Введение к работе
Актуальность темы. Для решения проблемы обеспечения питания населения полноценными белками большое место отводится крупяным культурам и в том числе гречихе. Её возделывают, в основном, для получения зерна, из которого вырабатывают ценный диетический продукт питания - гречневую крупу, отличающуюся высокой усвояемостью, питательностью и хорошими вкусовыми качествами (Ефименко, Барабаш, 1990). Известно, что гречиха характеризуется нестабильным урожаем и разнокачественностью плодов, которая в большей мере обусловлена растянутым периодом их созревания. Поиск путей повышения урожайности и качества плодов этой культуры является актуальным, представляет научный интерес и имеет большое народнохозяйственное значение. Агротехнические приёмы, широко применяемые в настоящее время на практике (внесение минеральных удобрений, средств защиты растений и др.), не всегда бывают достаточно эффективными. Важной задачей современной науки является разработка подходов к повышению продуктивности и устойчивости к неблагоприятным факторам произрастания различных культур на основе применения биорегуляторов, которые позволяют управлять их ростом и онтогенезом. От решения этой задачи в значительной степени зависит дальнейший прогресс в создании эффективных технологий возделывания сельскохозяйственных растений, которые, при этом, отвечали бы всё возрастающим требованиям в отношении экологической безопасности растениеводства. Особый интерес в этой связи представляет применение новых регуляторов роста, свойственных растениям и ответственных за управление процессами, влияющими на количество и качество урожая (Хрипач и др., 1999). В настоящее время большое внимание уделяют регуляторам роста -синтетическим аналогам фитогормонов, и защитно-стимулирующим составам, полученным из растений, грибов, водорослей (Шевелуха, 1990, 2003). Из этого ряда физиологически активных веществ значительный интерес представляют брассиностероиды, обладающие плейотропным действием, направленным на стимуляцию физиолого-биохимических процессов растений, и получившие широкое практическое использование, а также экосты - новые защитно-стимулирующие составы, состоящие из комплекса микроэлементов, биологически активного диоксида кремния, гиббереллинов и цитокининов (Mandava, 1988; Хрипач, 1993; Altmann, 1998,1999; Ковалёв, Янина, 1999; Тарчевский, 2001, 2002; Шакирова и др., 2002). Принимая во внимание малую токсичность и исключительно низкие нормы расхода, можно характеризовать эти соединения как биорациональные, экологически безопасные регуляторы роста (Хрипач, 1999). Однако, вопрос о механизме их действия не может считаться решённым и требует дальнейших углубленных исследований
стрф<*ОСійМІ
1 1СЛ
\ ОІ
(Якушкина, 1985, 1993). TT"Ta^4ftc ТПУІТІ''*іїфуці,Ч"У брассиностероидов позволило выявить их антистрфдоСійШ|ЖЖ'І№їМА|іііении устойчивости
к засухе, засолению, полеганию, что послужило основанием для разработки способов их применения в растениеводстве с целью повышения продуктивности растений (Хрипач и др., 1993; Прусакова, Чижова, 1996; Третьяков и др., 2001). К числу перспективных объектов исследования относится гречиха посевная, Специфика процессов цветения и плодообразования которой, как отмечалось ранее, делает её «сложной» культурой при существующих способах выращивания. Действие брассиностероидов и экостов на физиолого-биохимические процессы растений гречихи практически не изучено. Недостаточно данных о разной сортовой чувствительности гречихи к действию регуляторов, так как большая часть работ проводилась на проростках.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение специфики действия экзогенных эпибрассинолида и экоста на физиолого-биохимические процессы растений гречихи в разные периоды онтогенеза. В соответствии с этой целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Изучить влияние эпибрассинолида и экоста на энергию прорастания и всхожесть семян, а также рост проростков гречихи разных сортов.
Выявить специфику физиологического действия эпибрассинолида и экоста на активность альфа-амилазы семян гречихи, лишённых зародыша.
Определить оптимальные концентрации эпибрассинолида и экоста при различных способах их введения в растения гречихи разных сортов.
Оценить изменение содержания хлорофиллов а, Ьи каротиноидов в листьях растений гречихи под действием эпибрассинолида и экоста на разных этапах онтогенеза.
- Выявить особенности действия эпибрассинолида и экоста на
содержание свободных аминокислот в плодах и листьях растений гречихи в
процессе онтогенеза.
Определить влияние эпибрассинолида и экоста на полипептидный состав плодов гречихи разных сортов в течение онтогенеза.
Определить структуру урожая растений гречихи разных сортов и качество её плодов под влиянием эпибрассинолида и экоста.
Наметить пути повышения продуктивности растений гречихи и преодоления разнокачественности её плодов с помощью различных способов обработки эпибрассинолидом и экостом.
Научная новизна. Впервые показана высокая физиологическая активность эпибрассинолида и экоста в отношении альфа-амилазы, индуцирующей прорастание семян гречихи, у которых наблюдалось увеличение энергии прорастания и всхожести, по сравнению с контрольными вариантами.
Установлено действие эпибрассинолида и экоста на морфо-физиологические показатели растений гречихи, обуславливающие увеличение её продуктивности.
Впервые на трёх различных сортах гречихи была показана эффективность действия эпибрассинолида и экоста на повышение
содержания фотосинтетических пигментов: хлорофиллов а ,Ъ и, в некоторых случаях, каротиноидов, которое является одним из главных показателей интенсивности и продуктивности процесса фотосинтеза.
Выявлены особенности действия эпибрассинолида и экоста на содержание некоторых аминокислот в плодах гречихи, которое определяет их биологическую и пищевую ценность.
Установлены изменения полипептидного состава плодов гречихи в результате действия эпибрассинолида и экоста, которые касаются, в основном, минорных компонентов. При этом выявлена некоторая сортоспецифичность действия регуляторов. У сорта Богатырь в фазу молочной спелости плодов обнаружен полипептид с молекулярной массой в области 45 кДа, который отсутствует у сортов Баллада и Дождик в указанную фазу онтогенеза.
Практическая значимость.. Проведённый в работе анализ действия
эпибрассинолида и экоста на морфо-физиологические показатели гречихи
может служить основанием для разработки новых эффективных
технологий практического применения данных регуляторов роста, в которых, для наибольшего увеличения продуктивности растений, необходимо учитывать выявленную сортоспецифичность их действия. Показано, что наиболее эффективным из разработанных способов применения эпибрассинолида и экоста на растениях гречихи сортов Баллада, Богатырь, Дождик, Краснострелецкая является способ двойной обработки, заключающийся в полусухой обработке семян перед посевом и опрыскивании растений в фазу бутонизации - начала цветения.
Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации
были представлены на научных конференциях «Труды молодых учёных»
(Орехово-Зуево, 1999, 2000, 2001); VI Международной конференции
«Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001);
VI Международной научно-методической конференции «Продукционный
процесс сельскохозяйственных культур» (Орёл, 2001); VIII
Международном семинаре-совещании фитофизиологов «Фитофизиология:
перспективные исследования, связь с другими науками» (Тамбов, 2001);
Всероссийской конференции «Физиология растений и экология на рубеже
веков» (Ярославль, 2003); V Съезде Общества физиологов растений и
международной конференции «Физиология растений - основа
фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Влияние физических, химических и экологических факторов на рост и развитие растений» (Орехово-Зуево, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 150
страницах машинописного текста. Содержит 15 таблиц, 25 рисунков
и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (4 главы), заключения, выводов и приложения. Список цитированной литературы включает 203 наименования, из них 58 на иностранном языке.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Объектами исследования служили растения гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench) сортов Баллада, Богатырь, Дождик и Краснострелецкая, В опьпах были использованы аналог фитогормонов брассиностероидов -эпибрассинолид (СгвН^Об), синтезированный в Институте биоорганического синтеза НАН Беларуси - белое кристаллическое вещество, температура плавления 256-258С. Растворим в воде, бензоле, толуоле, спирте; нерастворим в ацетоне. ЛДд» (мг/кг ): для крыс >2000, для мышей-1000. СК50 ( мг/л ) : для карпа >10 (48ч), для дафний >100 (Зч) (Мельников, 1995), и различные формы нового экологически безопасного защитно-стимулирующего состава - экоста, полученные в НПК «БИОР» (Москва), которые содержат оптимальный для роста растений комплекс микроэлементов на гидрофобном ( - фильном) кремнезёмном носителе, а также смесь гиббереллинов и цитокининов.
Работа выполнена в период 1999-2003г.г. на базе лаборатории природных и синтетических регуляторов роста Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН и кафедры ботаники Московского Государственного областного педагогического института (г.Орехово-Зуево). Исследования включали в себя лабораторные, вегетационные (2) и полевые (3) опыты.
Лабораторные опыты. Лабораторные опыты с проростками гречихи проводили в факторостатных условиях при t=26C и влажности воздуха 39,5%. Семена гречихи обрабатывали растворами эпибрассинолида и экоста в интервале концентраций 10"п - 10'4 М и 5"10"9 - 10'3%, соответственно, полусухим предпосевным способом по методу Задонцева, Гринченко (Задонцев, Пикуш, Гринченко, 1973). Для этого 10 г семян помещали в колбы на 100 мл, добавляли 1 мл раствора регулятора и встряхивали на ротаторе в течение 6 часов. Затем семена раскладывали в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 5 мл опытного раствора, и помещали в термостат при t= 26С на трое суток (72 часа). Контролем служили семена, встряхиваемые на ротаторе с дистиллированной водой. Трёхдневные проростки гречихи переносили в стеклянные сосуды с раствором Кнопа и выращивали в камере фитотрона в том же режиме, при длине светового дня 16 часов. Повторность вариантов опьпа -четырёхкратная. Измерение длины, сырой массы надземных органов проростков (гипокотиля, семядольных листьев, эпикотиля) и их корневых систем проводили на 3, 5, 10-ые сутки. Энергию прорастания и всхожесть семян растений гречихи определяли на 4-ые и на 8-ые сутки, соответственно [ГОСТ 12038-66]. Силу роста растений гречихи устанавливали в течение 10 суток [ГОСТ 12040 - 66]. О физиологической активности регуляторов роста судили по отношению исследуемых показателей опытных проростков к соответствующим показателям контрольных, выросших на дистиллированной воде и принятых за 100 %.
Вегетационные опыты. В опытах использовали металлические
сосуды ёмкостью на 6 кг, содержащие смесь дерново-подзолистых почв,
чернозёма, песка в соотношении 3:1:1. В каждый сосуд высевали по 6 семян гречихи на глубину 1,5—2 см. Посев производили во второй декаде марта. Перед посевом в почву вносили удобрения из расчёта N - 0,15 г; Р205 -0,10 г; KjO - 0,15 г на 1 кг почвы (Журбицкий, 1968). Влажность почвы в сосудах составляла 70% от полной влагоёмкости. Семена гречихи обрабатывали предпосевным полусухим способом: дистиллированной водой в контрольных вариантах, растворами эпибрассинолида (10"12 - 10"8 М) и экоста (5Х10"9 - 5х 10"8 %) - в опытных вариантах. Повторность опьпа -четырёхкратная. В процессе вегетации проводили фенологические наблюдения за растениями гречихи. Морфологическими показателями явились: длина стебля главного и боковых побегов, а также число последних; количество и площадь листьев, длина и число образовавшихся цветочных кистей и количество бутонов.
Полевые опыты. Полевые мелкоделяночные опыты проводили на агробиологической станции Московского Государственного областного педагогического института в течение 1999 - 2003 г.п, город Орехово-Зуево. Почва опытных участков - средне-суглинистая, содержащая Р205 - 25 -27 мг/100 г; К20 - 14-16 мг/100 г; гумуса - 2-2,5 мг/100 г; рН - кислый 5,5. Перед посевом в почву вносили аммиачную, калийную селитры и нитрофоску из расчёта по действующему началу N45P100K45 Площадь опытных делянок 4 м2. Повторность опытов - четырёхкратная. Посев осуществляли широкорядным способом на глубину Зсм при прогревании почвы до 15 - 18С и оптимальной влажности (60-70 %). Опрыскивание растений эпибрассинолидом и экостом проводили однократно; расход рабочего раствора 0,2 литра на 1м2. Норма высева семян - из расчёта 1,5 млн. шт/га. Уход за посевами проводили в соответствии с технологией возделывания этой культуры в Средней полосе России. В период вегетации вели наблюдения за прохождением этапов органогенеза контрольными и обработанными ЭБ и ЭК растениями, а также фенологические наблюдения. Каждые 7 дней фиксировали длину стебля главного и боковых побегов, а также число последних; количество и площадь листьев главного и боковых побегов; число соцветий, бутонов и цветков на главном и боковых побегах; количество плодов и изменение их влажности в процессе налива и созревания; массу 1000 плодов. Составляли график чередования фенологических фаз у обработанных биорегуляторами растений на фоне контроля. Определяли содержание хлорофиллов а, Ь, каротиноидов и изменение аминокислотного состава листьев гречихи в контрольных и опытных вариантах. Уборку урожая проводили при побурении 75% плодов на растениях. После очистки и доведения до воздушно-сухого состояния, плоды были подвергнуты лабораторным исследованиям.
Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием программ Microsoft Excell 97, Microsoft ХР. В таблицах и на графиках приведены средние арифметические из всех повторностей и их средние квадратичные отклонения. При оценке различий между вариантами
использовали критерий Стьюдента, считая достоверными различия на уровне доверительной вероятности 0,95 (Зайцев, 1990).
Метод определения активности альфа-амилазы в эндосперме семян гречихи посевной. Для определения физиологической активности эпибрассинолида и экоста был использован биотест Т. Могге (1974г.), М. Nagu, Szabo (1985г.), заключающийся в индукции экзогенной гибберелловой кислотой активности альфа-амилазы в эндосперме пшеницы, модифицированный для ячменя (Прусакова, Чижова,1989), и гречихи (Чижова, Колотовкина , 1999). Влияние эпибрассинолида и экоста на активность альфа-амилазы эндосперма гречихи, лишённого зародыша, изучалось на агаровых блоках с введением в них исследуемых регуляторов. После суточной инкубации в термостате при 26С и темновом режиме, чашки Петри с агаровыми блоками проявляли раствором Люголя. Вокруг эндосперма появлялось неокрашенное кольцо гидролизованных Сахаров, образовавшихся в результате расщепления крахмала. Диаметр кольца служил показателем активности альфа-амилазы эндосперма гречихи, лишённого зародыша, под действием эпибрассинолида (10*12 М - 10 М) и экоста (5х 10"7 %-5х10*4 %). Контролем служили семена гречихи, помещенные на субстрат без биорегуляторов, а также семена, «убитые» кипячением.
Определение площади ассимилирующей поверхности листьев в различные фазы развития растений гречихи проводили методом высечек (Корнилов, 1961).
Определение содержания хлорофиллов а,Ъ и каротиноидов в тканях листьев растений гречихи разных сортов проводили методом спиртовой вытяжки без их предварительного разделения, с использованием спектрофотометра СФ-26. Вытяжки пигментов были приготовлены из свежего материала. Оптическую плотность полученного экстракта устанавливали при двух длинах волн, соответствующих максимумам поглощения хлорофиллов а ,Ъ (663 нм и 646 нм, соответственно) в красной области спектра и при длине волны абсорбционного максимума каротиноидов 470 нм (Гавриленко, 1975).
Содержание запасных веществ в плодах гречихи установлено методом инфракрасной спектроскопии по диффузному отражению размолотых плодов на инфракрасном анализаторе NYRS sistems 4500 (Крищенко,1997). Средне квадратичное отклонение результатов метода от стандартного(по Кьельдалю)составляло не более 0,3%. Для анализа брали 2 г размолотых плодов в 4 - х кратной повторности. Определения проводили на оборудовании научно-экспериментального объединения «ИнтерАгроТекс».
Определение аминокислотного состава плодов и листьев растений гречихи проводилось путём хроматографического разделения их спиртовых экстрактов на анализаторе Т-339, который служит для качественного и количественного анализа аминокислот с использованием ионообменной хроматографии на ионитах.
Метод определения запасных белков в плодах гречихи. Электрофоретическое исследование белков проводили в денатурирующих
условиях по Лэммли (Laemmli, 1970), с использованием 12%-ного полиакриламидного геля или градиента концентрации акриламида 10% -20%. Образцы белковых препаратов для электрофореза с SDS готовили по Гиффорду с соавторами (Gifford et al.,1982) с некоторыми модификациями. Белки плодов гречихи экстрагировали на холоду 1М NaCl (фосфатный буфер, рН 7,5), осаждали ТХУ, промывали холодным ацетоном и растворяли в буфере для образца при 100С. Для получения термостабильных белков исходный солевой экстракт прогревали 5 мин. при 75С. Термолабильные и термостабильные белки разделяли центрифугированием при 5500 об/мин, в течение 15 мин. После электрофореза гели фиксировали с одновременным окрашиванием в растворе Кумасси R-250 на смеси метанол - уксусная кислота- вода (5:1:4), отмывали от несвязавшейся краски, фотографировали и высушивали.
