Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 10
1.1 Перекисный гомеостаз растительной клетки 10
1.2 Представление о стрессе, как о неспецифической ответной реакции растительного организма на воздействие факторов окружающей среды 31
2. Материалы и методы исследования 40
2.1 Постановка опыта 40
2.2 Методы анализа 40
2.2.1 Приготовление суспензии хлоропластов 40
2.2.2 Получение хлоропластной фракции ферментов 41
2.2.3 Определение активности СОД 41
2.2.4 Определение активности аскорбатпероксидазы 42
2.2.5 Определение активности глутатионредуктазы 42
2.2.6 Определение содержания глутатиона 43
2.2.7. Определение содержания аскорбиновой кислоты 43
2.2.8. Определение генерации супероксидного анион-радикала 44
2.2.9. Определение содержания диеновых копъюгатов 44
2.2.10. Определение содержания малонового диальдегида 45
2.2.11. Определение белка 46
2.2.12. Определение липидов 46
2.2.13. Статистическая обработка результатов 46
3. Результаты и их обсуждение 47
3.1 Последействие малых доз ионизирующей радиации в хлоропластах растений гороха 47
3.2 Модулирующее действие предварительного облучения растений гороха ионизирующей радиацией на перекисныи гомеостаз хлоропластов при гипертермии 61
3.3 Воздействие низкочастотного переменного магнитного поля на перекисныи гомеостаз хлоропластов растений гороха 71
Заключение 81
Выводы 82
Список литературы 83
- Представление о стрессе, как о неспецифической ответной реакции растительного организма на воздействие факторов окружающей среды
- Получение хлоропластной фракции ферментов
- Определение генерации супероксидного анион-радикала
- Модулирующее действие предварительного облучения растений гороха ионизирующей радиацией на перекисныи гомеостаз хлоропластов при гипертермии
Введение к работе
Актуальность проблемы.
До настоящего времени вопрос о существовании специфических мишеней малых доз ионизирующей радиации и низкоинтенсивных магнитных полей остается спорным. Многочисленные исследования последних десятилетий показали, что независимо от природы воздействия, ответ растения на него развивается по некоторой общей схеме, что позволяет говорить о существовании неспецифической стрессовой реакции на воздействия извне (Удовенко, 1977; Пахомова, 1995). Таким универсальным звеном в реакции растительного организма на действие самых разнообразных факторов может быть некоторое стереотипное изменение внутренней среды клетки, на роль которого многие исследователи выдвигают окислительный стресс (Барабой, 1991; Курганова и др., 1999). Однако до настоящего времени ведутся споры о степени универсальности окислительного стресса, как ответной реакции на любое воздействие извне и наличии специфических механизмов для его реализации, зависящих от природы действующего фактора.
В многочисленных работах показано усиление генерации активных форм кислорода (АФК) в ответ на разнообразные внешние стимулы, но их роль в развитии стресс-реакции до конца не выяснена и является широко обсуждаемым вопросом. (Минибаева и др., 1997; Dat et al., 2000; Калашников и др., 1999; Chen, Li, 2001). С одной стороны повышение продукции активированного кислорода приводит к интенсификации окислительной модификации биомолекул и, как следствие, к изменению перекисного гомеостаза клетки (Владимиров, Арчаков, 1972; Бурлакова, Храпова, 1985; Мерзляк, 1989). В то же время получены сведения о сигнальной роли АФК в регуляции многих физиологических процессов (Кулинский, Колеснеченко, 1993; Тарчевский, 2002). В растительной клетке генерация значительной части активных форм кислорода происходит в результате функционирования фотосинтетической электрон-транспортной цепи, в связи с чем в
современной физиологии растений многими исследователями выдвигается гипотеза о сенсорной функции хлоропластов (Allen, 1993; Foyer et. al., 1997).
Большое внимание в последнее время уделяется механизмам ответа живых систем на слабые внешние воздействия (Веселова, Веселовский, Чернавский, 1993; Бурлакова и др., 1999; Эйдус, 2001). Предполагается, что действие факторов, по силе не выходящих за зону толерантности организмов, формируется не вследствие прямого повреждающего эффекта стрессора, а в результате разбалансирования процессов повреждения и восстановления клеточных структур. В связи с этим исследование слабых воздействий может способствовать выявлению механизмов тонкой регулировки внутренних процессов, происходящих при внешних возмущениях.
Учитывая вышесказанное, представляется актуальным исследование возможности участия системы перекисного гомеостатирования в ответе растительного организма на воздействие малых доз ионизирующей радиации и низкоинтенсивного переменного магнитного поля, что в перспективе может способствовать раскрытию общебиологических механизмов рецепции данных физических факторов; стать основой для разработок в области повышения адаптивных возможностей растений к этим воздействиям в условиях возрастающего техногенного загрязнения окружающей среды.
Цель и задачи исследования.
Цель работы состояла в определении динамики изменения перекисного гомеостаза хлоропластов гороха при воздействии малых доз ионизирующей радиации и низкочастотного переменного магнитного поля, выяснении возможной роли этих изменений в ответе хлоропластов гороха на воздействие данных физических факторов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Определить содержание супероксидного анион-радикала,
продуктов перекисного окисления липидов, основных низкомолекулярных антиоксидантов и активность ферментов антиоксидантной защиты в
7 хлоропластах, выделенных из растений гороха, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации в малых дозах и низкоинтенсивного переменного магнитного поля.
Провести сопоставление эффектов на уровне прооксидантно-антиоксидантнои системы хлоропластов при воздействии разных доз ионизирующей радиации и разных временных экспозиций низкоинтенсивного переменного магнитного поля.
Оценить специфичность изменений перекисного гомеостаза хлоропластов растений гороха в результате исследуемых воздействий.
Определить возможность участия супероксидного анион-радикала в ответе прооксидантно-антиоксидантнои системы хлоропластов на слабое воздействие физических факторов.
Научная новизна.
Получены новые данные, свидетельствующие об усилении продукции супероксидного анион-радикала хлоропластами в течение длительной экспозиции после облучения растений ионизирующей радиацией в малых дозах и в результате воздействия низкочастотным магнитным полем, показана возможность участия супероксидного анион-радикала в развитии защитных реакций к воздействию данных физических факторов.
Исследовано последействие ионизирующей радиации и показан парадоксальный ответ системы перекисного гомеостатирования хлоропластов на облучение в малых дозах. Получены два типа эффектов малых доз радиации на интервале до 1 Гр. Показано, что доза 0,1 Гр вызывает гиперчувствительность к последующей гипертермии облученных растений, доза 1 Гр обусловливает адаптивный ответ растений на последующее воздействие повышенной температуры.
Впервые продемонстрировано развитие окислительного стресса, как неспецифической реакции на воздействие магнитного поля напряженностью 3,5 мТл и частотой 100 Гц на растения.
Теоретическая и практическая значимость.
Полученные в представленной работе эффекты малых доз радиации и переменного магнитного поля в растительном организме могут иметь большое значение для раскрытия общебиологических механизмов рецепции слабых физических факторов.
Проведенные исследования демонстрируют участие генерируемого хлоропластами супероксидного анион-радикала в формировании ответа системы поддержания перекисного гомеостаза растений на воздействие ионизирующей радиации в малых дозах и низкоинтенсивного переменного магнитного поля. Эти данные открывают перспективы для разработки новых способов повышения адаптивных возможностей растений к стрессирующим воздействиям, а также могут быть полезны для рассмотрения использования растительного организма в биоиндикации и экологическом мониторинге техногенного загрязнения окружающей среды.
Апробация работы.
Основные результаты работы доложены на конференции «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003), 8-й, 9-й, 10-й и 11-й Нижегородских сессиях молодых учёных (Н.Новгород, 2004, 2005, 2006, 2007), XVII международной конференции «Актуальные проблемы естествознания» (Н.Новгород, 2004), 8-й, 9-й и 10-й международных Пущинских школах-конференциях молодых учёных «Биология - наука 21го века» (Пущино, 2004, 2005, 2006), на II Всероссийской молодежной научной конференции по фундаментальным проблемам радиохимии и атомной энергетике (Н.Новгород, 2004), The IX European Young Investigator Symposium "SymBioSE-2005" (Helsinki, 2005), The I(IX) International Conference of Young Botanists in Saint-Petersburg (Saint-Petersburg, 2006), The 2nd international symposium "Signaling systems of plant cells: role in adaptation and immunity" (Kazan, 2006), The 35th Annual Meeting of the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for
9 Radiation Biology "European Radiation Research - 2006" (Kyiv, 2006), на Годичном собрании общества физиологов растений (Ростов-на-Дону, 2006), Международной конференции по фундаментальным наукам среди студентов и аспирантов «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), II Международной конференции «Человек и электромагнитные поля» (Саров, 2007).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 16 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация в объеме 105 листов состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объекта исследования, 3 разделов, где представлены результаты исследований и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы из 228 источников. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками.
Представление о стрессе, как о неспецифической ответной реакции растительного организма на воздействие факторов окружающей среды
Стресс (общий синдром адаптации) представляет собой неспецифический компонент физиологических и патологических реакций живых систем, состояние напряжения как таковое, степень мобилизации системы, органа, клетки, даже клеточных органелл при воздействии на живой организм неблагоприятных факторов (Селье, 1972). Автор обнаружил, что при действии на организм различных раздражителей наблюдаются не только специфические реакции, но и неспецифические, которые были определены как адаптивные для целостного организма, направленные на сохранение постоянства состава внутренней среды или гомеостаза, и названы общим или генерализованным адаптационным синдромом. Для всех живых организмов способность к приспособлению - одна из важнейших черт жизни. Адаптация всегда является результатом специальной концентрации усилий (stress (англ.) - напряжение).
В ответе организма на действие экстремального фактора Г. Селье (1972) выделил три четких стадии неспецифического синдрома.
Начинается стресс стадией тревоги, во время которой мобилизуются защитные силы организма, но резистентность к стрессору падает ниже нормы. Причем, если реакция оказывается слишком сильной, то организм погибает уже на этой стадии. В ходе длительного нелетального воздействия наступает фаза адаптации, или резистентности - сопротивляемость организма возрастает, и, наконец, если действие стрессорного агента продолжается и достигнутая адаптация оказывается недостаточной, то происходит истощение живой системы. Симптомы этой фазы похожи на те, что имеют место на стадии тревоги: сопротивляемость падает и организм умирает. При этом результаты воздействия могут не проявляться, пока стимул все еще присутствует в организме, но тем не менее стрессор будет иметь последействие.
Изначально стрессовая реакция исследовалась на животных. Однако в настоящее время убедительно показано, что у большинства растений под действием самых различных неблагоприятных факторов, как правило, развивается цепочка сходных неспецифических адаптационных реакций, совокупность которых, с целью подчеркнуть наличие специфических черт, получило название фитостресса (Пахомова, 1995; Чернов, 1996).
Факторы, способные вызвать стресс у растений, можно подразделить на три основные группы: физические (недостаточные или избыточные влажность, освещенность, температура, механические воздействия, радиоактивное излучение, аноксия), химические (соли, газы, ксенобиотики, промышленные отходы и биологические (поражения возбудителями болезней или вредителями, отрицательное влияние животных, голодание) (Пахомова, 1995). Чаще всего фитостресс проходит через три фазы, однако в современной физиологии растений существует множество терминов для обозначения одних и тех же стадий неспецифического адаптационного синдрома.
Процессы, совершающиеся в клетке на стадиях тревоги и адаптации прямо противоположны: на стадии тревоги преобладают реакции распада различных соединений, а на стадии резистентности - процессы синтеза (Блехман, Шаламова, 1992; Пахомова, Чернов, 1996). Начальную стадию называют стадией повреждения (Удовенко, 1977), реакцией защитного торможения метаболизма, первичной стрессовой реакцией, фазой физиологической депрессии (Пахомова, 1995), стадией активного состояния (Гордон, 1992), индуктивной фазой (Пахомова, Чернов, 1996).
Одной из ранних ответных реакций организма на действие стрессовых факторов является изменение состава отдельных классов липидов, текучести мембран, повышение проницаемости мембран и выход из клетки различных веществ, развитие свободнорадикальных реакций, выход Са2+ в цитоплазму, деполяризация мембран и генерация потенциалов на мембране, нарушение окислительного фосфорилирования и снижение интенсивности фотосинтеза, увеличение синтеза этилена и АБК, снижение содержания ауксинов и гиббереллинов. В первую фазу стресс-реакции показано также усиление процессов биодеградации, направленных, в частности, на деполимеризацию макромолекул и, таким образом, на обеспечение необходимого для создавшихся условий пула низкомолекулярных соединений: моносахаридов амидов, аминокислот и полиаминов, карнозина, свободных жирных кислот и окисленных производных ненасыщенных жирных кислот, неорганического фосфата и продуктов деградации адениловых нуклеотидов и других соединений, которые выполняют определенные регуляторные и защитные функции (Удовенко, 1977; Браун, Моженок, 1987; Блехман, Шеламова, 1992; Колупаев, Трунова, 1992; Пахомова, 1995; Веселов, 2001; Тарчевский, 2000). Низкомолекулярные углеводы способны связывать свободные радикалы, предотвращая индуцируемые ими окислительные процессы, пролин выполняет функции осморегулятора, стабилизирует белки, полирибосомы, мембраны, защищает ферменты, регулирует рН цитоплазмы в условиях стресса, полиамины способны поддерживать нативную структуру нуклеиновых кислот, стабилизировать мембраны и перехватывать радикалы (Пахомова, Чернов, 1996; Jansen et al., 1998). И.А. Тарчевский (2001) говорит об энергетической, о корректирующей функции продуктов биодеградации, которые способны устранять биополимеры с «неправильной структурой» и участвовать в синтезе наиболее востребованных в условиях стресса биополимеров.
Стабилизация метаболизма при стрессе обеспечивается также благодаря индукции синтеза стрессовых белков, снижающих уровень опасных метаболитов. При этом под стресс-белками понимаются не только специализированные пептиды, подобные белкам теплового шока (БТШ), но и другие протеины (например, ферменты антиоксидантной защиты, сдерживающие липопероксидацию в мембранах), синтез которых активируется в экстремальных условиях (Веселов, 2001). Индукция белков стресса достигается в системе за счет отключения транскрипции генов белков нормы. Одновременно, посредством модификации универсального фактора репрессии, формируются механизмы, обеспечивающие автоматическое возвращение системы в режим нормы после прекращения стрессирующего воздействия. Появление стрессовых белков у растений отмечено при различных влияниях в условиях анабиоза, разобщении окислительного фосфорилирования, при осмотическом шоке, действии абсцизовой кислоты, пониженной и повышенной температурах. Во всех этих случаях синтезируются сходные белки, которые условно делят на две группы
Получение хлоропластной фракции ферментов
Определение проводили по методике С.Чевари с сотр.(1985). Принцип метода основан на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анион-радикалы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия восстановленного НАДН с феназинметасульфатом (ФМС). В результате этой реакции НСТ восстанавливается до гидразин тетразолия. В присутствии СОД процент восстановления НСТ уменьшается, что определяли спектрофотометрически. Реакционная смесь содержала 1,2 мл 0,15 М фосфатного буфера, рН 7,8; 0,1 мл 0,16 мМ ФМС; 0,3 мл 0,61 мМ НСТ; 0,3 мл супернатанта. Реакцию запускали добавлением 0,2 мл 1 мМ НАДН. Активность фермента рассчитывали по формулам: Ео где Т (%) - процент блокирования, Ео - изменение экстинкции 0-пробы (без суспензии) за 1 минуту, Епр - изменение экстинкции исследуемой пробы за 1 минуту. (100-Г%) С где А - удельная активность фермента, С - концентрация белка в пробе (мг/мл). Удельную активность СОД выражали в усл.ед. / мг белка за мин. Активность аскорбатпероксидазы определяли по методике Y. Nakano, К. Asada (1981). Метод основан на способности аскорбатпероксидазы увеличивать скорость реакции разложения Н202 при участии аскорбиновой кислоты. Реакционная смесь содержала 2,2 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7,0; 0,1 мл 0,1 мМ ЭДТА; 0,3 мл 10 мМ Н202. 0,3 мл 2,5 мМ аскорбиновой кислоты, которую добавляли непосредственно перед промером. Реакцию запускали добавлением 0,1 мл супернатанта и спектрофотометрировали при =290 нм. Расчет активности проводили по формуле: где АЕ29о - разность экстинкции пробы за 1 минуту, Е - коэффициент молярной экстинкции (2,8 мкМ см"1), С - концентрация белка в пробе, мг / мл; t- время, мин. Активность аскорбатпероксидазы выражали в мкмоль аскорбата / мг белка за мин. Активность глутатионредуктазы определяли по методу J.Iavata, U.Tanaka (1977). Принцип метода основан на уменьшении содержания НАДФН в результате восстановления окисленного глутатиона. Инкубационная смесь содержала 2мл 0,05 М К-фосфатного буфера (рН=8,0); 0,2 мл 1мМ ЭДТА; 0,2 мл исследуемого субстрата; 0,5 мл 7,5 мМ раствора окисленного глутатиона. Реакцию запускали 0,1 мл 6 мкМ НАДФН. где Д34о - разность экстинкции пробы за 1 минуту, Е - коэффициент молярной экстинкции (6,22 MIVT CM"1), С - концентрация белка в пробе, мг / мл; t- время, мин. В основе метода лежит реакция тиол-дисульфидного обмена.
В ходе реакции освобождается анион 2-нитро-5-тиобензоата, обладающий поглощением при 412 нм. Коэффициент молярной экстинкции 2-нитро-5-тиобензоата зависит от рН. При рН=8,0-9,0 Е412=14000 (Практикум по биохимии, 1989). Выделенные хлоропласты ресуспензировали в 1,5 мл ЮмМ фосфатном буфере (рН 10,0), содержащем 1мМ ЭДТА, приливали 1,5мл 20% сульфосалициловой кислоты и центрифугировали при 16тыс.об./мин 20 мин при охлаждении до 4С. Отбирали 0,5 мл полученного супернатанта, приливали 1 мл К-фосфатного буфера (рН 10,0) и добавляли 0,5 мл 20 мМ ДТНБ (реактив Эллмана) в ЮмМ к-фосфатном буфере (рН 8,0). Через 15 мин инкубирования спектрофотометрировали при А=412 нм. Для определения общего глутатиона перед добавлением ДТНБ супернатант инкубировали с цинковой пылью в течение 20 мин. В качестве стандарта для построения калибровочного графика использовали 5 мМ раствор GSH в ЮмМ фосфатном буфере (рН 10,0). Содержание глутатиона рассчитывали на общий белок и выражали в ммоль/мг белка. Аскорбиновая кислота восстанавливает феррицианид калия до ферроцианида. Ферроцианид калия в присутствии ионов 3-х валентного железа образует ферроцианид железа (берлинскую лазурь) (Практикум по биохимии, 1989). Осадок хлоропластов полученный при выделении из 4г листьев ресуспензировали в 9 мл буфера (0,1 Н НС1 и ОДМ цитрат натрия, рН=3,69). Центрифугировали при 16 тыс об/мин при охлаждении (4С) 20 мин. К 2 мл супернатанта приливали 0,1 мл 1% гексацианоферрита калия и 0,1 мл 2% фторида калия. Смесь встряхивали, приливали 0,2 мл 2% хлорида железа.
Раствор выдерживали 5 мин, спектрофотометрировали при 670 нм. Для построения калибровочного графика использовали серию разведений из 0,02% аскорбата, от 2 мкг/мл. Содержание аскорбиновой кислоты выражали в мкг/г листьев. Продукцию супероксидного анион-радикала определяли методом ЭПР с использованием спиновой ловушки тирона 4,5-дигидрокси-1,3-фенил-дисульфонат Na) (Минибаева, 2005). При взаимодействии с супероксидным анион-радикалом тирон, будучи сульфоновым катехолом, переходит в семихинонную форму, которая дает специфический ЭПР-спектр. К 1 мл хлоропластной суспензии приливали 1 мл 50 мМ раствора тирона в среде ресуспензирования, после инкубирования в течение 2-3 мин доводили рН до значения 9,0. Аликвота раствора помещалась в капилляр из стекла пирекс и снимался спектр на ЭПР спектрометре РЕ 1306 (Россия) со следующими параметрами: СВ-частота 9,46 ГГц, величина развертки магнитного поля 25 Гс, частота модуляции 100 кГц, амплитуда 1,4 Гс. Количественный анализ регистрируемых ЭПР-спектров проводился с учетом того, что амплитуда сигнала пропорциональны титру супероксидного анион-радикала.
Определение генерации супероксидного анион-радикала
Степень диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот определяли по методике И.Д. Стальной (1977). Для определения диеновых конъюгатов 0,5 мл суспензии растирали в 4,5 мл смеси гептан : изопропиловый спирт в соотношении 1:1 и центрифугировали 10 мин при 4 тыс. об/мин. К надосадочной жидкости добавляли 0,1 объема воды для разделения фаз. К 0,5 мл верхней гептановой фазы добавляли 2,5 мл этанола и спектрофотометрировали против контроля (гептан : спирт в соотношении 1 : 5). В ходе ПОЛ на стадии образования свободных радикалов в молекулах НЖК возникает система сопряженных двойных связей, что сопровождается появлением нового максимума в спектре поглощения при 232 нм. Расчет ДК производили по формуле:
Определение содержания МДА проводили с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) по методике И.Д.Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977). Метод основан на реакции МДА с ТБК при нагревании с образованием окрашенного триметинового комплекса с максимумом поглощения при 532 нм. К суспензии хлоропластов добавляли 1 мл 17%-ную ТХУ, образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 4000 об/мин. К 2 мл надосадочной жидкости добавляли 1 мл 0,8% водного раствора ТБК и нагревали на водяной бане 10 мин. После развития розовой окраски спектрофотометрировали против контроля при 532 нм. Расчеты вели по формуле: Малоновый диальдегид выражали в мкМоль МДА / мг липидов. Содержание белка в исследуемых пробах проводили согласно О. Н. Lowryetal.(1951). Содержание липидов проводили спектрофотометрически по реакции с фосфорно-ванилиновой смесью (Камышников, 2000). Обработка полученных результатов производилась методами параметрической статистики с использованием программного обеспечения Microsoft Excel for Windows. На рисунках представлены средние арифметические 3-6 независимых опытов, каждый из которых проводился в трехкратной биологической повторности, и их стандартные ошибки. Значимость различий оценивалась по критерию Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контролем и критерию Даннета (Лакин, 1968; Гланц, 1999). В настоящее время особое внимание уделяется механизмам ответа живых систем на слабые внешние воздействия, с целью выяснения закономерностей, физиологической роли и степени универсальности реакции организма на неповреждающие воздействия.
Предполагается, что выраженный физиологический эффект при действии факторов, по силе не выходящих за зону толерантности организмов, формируется не вследствие прямого повреждающего действия стрессора, а в результате разбалансирования процессов повреждения и восстановления клеточных структур. Это может способствовать выявлению механизмов тонкой регулировки внутренних процессов, происходящих при внешних возмущениях. В качестве одного из таких слабых воздействий в проводившихся экспериментах использовались ионизирующая радиация в малых дозах. В настоящее время происходит рост техногенного радиоактивного загрязнения среды в связи с миграцией радиоизотопов по пищевым цепям и почвенным горизонтам в результате выброса огромного количества радиоактивных материалов во время Чернобыльской аварии (Гродзинский, 1991; Давыдов, 1991; Жижина, 1999; Dolin, 2003). Не смотря на то, что растениям отводится основная роль переносчиков радионуклидов по пищевым цепям, работ по радиобиологии растений очень мало. Особенности действия некоторых изотопов на растительные организмы связаны с тем, что, являясь метаболическими аналогами некоторых микроэлементов, они активно поглощаются и накапливается растениями, встраиваются в мембраны и активные центры белков, где, даже в сверхмалых концентрациях, способны оказывать пролонгированное ионизирующее действие на компоненты клеточных структур (Ильенко, Криволуцкий, 1971; Смолянина и др., 2006). Однако из-за недостаточной изученности биологического действия низкоуровневого облучения еще не нашли однозначного ответа такие вопросы, как наличие порога дозы или природа явления гормезиса. Решение данных проблем имеет не только фундаментальное значение для радиационной биологии растительного организма, но может иметь и практический выход в результате определения растений, которые могут быть перспективны в биологических методах очистки зараженных радиацией территорий (Гродзинский, 1991), или использования ионизирующего излучения в качестве инструмента для улучшения свойств сельскохозяйственных видов растений (Рагаб Мусса, 2006). Интерес к фундаментальным исследованиям механизмов слабого ионизирующего воздействия связан с тем, что эффект малых доз излучения нельзя оценить путем прямой экстраполяции экспериментальных данных, полученных при больших дозах (Бурлакова, 1999). В последние годы описан целый ряд эффектов малых доз радиации, для которых характерна общность свойств, что свидетельствует о едином механизме из инициации. К таким эффектам относят, например, адаптивный ответ (Цховребова, Македонов, 2004; Daly, Thompson, 1975; Bonner, 2003), гиперчувствительность (Бурлакова и др., 1999; Mothersill et al., 1999; Zaka et al., 2001) и гормезис (Kondo, 1988; Рагаб Мусса, 2006). В структурно-метаболической теории A.M. Кузина (1986), а также в концепции «мембранного механизма биологического действия малых доз, активно развиваемой группой Л.Х Эйдуса (2001) приводятся многочисленные доказательства того, что в отличие от больших доз, первичной мишенью малых считается не ДНК, а клеточные мембраны.
Модулирующее действие предварительного облучения растений гороха ионизирующей радиацией на перекисныи гомеостаз хлоропластов при гипертермии
Вся биота на Земле подвергается постоянному воздействию многих физических агентов естественного и антропогенного происхождения, действие которых изменяются при их одновременном или последовательном действии. В случае, когда эффект комбинированного воздействия превышает сумму индивидуальных эффектов, ожидаемую при независимом действии каждого агента, говорят о синергическом взаимодействии этих агентов. И, наоборот, при ослаблении эффектов проявляется антагонистический эффект (Петинидр., 1999).
Исследование закономерностей проявления биологических эффектов при комбинированных воздействиях может прояснить механизмы усиления или ослабления радиационных эффектов. В связи с этим в наших экспериментах была применена последующая гипертермия к облученным растениям.
Сама по себе температура окружающей среды является наиболее типичным абиотическим фактором, влияющим на существование растений в природных условиях. Поэтому изучению вопроса устойчивости растений к экстремальным температурам посвящено большое количество работ. Установлено, что к 30 мин теплового шока (42 С) происходило полное развитие стресс-реакции в хлоропластах растений гороха (Курганова и др., 1999; Веселое, 2001). Все процессы, характерные для стадии тревоги к 30 мин гипертермии ярко выражены. На основании этих результатов, была поставлена серия опытов по исследованию воздействия гипертермии (42 С в течение 30 мин) на хлоропласта из предварительно облученных в дозах 0,1 и 1 Гр растений. Контролем служили хлоропласта из необлученных и не подвергнутых тепловому шоку растений, и дополнительно для каждого варианта «облучение + гипертермия» приводилось сравнение с показателями для хлоропластов из облученных, но простоявших при комнатной температуре растений.
В данной работе 30-минутная гипертермия необлученных растений вызывала усиленную генерацию супероксидного анион-радикала (рис. 10). Подобный эффект отмечался многими исследователями и объяснялся как результат утечки электронов на молекулярный кислород ввиду разобщения работы фотосистем (Курганова, Синицына, Веселов, 2001), тепловой инактивации антиоксидантных белков (Курганов, 2002) и ускорения свободнорадикальных процессов на мембранах (Alscher, Donahue, Cramer, 1997). Предварительное облучение в обеих дозах (0,1 и 1 Гр) незначительно корректировало интенсивность продукции супероксида на мембранах хлоропластові его уровень на 20-30% снижался по сравнению с шокированным контролем.
Гипертермия в течение 30 мин приводила к возрастанию интенсивности ПОЛ, который выражался в накоплении промежуточных и конечных продуктов липопероксидации: ДК - в 3 раза и МДА - в 2 раза по сравнению с контролем (рис. 11, 12). Последействие дозы облучения 0,1 Гр существенно не сказывалось на образовании ДК, однако приводило к возрастанию уровня МДА.
Большая доза заметно корректировала протекание липопероксидации: содержание ДК 2,5 раза падало по сравнению с шокированным контролем и достоверно не отличалось от контрольного для дозы 1 Гр уровня. Аналогично, концентрация МДА почти в 2 раза снижалась по сравнению с уровнем при тепловом шоке необлученных растений и сохранялась в переделах начального уровня.
Тепловой шок необлученных растений приводил к возрастанию активности основного фермента антиоксидантной защиты - СОД (рис. 13). Ранее активация СОД в результате кратковременного прогрева растений гороха была также показана в работах Л.Н. Кургановой и др. (1999). Предварительное облучение в дозе 0,1 Гр вызывало еще большую активацию этого фермента, однако по сравнению контрольным уровнем для дозы 0,1 Гр активность СОД была ниже на 35%. Гипертермия растений предварительно облученных в дозе 0,1 Гр вызывала снижение активности АП, по сравнению с уровнем активности фермента в не подвергнутых тепловой обработке, но облученных растений (рис. 14а). Сама по себе гипертермия контрольных образцов не изменяла активность АП - ее уровень не отличался от контроля. Температурный шок после облучения в дозе 1 Гр приводил к росту активности АП, однако только в 2 раза по сравнению с тепловой обработкой контроля. Воздействие повышенной температуры вызывало увеличение активности ГР до 160% от контроля, несмотря на высокую температурную лабильность этого фермента (Курганова и др., 1997) (рис. 146).
