blaich, 1988). Применение портативного флуориметра дает возможность быстрой оценки изменений активности фотосинтетического аппарата in vivo, когда растение подвергается стрессовому воздействию, и в природных, и в лабораторных условиях (Oquist, 1988; Somersalo, 1993). Измерение кинетики флуоресценции при помощи Fluorescence Monitoring System (FMS 2, Hansatech, King s Lynn, Norfolk, UK) проводилось в лабораторных условиях при 22 С, согласно У. Шрайбер (Shreiber et al., 1986).
Была применена стандартная процедура измерения переменной флуоресценции и расчета параметров, характеризующих тушение (Somersalo, Krause, 1990а). Растения адаптировались в течение 10 минут в темноте, затем определялось отношение переменной флуоресценции к максимальной (Fv/Fm), которое отражает фотохимическую активность ФС II (или квантовую эффективность транспорта электронов в ФС II). Нефотохимическое тушение флуоресценции (qN) определялось по снижению вариабельной флуоресценции (Fvs), вызванному насыщающими пульсами. qE — энергозависимая и обратимая после 10 минут темноты часть qN. Фотоингибированное тушение (ql) определяется как необратимая часть (Horton, Hague, 1988) и является мерой фотоингибирования ФС И. Для измерения спектров испускания при 77 К тилакоиды изолировались, измерение проводилось в буфере, содержащем ЮтМ Tris-HClpH 8.0, 0,4М сахарозы, lOmMNaCl, 20 тМ EDTA. Суспензия замораживалась в жидком азоте. Спектры испускания при 77 К измерялись при помощи диодного спектрофотометра (S2000, Ocean Optics Ltd, Dunedin, Florida, USA), содержащего 2048 диодов, расположенных за монохроматором. Разрешающая способность - 5 нм. Возбуждение проводилось 250 W проектором (Royal AF, Zeiss Ikon, Germany) через 600 нм фильтр (LS-600-S, Corion, USA) и f73.4 монохроматор (Applied Photophysics, Surrey, U. K. ). Форма эмиссионых спектров температурозависима (Sauer, Debreczeny, 1996). При комнатной температуре выход флуоресценции ФС I очень низок, но понижение температуры до 77 К увеличивает флуоресценцию при 715 — 735 нм. Нахождение пика зависит от вида: для высших растений это 735 нм. Понижение температуры сужает пики (Моегпег, 1988). ФС II имеет следующие пики: 685 нм — пик испускаемый СР 43 Хл а- белковым комплексом, 695 нм — СР 47 Хл а- белковым комплексом. Интенсивность падающего света на образец варьировалась от 2 мкмоль м 2,с" при 400 нм до 9.3 мкмоль-м -с"1 при 560 нм. Эмиссия флуоресценции записывалась от 600 до 800 нм, используя волны возбуждения от 380 до 580 нм с шагом 5 нм. Каждый спектр записывался с оптимальным временем интеграции от 2 до 20 с и спектры затем корректировались делением интенсивности на время интеграции. Интенсивность источника света измерялась при помощи Lambda LI-185 А. Обработка данных и графики сделаны в Matlab версии 5.3. (Mathworks, USA). Изолирование тилакоидов из листьев Festuca pratensis Huds. проводили по методу Г. X. Краузе (Krause et aL, 1985). Для этого растительный материал гомогенезируется в среде A (Jensen, Bassham, 1966) с добавлением бычьего альбумина, цистеина и аскорбата натрия. Концентрация хлорофилла оценивалась спектрофотометрическим методом, с тем, чтобы финальная концентрация была приблизительно 25 мг/мл. Электрон-транспортная активность изолированных тилакоидов оценивалась по выделению кислорода при 22 С с помощью электрода (см. выше). Плексиглазовая кювета с суспензией освещалась источником света. Электронный транспорт фотосистемы II от воды до бензохинона измерялся в присутствии хлорида аммония и грамицидина, согласно Ратхнам и Эдварде (Rathnam и Edwards, 1976, цит. по: С. Сомерсало, Г.Х. Краузе (Somersalo, Krause, 1990b). Активность фотосистемы I, включая пластоцианин измерялась при добавлении дихлорфенолиндофенола (DCPIP), дихлорфенолдиметилуронила (DCMU), метилвиологена, хлорида аммония, аскорбата натрия и азида натрия (Photosynthesis and production in a changing environment. A field and laboratory manual, 1993).
Фото синтетический аппарат злаковых растений под воздействием различных неблагоприятных факторов
У семидневных проростков пшеницы, подвергнутых холодовому закаливанию (при освещенности 100 мкмоль-м -с ) в течение пяти дней, были изучены параметры флуоресценции. После 5 дней воздействия растения были перенесены в условия +25 С на 3 дня.
При воздействии низкими положительными температурами уровень начальной (Fo) и максимальной флуоресценции (Fm), активность ФС II (Fv/Fm), так же как и значение коэффициента нефотохимического тушения (qN), не изменялись.
Скорость выделения кислорода в условиях холодового закаливания оставалась на том же уровне, что и до начала эксперимента (до опыта 21,38±4,14 ммольСЬ /мин г.сыр.массы; после 5 дней воздействия низкой положительной температурой -21,75±4,51 ммоль 02/мин г.сыр.массы; после восстановления 18,11±2,95 ммоль С 2/мин г.сыр.массы), что согласуется с литературными данными, полученными на злаках (Huner, 1985; Oquist, 1993; PraMachandra et al., 2003). Эти данные свидетельствуют об околооптимальном функционировании фотосинтетического аппарата в условиях опыта. Увеличение значения фотохимического тушеїшя к концу опыта и в последействии сопровождается некоторым запаздыванием в увеличении интенсивности фотосинтеза (рис. 18). Увеличение фотохимического тушения, когда возбужденная энергия идет на фотохимические реакции, свидетельствует об успешной адаптации пшеницы к закаливанию холодом.
Возможно, условия холодового закаливания были недостаточно экстремальны для развития защитного механизма, связанного с превращением РІД в гасители энергии, как это описано во множестве работ (Krause et al., 1990; Somersalo, Krause, 1990; Hurry, Huner,1992; Muller et al., 2003; PrafuEachnadra et al., 2003; Ivanov et al., 2003). Достигнутое усиление утилизации поглощенной энергии фотохимическим путем явилось достаточным в условиях проведенного холодового закаливания, и поэтому дополнительные механизмы (рассеивание энергии реакционными центрами или зеаксантинзависимое тушение) не подключались. Это подтверждает, что пшеница (ТгШсит aestivum L.) имеет очень высокий адаптационный потенциал при действии низкой положительной температуры.
В условиях теплового закаливания Fo у ТгШсит aestivum L. оставалось в пределах статистической ошибки (219+24 — начальный уровень, 225±11 - 48 часов) (рис. 19), тогда как максимальная флуоресценция имела тенденцию к снижению на 18% (с 1193±190 (начальный уровень) до 975+80 через 48 часов). Восстановление этого показателя происходило почти полностью (на 90% до 1073±47). Фотохимическая активность ФС II (Fv/Fm) снижалась незначительно с 0,815±0,014 до 0,778±0,015, причем это снижение шло постепенно в течение 48 часов. Интенсивность фотосинтеза у пшеницы, определяемая по выделению ( , была снижена на 44% (21,38±4,16- исходный уровень и 11,99±2,62 ммоль Ог/мин г.сьф.массьі-через 48 часов). В ходе восстановления этот показатель увеличился на 25% и достиг значения 16,33±4,06 ммоль Ог/мин г.сыр.массы.
Коэффициент фотохимического тушения у Triticum aestivum L. (рис. 19) не изменялся. Фотоингибиторное тушение достигало своего максимального значения уже через 24 часа воздействия высокой температуры, оставалось на том же уровне до 48 часов и в ходе восстановления несколько снижалось.
Таким образом, значительного фотоингибирования обнаружено не было, хотя эффект высокой температуры проявлялся в некотором снижении выделения кислорода, снижении электронного транспорта ФС II у пшеницы, что согласуется с литературными данными (Oquist, 1987; Biswal, 1997; Dubey, 1997; Jamasaki et al., 2003; Monneveux et al., 2003; Salvucci et al., 2004). Считается, что это происходит вследствие денатурации белков мембран и отсоединения антенных комплексов (Oquist, 1987; Pastenes, Horton, 1996, цит. по: Rokka et al., 2000). Если бы это имело место в нашем опыте, следовало бы ожидать увеличения начальной флуоресценции из антенных комплексов, что не было обнаружено. Небольшое фотоингибирование связано скорее со снижением активности транспорта электронов через фотосистему II, чем с гашением в антенных комплексах. Тем более что значимого увеличения нефотохимического тушения, свидетельствующего о рассеивании энергии в виде тепла с помощью зеаксантина, тоже не было обнаружено. Таким образом, механизм гашения может быть связан с превращением фотохимически активных реакционных центров ФС II в неактивные центры гашения, рассеивающие энергию как тепло (Krause et al., 1990; Somersalo, Krause, 1990; Hurry, Huner, 1992; Mailer et al., 2003). Эти центры не способны к разделению заряда, но способны к улавливанию энергии и ее нефотохимическому рассеиванию. Возможно, дополнительный эффект оказывал перенос энергии с ФС II на ФС I (spillover).
