Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика микоплазм 12
1.1.1. Таксономия, филогения и эволюция 12
1.1.2. Клеточная и молекулярная биология 17
1.1.2.1. Морфология и ультраструктура 17
1.1.2.2. Среда и условия обитания микоплазм 21
1.1.2.3. Геном и его экспрессия 26
1.2. Микоплазмы и микоплазмозы: взаимодействие микоплазм с растениями 30
1.2.1. Особенности морфозов при инфицировании растений микоплазмами 30
1.2.2. Микоплазменные инфекции растений: молекулярно-генетические, биохимические и ультрацито-структурные особенности 32
1.3. Патогенность, диагностика и подавление микоплазменных инфекций: проблемы и перспективы 38
1.4. Адаптация бактерий к неблагоприятным условиям роста: морфология, биохимия, ультрацитоструктура и патогенность 41
Экспериментальная часть 53
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Культивирование микоплазм (Acholeplasma laidlawii PG8) 53
2.2. Оценка количества жизнеспособных клеток A.laidlawii PG8 54
2.3. Инфицирование растений (Pisum sativum L., Vinca minor L.) клетками A.laidlawii PG8 55
2.4. Приготовление проб для электронной микроскопии \56
2.5. Определение активности СОД в тканях растений 57
2.6. Определение концентрации конъюгированных диенов в тканях растений 57
2.7. Определение концентрации нитритов в тканях растений 58
2.8. Выделение ДНК из клеток микоплазм, очистка и секве-нирование 58
2.9. Выделение и очистка тотальной ДНК из клеток растений 59
2.10. Электрофорез ДНК в агарозном геле 60
2.11. Амплификация фрагментов ДНК A.laidlawii PG8 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) 61
2.12. Получение культур A.laidlawii PG8, адаптированных к неблагоприятным условиям роста 62
2.13. Определение устойчивости клеток A.laidlawii PG8 к стрессовым воздействиям 63
2.13.1. Определение устойчивости к воздействию перекиси водорода 63
2.13.2. Определение термоустойчивости 63
2.14. Разделение белков клеток A.laidlawii PG8 методом двумерного электрофореза 63
2.15. Электрофорез ДНК-связанных белков в ПААГ 64
2.16. Статистическая обработка данных 65
2.17. Сравнение частоты выявления морфологических отклонений у контрольных и опытных растений V.minor L. 65
Глава 3. Результаты и их обсуждение 68
3.1. Фитопатогенность штамма A laidlawii PG8 68
3.1.1. Инфицирование растений A.laidlawii PG8: способы и контроль заражения 69
3.1.2. Контроль инфицируемости растений A.laidlawii PG8 с помощью ПЦР 70
3.1.3. Морфологические особенности растений (P.sativum L.), инфицированных A.laidlawii PG8 72
3.1.4. Особенности ультраструктуры тканей растений, инфицированных A.laidlawii PG8 73
3.1.5. Реактивность неспецифических сигнальных систем у растений, инфицированных A. laidlawii PG8 79
3.1.5.1. Содержание коньюгированных диенов в тканях исследуемых растений 81
3.1.5.2. Активность СОД и содержание нитритов в тканях инфицированных растений 83
3.2. Адаптация A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста 87
3.2.1. Жизнеспособность A.laidlawii PG8 в условиях голодания 87
3.2.2. Влияние воздействия теплового шока и перекиси водорода на жизнеспособность контрольных и опытных культур A.laidlawii PG8 93
3.3. Морфологические, ультраструктурные, биохимические и молекулярно-генетические особенности клеток культуры A.laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста 95
3.4. Фитопатогенность клеток культуры A.laidlawii PG8, адаптированной к неблагоприятным условиям роста 115
Заключение 122
Выводы 126
Список литературы
- Клеточная и молекулярная биология
- Оценка количества жизнеспособных клеток A.laidlawii PG8
- Определение устойчивости к воздействию перекиси водорода
- Контроль инфицируемости растений A.laidlawii PG8 с помощью ПЦР
Введение к работе
Значительный интерес к микоплазмам (класс Mollicutes) обусловливается, с одной стороны, уникальностью биологии мельчайших прокариот, а с другой -диктуется практической необходимостью. Микоплазмы - основные контами-нанты клеточных культур, широко используемых в биотехнологии, паразиты человека, животных, растений.
По вредоносности микоплазменные инфекции растений относят к катастрофическим заболеваниям, часто принимающим характер эпифитотий. Развитие этих инфекций, как правило, обусловлено нарушением симбиотического равновесия экосистем. Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного растениеводства, в том числе в основных районах хлебопашества и овощеводства. Потери урожая зерна вследствие фитомикоплазмозов иногда составляют 80-90%, а овощей - 20-30% (Скрипаль, 1988).
Возбудителями микоплазменных инфекций растений являются представители родов Acholeplasma, Spiroplasma, а также группы Phytoplasma - ближайших родственников Acholeplasma laidlawii.
Подавление и контроль микоплазменных инфекций растений представляют проблему, разрешение которой связывают с выяснением молекулярных механизмов адаптации микоплазм, обеспечивающей персистенцию этих микроорганизмов и связанный с нею фитопатогенез. Отсутствие клеточной стенки, редукция генома и ограниченные биосинтетические возможности не являются для микоплазм существенным препятствием в преодолении разнообразных защитных систем высших организмов и выживании в неблагоприятных для роста условиях. Однако механизмы, обеспечивающие адаптацию и циркуляцию в природе мельчайших неспорообразующих прокариот, пока неизвестны. Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является A.laidlawii - «вездесущая» микоплазма, обнаруживаемая в почве, компосте, сточных водах, клеточных культурах, тканях человека, животных и растений. При этом у растений, зараженных A.laidlawii, развитие инфекций связано с ко- лонизацией тканей мини-телами микоплазмы - ультрамикроформами, размеры которых (менее 0,2 мкм) характерны для наноклеток бактерий. Феномен на-нотрансформации обнаружен у ряда бактерий, в том числе как адаптация микроорганизмов к неблагоприятным условиям роста. У некоторых фитопатогенных микроорганизмов соответствующие процессы сопровождаются изменениями вирулентных свойств. Однако в отношении мельчайших не-спорообразующих бактерий - микоплазм - сведения о проведении подобных исследований отсутствуют.
Цель и задачи исследования. Выяснение особенностей фитопатогенно-сти и адаптации к неблагоприятным условиям роста Acholeplasma laidlawii PG8 составило цель данной работы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Оценить фитопатогенность штамма A. laidlawii PG8 в отношении Vinca minor L. и Pisum sativum L- специфичного и неспецифичного индикаторов фитоми-коплазмозов.
Выявить особенности окислительного стресса в фотосинтезирующих и нефо-тосинтезирующих тканях растений, инфицированных микоплазмой.
Выяснить влияние неблагоприятных условий роста - ограничения субстрата, а также воздействия теплового шока и перекиси водорода на жизнеспособность клеток культуры A. laidlawii PG8.
Определить ультраструктурные и молекулярно-генетические особенности клеток A. laidlawii PG8 в неблагоприятных условиях роста (ограничение субстрата).
Оценить фитопатогенность адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8.
Научная новизна. Впервые показана фитопатогенность A.laidlawii PG8 в отношении как специфичного, так и неспецифичного индикаторов микоплазмо-зов растений — Vinca minor L. и Pisum sativum L. Установлено, что морфофи-зиологические, ультрацитоструктурные изменения, возникающие у растений в ответ на инфицирование A.laidlawii PG8, связаны с трансформацией вегетатив-
7 ных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы). При этом инфицирование проростков P.sativum L. микоплазмой сопровождается реакциями ин-гибиции супероксиддисмутазы (СОД), активации нитрогенеза и перекисного окисления липидов (ПОЛ), динамика которых различается в фотосинтезирую-щих и нефотосинтезирующих тканях растений.
Впервые установлено, что адаптация A.laidlawii PG8 к неблагоприятным условиям роста (ограничение субстрата) in vitro связана с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы (наноклетки). Обнаружено, что в культуре клеток A.laidlawii PG8 присутствует два клеточных морфотипа микоплазмы - типичные (вегетативные) клетки (0,6 мкм) микоплазмы и ультрамикроформы (< 0,2 мкм), количественное соотношение которых зависит от условий роста. Обнаружено, что в средах с ограниченным субстратом наноклетки являются преобладающим морфотипом A.laidlawii PG8. Ультрамикроформы образуют на агаризованных питательных средах нетипичные для микоплазм микроколонии; сохраняют потенциальную способность к пролиферации, реверсии и проявляют устойчивость к стрессорным воздействиям. Показано, что трансформация вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы связана с существенной реорганизацией экспрессии генома.
Впервые установлено, что ДНК-связывающие белки наноклеток A.laidlawii PG8 могут обусловливать аттенуацию амплификации оперона рРНК, содержащего гены тРНК микоплазмы. Предложены специфичные молекулярно-генетические зонды для дифференциальной диагностики вегетативных клеток и ультрамикроформ A.laidlawii PG8.
Впервые установлено, что клетки адаптированной к неблагоприятным условиям роста культуры A.laidlawii PG8 обладают более высокой фитопато-генностью по сравнению с клетками неадаптированной культуры микоплазмы.
Научно-практическая значимость. Полученные данные вносят вклад в понимание адаптации к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii PG8 и особенностей фитопатогенности этой микоплазмы. Результаты работы могут слу-
8 жить основой для развития новых подходов к решению проблемы контроля ми- коплазменных инфекций у растений.
Разработаны методы для исследования процессов адаптации к неблагоприятным условиям роста A.laidlawii PG8 in vitro, а также способ (на основе метода ПЦР) дифференциальной диагностики вегетативных клеток и ультрамикроформ (наноклеток) A.laidlawii PG8 - микоплазмы, вызывающей инфекции у растений, а также контаминирующей клетки высших эукариот, культивируемые in vitro.
Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в медицинских, ветеринарных, сельскохозяйственных, биологических и биотехнологических учреждениях, занимающихся разработкой способов диагностики персистентных инфекций, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по микробиологии, стрессологии, биохимии и физиологии растений в ВУЗах.
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа с 1999 - 2005 гг. проводилась в соответствии с планом научных исследований КИББ КазНЦ РАН по теме «Взаимодействие микоплазм с высшими организмами на молекулярно-генетическом уровне». Исследования автора, как исполнителя данной тематики поддержаны грантами РФФИ 98-04-48972, 01-04-49011, 05-04-49435, а также грантом ведущей научной школы акад. И.А.Тарчевского. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследованиях автора. Синтез праймеров, секвени-рование нуклеотидных последовательностей ДНК, а также двумерный электрофорез полипептидов проводились на базе Института физико-химической медицины МЗ РФ (г. Москва).
Положения, выносимые на защиту. 1. Штамм A.laidlawii PG8 является фитопатогенным в отношении как специфичного (V.minor L.), так и неспецифичного (P.sativum L.) индикаторов мико-плазмозов растений.
Морфофизиологические, ультрацитоструктурные и биохимические изменения, возникающие у растений в ответ на инфицирование AJaidlawii PG8, связаны с трансформацией вегетативных клеток микоплазмы в мини-тела (ультрамикроформы).
Неблагоприятные условия роста AJaidlawii PG8 in vitro обусловливают реорганизацию экспрессии генома и трансформацию вегетативных клеток микоплазмы в ультрамикроформы, которые устойчивы к стрессовым факторам и способны к реверсии.
4. Адаптированная к неблагоприятным условиям роста in vitro культура A.laidlawii PG8 является более фитопатогенной, чем неадаптированная культу ра микоплазмы.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на IV школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2000, 2003); VIII международной школе - конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), II региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005), Международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнообразия» (Вологда, 2005), Международной научной конференции, посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), а также на итоговых конференциях Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2003, 2004, 2006).
Клеточная и молекулярная биология
Клетки микоплазм не образуют клеточной стенки, что определяет их пластичность, которая позволяет этим микроорганизмам проникать через поры фильтров диаметром 0,22 - 0,45 мкм, а также перемещаться по межклетникам, через ситовидные элементы и плазмодесмы [57]. Клетки одного и того же вида могут быть как сферической формы 0,3 - 0,8 мкм в диаметре, так и образовывать ветвящиеся тяжи длиной до 100 мкм. Проходя фазу коккоидных структур, тяжи распадаются на ряд сферических клеток. Эти превращения являются следствием того, что деление сферических клеток отстает от репликации генома: тяжи и коккоидные структуры мультинуклеарны. В условиях дефицита нуклео-тидов в культуре M.capricolum преобладают ветвящиеся клетки из-за замедления репликации генома [205]. Спироплазмы часто образуют спирально закрученные нити. Клетки M.gallisepticum имеют грушевидную форму, М.рпеитопіа тоже грушевидны, но более вытянуты, a M.mycoides имеют форму тяжей [34].
Снаружи микоплазмы покрыты трехслойной плазматической мембраной со средней толщиной 10 нм и имеющей сходство с мембраной эукариот. Мембрана содержит все липиды микоплазмы и от 25 до 50% белков клетки. В их состав входят стеролы, составляющие до 25% общего количества липидов. В этом отношении микоплазмы являются исключением в царстве прокариот наряду с Methylococcus capsulatus [49]. В зависимости от состава ростовой среды, ее температуры и возраста культуры относительное содержание белков и липидов в мембране A.laidlawii изменяется. По мере старения культуры в ней уменьшается содержание холестерина, определяющего текучесть и проницаемость мембраны [34].
Электронно-микроскопические наблюдения клеток микоплазм позволяют выявить наличие наружного фибриллярного клеточного матрикса или капсулы. Наружный матрикс покрывает клеточную мембрану электронно-плотным аморфным слоем толщиной от 20 - 30 до 50 нм. [230; 91]. Материал капсулы имеет положительную реакцию на мукополисахариды. О присутствии углеводных остатков на поверхности мембран многих видов Mycoplasma, Acholeplasma и Spiroplasma свидетельствует способность этих организмов связываться и агглютинироваться с лектинами [92].
Цитоплазма микоплазм имеет гранулярную структуру, содержит нити нуклеопротеина и рибосомы. Иногда рибосомы упаковываются в компактные спиральные структуры, напоминающие клеточные органеллы. У M.gallisepticum была обнаружена система тубулярных структур, которая, вероятно, может выполнять функции цитоскелета [34]. В клетках A.laidlawii тубупярпые структуры не обнаружены. Однако у некоторых видов ахолеплазм описывают цитоскеле-топодобные образования в цитоплазме с молекулярным весом около 100 кДа [57]. В цитоплазме клеток M.mycoides обнаружены палочковидные р-структуры диаметром 40 нм, которые состоят из параллельных субфибрилл диаметром 3 нм и являются своеобразной осью клеток [176; 90].
Некоторые виды микоплазм способны к скользящей подвижности, либо активным изменениям очертаний клетки. Для представителей рода Spiroplasma характерны сократительные и вращательные движения. [34]. В зависимости от условий и фазы роста культуры клетки микоплазм могут терять подвижность и способность к адгезии [10].
При выращивании на агаризованных питательных средах молликуты образуют колонии диаметром не более 1 мм. Колонии имеют вид "яичницы-глазуньи", центр которых врастает в толщу слоя питательной среды. Образование колоний такого типа является одним из критериев, при помощи которого проводится идентификация представителей класса Mollicutes. Врастание колоний в агаризованные среды обусловлено способностью клеток микоплазм проникать между мицелиями агар-агара, ввиду отсутствия у них ригидной клеточной стенки. Периферическая зона колоний разных видов микоплазм может быть гранулированной или гомогенной, что отражает неодинаковую способность клеток к накоплению липидов [56]. Микоплазмы не образуют спор или каких-либо покоящихся форм. В то же время для этих микроорганизмов характерен экстремальный плеоморфизм в зависимости от стадии роста [57; 47]. Появление плеоморфных форм при изменении среды инкубации наблюдают как у адаптированных лабораторных штаммов, так и у клинических изолятов микоплазм [31; 193, 57; 234]. Плео-морфные популяции A.laidlawii содержат ультрамикроформы диаметром 100 -250 нм, которые были названы «элементарными телами» или «минимальными телами» (мини-телами). Они имеют вид сферических, электронно-оптически плотных частиц, окруженных мембраной [31]. Показано, что «элементарные тела» M.hominis на жидких и твердых питательных средах проявляют незначительный рост. Предполагается, что наличие подобных форм, обеспечивает выживание микоплазм при изменении окружающей среды [193].
В клетках тканей растений шелковицы, пораженных курчавой мелколи-стностью, обнаружены овальные и сферические электронно-прозрачные тела, 45-90 нм в диаметре [57]. Эти тела окружены трехслойной мембраной, один слой которой электронно-прозрачный, а два - электронно-плотные. Предполагается, что развитие карликовости шелковицы связано с появлением в ситовидных трубках и паренхимных клетках флоэмы больных растений микоплазмоподобных организмов сферической формы диаметром от 50 до 160 нм. Внутри этих мелких клеток зафиксировано наличие наследственного материала [234]. Такие же мини-тела были выявлены при инфицировани растений P.sativum L. клетками A.laidlawii [23]. Подобные структуры обнаруживались и при длительном культивировании клеток спироплазм без пересева в свежую питательную среду [123], а также в тканях инфицированных микоплазмами растений, выращенных в условиях пониженного освещения [97].
Оценка количества жизнеспособных клеток A.laidlawii PG8
Оценку жизнеспособности культур микоплазм проводили по количеству колониеобразующих единиц в миллилитре культуры (КОЕ/мл) стандартным методом с учетом особенностей культивирования микоплазмы [2]. Суспензию клеток микроорганизмов последовательно разводили в полноценной питательной среде в 4 сериях десятикратных разведений. По 0,1мл из каждого разведения вносили в пробирки, содержащие 5 мл полужидкой агаризованной (0,4% агарозы Bio-Rad, США) модифицированной среды Эдварда, термостатированной при 40С. После застывания агарозы при комнатной температуре пробирки помещали в термостат и выдерживали при 37С от 4 до 14 суток. Подсчет колоний проводили в пробирках, в которых выросло от 10 до 100 колоний. Количество КОЕ в исходной культуре определяли по средней величине количества колоний, выросших в разных сериях с учетом степени разведения. Серии разведений в жидкой среде Эдварда использовали для определения количества жизнеспособных клеток методом конечных разведений (МКР) [37]. Пробирки с десятикратными разведениями инкубировали при 37С до 28 суток или до появления характерного роста. Для облегчения визуального контроля роста в этом случае в среду добавляли краситель феноловый красный (0,005%). Смена мали новой окраски среды на оранжевую или желтую свидетельствовала о росте культуры. Поскольку при выбранном количестве повторностей подсчет количества жизнеспособных клеток связан со значительной погрешностью, данным методом оценивался только логарифм этой величины. Достоверным считали порядок титра, подтвердившийся не менее чем в трех сериях разведений. О гомогенности и чистоте культуры судили по морфологии колоний на агаризованной среде Эдварда, а также с помощью ПЦР-тестов.
Семена гороха посевного (Pisum sativum L. сорт "ТАН") были получены из НПО "Нива Татарстана" (г. Казань). Семена перед проращиванием обрабатывали 2%-м раствором гипохлорида натрия в течение 20 минут. Обеззараженные семена замачивали в воде 6 часов и оставляли во влажной камере при 25 -27С до достижения побегом длины 10-15 мм. Инфицирование проростков клетками микоплазм проводили спонтанным заражением через неповрежденную корневую систему, а также методом субэпидермальной инъекции Клемента [23]. В первом случае корешки проростков выдерживали в суспензии клеток A.laidlawii PG8, содержащей 10 КОЕ/мл, в течение часа при 25 - 27 С. Суспензию готовили на среде Эдварда, ТПС, фосфатно-солевом буфере (ФСБ: 50 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,2, 100 мМ NaCl), растворе Кноппа (на 1л: 1 г Ca(N03)2, 0,25 г KN03, 0,12 г КС1, 0,25 г КН2Р04, 0,25 г MgS04) либо дистиллированной воде. После экспозиции корешки промывали в водопроводной воде и переносили в кюветы для дальнейшего выращивания. При использовании метода Клемента 5-7 мкл культуры микоплазм вводили в нижнюю часть стебля растения микрошприцем («Hamilton», Швеция). Контрольные растения подвергали тем же процедурам со стерильными средами для выращивания микоплаз-мы.
Растения барвинка малого (Vinca minor L.) размножали вегетативно (черенкованием). Черенки укореняли в почве в индивидуальных горшках. В экспе риментах использовали растения длиной 10-12 см, имеющие три яруса листьев. Условия влажности и освещенности поддерживали с использованием установок «Флора-1». Растения барвинка (V.minor L.) инфицировали клетками A.laidlawii PG8 методом Клемента через две недели после укоренения черенков.
Клетки микоплазм собирали центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин при комнатной температуре. Ткани растений препарировали скальпелем. Материал переносили в полипропиленовые пробирки объемом 1,5мл и фиксировали в 0,1% глутаровом альдегиде. Дальнейшую фиксацию проводили в 2,5%) растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере (0,1М, рН 7.2), в течение 12 часов. Затем материал выдерживали в 0,1% растворе OsC 4, приготовленного на том же буфере, с добавлением 34 мг/мл сахарозы (постфиксация).
Дегидратацию образцов проводили в возрастающих концентрациях ацетона следующим образом: 1) ополаскивали в 30%-ном водном растворе 2) выдерживали 10 минут в 40%-ном растворе, переносили в свежий 40%-ный раствор и выдерживали еще 10 минут; 3) выдерживали 2 раза по 10 минут в 50%-ном растворе; 4) выдерживали в 60%-ном растворе - 2 раза по 15 минут; 5) в 70%-ном - 2 раза по 15 минут; 6) в 80%-ном - 2 раза по 15 минут; 7) в 90%-ном - 2 раза по 20 минут; 8) в чистом ацетоне - 3 раза по 20 минут.
После дегидратации препараты выдерживали в окиси пропилена 45 минут, после чего проводили пропитывание эпоксидной смолой ЭПОН 812 и окисью пропилена по 24 часа в следующих соотношениях: 1) 1:2; 2) 1:1; 3) 2:1. Затем материал помещали в чистую смолу. Полимеризацию проводили при температурах 37С, 45С и 57С по 24 часа. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция), монтировали на никелевые сеточки, окрашивали водным раствором уранилацетата [218] и цитратом свинца [192]. Образцы просматривали на электронном микроскопе Hitachi-125 (Япония).
Определение устойчивости к воздействию перекиси водорода
Клетки, собранные центрифугированием (12000g, 25С, 20 мин), помещали в фосфатно-солевой буфер и тщательно суспендировали. Суспензию клеток разделяли на три части, в две из которых вносили раствор перекиси водорода до конечной концентрации 0,1 и 0,2% и выдерживали 20 минут при комнатной температуре. После выдерживания клеток с соответствующими концентрациями перекиси водорода добавляли свежий буфер (1:100), после чего определяли количество жизнеспособных клеток в суспензиях.
Выживаемость клеток микоплазмы определяли как процентное отношение жизнеспособных клеток в суспензии до и после воздействия различными концентрациями перекиси водорода.
Клетки контрольных (находящихся на стадии логарифмического роста) и опытных (культивированных в обедненных средах) культур собирали центрифугированием (12000g, 25С, 20 мин.), разводили или сгущали в ТПС примерно до одинаковой плотности 10 кл/мл и разливали в пробирки по 1мл. Суспензии клеток нагревали до 48С и термостатировали в течение 60 минут. Каждые 15 минут отбирали пробы для оценки жизнеспособности клеток.
Для сравнения белковых спектров клеток культуры A.laidlawii PG8, находящихся в разных условиях культивирования, использовали метод двумерного электрофореза. Клетки контрольных и опытных культур A.laidlawii PG8 (250 -500мл) собирали центрифугированием (12000g, 4С, 20 мин). Осадки суспендировали в буфере (ФСБ) и наслаивали на линейный градиент концентрации от до 30% перкола (Sigma, США) в пробирках для бакет-ротора объемом 50 мл.
После полутора часов центрифугирования (6000 g, 4 С) клетки A.laidlawii PG8 концентрировались в двух зонах, расположенных примерно в верхней и нижней четверти градиента плотности. Эти две фракции градиента разделяли, разбавляли тремя объемами свежего буфера и центрифугировали 1 час при ускорении 6000 g, не допуская осаждения перкола. Полученные клеточные осадки суспендировали в 10 мл ФСБ и вновь центрифугировали 20 мин при 12000 g (4С). Очищенные препараты клеток замораживали и хранили при -20С. Подготовку препаратов белков и электрофорез проводили согласно Gorg et al. [220], на базе лаборатории генной инженерии и иммуногенетики НИИ физико-химической медицины Минздрава РФ (г. Москва).
Клетки двух фракций с разной плавучей плотностью, полученные как описано в п. 2.14, использовали для выделения ДНК. Спиртовые осадки ДНК (см. п. 2.8) растворяли до концентрации ДНК 2мкг/мл в 10 мМ трис-HCl буфере (рН 7,6), содержащем 50 мМ NaCl и 10 мМ MgCl2. В раствор вносили ДНК-азу I (Sigma, США) до 10 мкг/мл, после чего пробу термостатировали при 37С 30 минут. К 40 мкл образца добавляли 10 мкл 10%-го SDS, 2,5 мкл ЇМ трис-НСІ (рН 6,8), 1 мкл 0,5 М 2-меркаптоэтанола (Serva, США). Образцы выдерживали 2 минуты на водяной бане, смешивали с каплей глицерина с бромфеноловым синим (0,01%, Sigma) и наносили на ступенчатый полиакриламидный гель (18% акриламид, 0,5% бисакриламид, 0,375 М Трис-HCl рН 8,9 - нижний гель; 3% акриламид, 0,08% бисакриламид, 0,125 М Трис-НСІ рН 6,8 - верхний гель; оба буфера содержали 0,1% персульфат аммония, 0,05% ТЕМЕД, 0,1% SDS). Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 10 В/см в Трис-глициновом буфере (Трис 25 мМ, глицин 192 мМ, SDS 0,1%), рН 8,3) до выхода бромфенолового синего из геля [41].
Статистический анализ данных проводили с применением стандартных математических методов (расчет среднеквадратического отклонения, сравнение средних по критерию Стьюдента) средствами программ Microsoft Excel-2000. Критерий вероятности Р 0,05 принимали достаточным для достоверной разницы опытной и контрольной групп данных. Сравнение нескольких выборок, полученных в экспериментах, анализировали с помощью метода дисперсионного анализа (ANOVA) [3].
В контрольные и опытные группы отбирали по 20 растений одинакового размера и возраста укоренения. Растения опытных групп инфицировали методом Клемента различными культурами A.laidlawii PG8. В контрольных группах проводили инъекцию растений стерильной питательной средой (см. п. 2.3). Наблюдения за контрольными и опытными растениями продолжали в течение 6 -8 недель, необходимых для проявления признаков фитоплазмоза. Степень проявления некоторых признаков определяли как слабую (+), среднюю (++) и максимальную (+++). Выявляемые отклонения классифицировали по следующим типам [57]: 1. Задержка роста побега (ЗРП) - отсутствие прорастания побега из верхушечной почки в течение времени наблюдения. 2. Хлороз - изменение окраски листьев с темно-зеленой на бледно-зеленую или желтую, мозаичное пожелтение листьев, просветление жилок листьев, вздутие жилок листьев, деформация листовых пластинок. О наличии хлороза судили по совокупности этих признаков. Степень проявления определяли по поражению одного, двух или трех и более ярусов листьев. 3. Некроз - отмирание края листовых пластинок верхних листьев (+), распространяющиеся к стеблю (++) и на нижние ярусы листьев (+++) 4. Увядание листьев (УЛ) - увядание и опадение листьев нижних (+), затем средних (++) и верхних (+++) ярусов. 5. Аномалии развития побега (АРП) - изменения в онтогенезе растения, связанные с нарушениями роста побега, проявляемые как верхушечная карликовость, деформация и редукция размера листьев (мелколистность), искривление, утолщение или истончение стебля, разветвление побега при отсутствии главного побега (нарушение апикального доминирования). В эту же группу включали растения, погибшие не вследствие распространения листового некроза, а в результате структурных изменений тканей и органов растений.
Обработку экспериментальных данных проводили с учетом требований, предъявляемых для анализа малочисленных выборок. Поскольку эксперименты проводили с генетически однородным материалом (растениями, полученными в результате вегетативного размножения), выборки считали соответствующие нормальному распределению и для их сравнения использовали стандартные параметрические критерии [28]. Контрольные и опытные группы растений в начале эксперимента случайным образом разделяли на пять подгрупп, в каждой из которых определяли долю растений, проявляющих один из типов отклонений (р). В полученных выборках долей находили среднеквадратические отклонения (s). Эти значения использовали для предварительной оценки достоверности сравнений выборок по критерию Стьюдента, контроля отсутствия аномалий в распределениях и графического представления данных.
Контроль инфицируемости растений A.laidlawii PG8 с помощью ПЦР
Как и у большинства прокариотических микроорганизмов гены 16S, 23 S и 5S рРНК A.laidlawii объединены в оперон [77; 78; 211]. Этот оперон представлен двумя копиями, расположенными на удаленных друг от друга участках хромосомы (рис. 16). Оба оперона способны к экспрессии, хотя и различаются единичными заменами нуклеотидов в кодирующих последовательностях. В спейсере между генами 16S и 23 S рРНК находится вариабельная последовательность, некомплементарная у двух оперонов. На 5f конце этой последовательности в одном из оперонов имеется вставка 210 пар нуклеотидных оснований. В зависимости от наличия или отсутствия этой дополнительной последовательности варианты рибосомных оперонов представляют собой большую или малую копию оперона, имеющие размеры 16S - 23S спейсера 426 и 296 п.н.о. В соответствии с принятой номенклатурой рибосомных оперонов бактерий, в том числе молликут [183], эти копии могут быть обозначены как оперон ггпА и оперон ггпВ. В спейсере между генами 16S и 23S рРНК микроорганизмов родов Acholeplasma и Phytoplasma локализованы два гена тРНК - изо-лейцина и аланина. У A.laidlawii они расположены во вставке (210 н.п.о) спейсера (сайты 510 - 586 и 611 - 686 на схеме) и таким образом связаны с большим опероном {ггпА) этой микоплазмы.
Сочетание консервативных и вариабельных участков в 16S - 23 S спейсе рах рибосомных оперонов позволяет использовать эти области в качестве родо-и видоспецифичного маркеров для микроорганизмов рода Acholeplasma и фи-топлазм. Специфичные праймеры для выявления оперонов рРНК A.laidlawii предложены [211] для обнаружения A.laidlawii в клеточных культурах. Эти праймеры комплементарны последовательностям 709 -753 н.п.о. (5;-gagatcttgaaaagtagataaatgatgtctgaaaagaaataagg ) и 1042 - 1070 н.п.о. (57-gatgaacgatgtg-ggaaaatcggtcgaag ). Район отжига первого (прямого) праймера включает последовательность инсерции, поэтому амплификации подвергается только большой оперон гтА. Это, безусловно, является недостатком, если для исследовательской работы необходим сравнительный анализ амплификации обоих оперонов. В связи с этим на основании результатов нашего анализа генов рРНК микоплазм были синтезированы праймеры A16F (S -cccttatgacctgggctacaaacgtgaac-3;) и A23R (S -caccttcttcgaccgattttcccac-S), комплементарные кодирующим областям генов 16S и 23 S (рис. 16) и. таким образом, позволяющие амплифици-ровать как кодирующие зоны генов двух оперонов, так и спейсеры между ними. Согласно расчетам, амплификация двух копий повторяющейся последовательности, которой является рРНК оперон A.laidlawii, может дать двукратное увеличение выхода продукта ПЦР. Ожидаемым продуктом реакции являются два фрагмента оперонов рРНК - ДНК размером 1042 и 832 п.н.о. соответственно. Использованные праймерные последовательности были подвергнуты скринингу на возможную гомологию со случайными последовательностями из Всемирного банка генов, в результате которого было установлено, что праймеры A16F и A23R могут соответствовать родоспецифичным зондам в интервале расчетных температур отжига. Размеры фрагментов могут быть использованы в качестве видоспецифичного маркера. Проведенные нами лабораторные испытания праймеров A16F и A23R подтвердили отсутствие ампликонов при использовании в качестве матрицы в ПЦР ДНК (до 200 нг) P.sativum L., C.roseus L., V.minor 1., T.aestivum L., E.coli, B.subtilis, C.perfingens, а также препаратов ДНК из вытяжек черноземных и подзолистых почв, что свидетельствует об их специфичности. Для обнаружения ампликонов оказалось достаточно использовать 100 (и менее) пг ДНК A.laidlawii в качестве исходной матрицы.
Значительное повышение чувствительности ПЦР-анализа с выбранными праймерами связано с появлением дополнительного продукта амплификации фрагмента малого оперона ггпВ размером 832 п.н.о. В большинстве исследованных нами образцов интенсивность флюоресценции этого фрагмента превышала сигнал, получаемый от фрагмента ггпА размером 1042 п.н.о. В экспериментах с использованием праймеров комплементарных другим последовательностям генов 16S и 23S рРНК (A16LF, A23LR, рис. 16) и спейсерной области (ASEF, ASER, приложение I) непропорциональность сигналов, соответствующих разным копиям рибосомного оперона, также подтвердилась. Степень отклонения от эквимолярности фрагментов в ПЦР-пробах, наблюдаемого нами на электрофореграммах (рис. 17), зависела от источников ДНК-матрицы, физиологического состояния клеток A.laidlawii PG8. Наибольшее количественное различие в амплификации фрагментов оперонов рРНК в области спейсера было зарегистрировано нами на ДНК-матрице клеток A.laidlawii PG8 опытных культур (НПГК и реверсирующие культуры, 1 и пассаж). В то же время, соотношения двух продуктов ПЦР, близкие к эквимолярным, были получены при амплификации ДНК клеток культур, находящихся на стадии экспоненциального роста и в ранней стационарной фазе. В результате анализа данных трансмиссивной микрографии нами было установлено, что исследуемые популяции A.laidlawii PG8 различаются по соотношению клеток обычной морфологии и ультрамикроформ. Субпопуляции этих клеток могут быть выделены и очищены центрифугированием в градиенте плотности перкола [165]. Нами было проведено разделение клеток реверсирующей культуры (РК), выращенной на полноценной среде после длительного голодания (480 суток), и экспоненциально растущей культуры.
