Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Растение как донорно-акцепторная система 13
1.2. Аттрагирующая активность акцепторных органов в системе целого растения 34
1.3. Регуляция цитокининами аттрагирующей активности акцепторов 41
1.4. Аттрагирующий эффект, цитокининов в изолированных листьях 48
1.5. Смена функционального состояния и формирование мезофилла и терминальной флоэмы в онтогенезе листа 66
1.6. Действие цитокининов на структуру и функционирование флоэмы 72
1.7. Действие цитокининов на структуру и функционирование отделенного листа 75
1.8. Регуляция цитокининами роста растительных тканей .80
1.9. Цитокинины и донорная функция листьев 87
2. Материалы и методы исследований
2.1. Объекты исследований 94
2.2. Постановка опытов 98
2.3; Определение площади листовой пластинки 102
2.4. Определение объема запасающих органов 102
2.5. Определение содержания хлорофилла 103
2.6. Изучение феноменологии аттрагирующего эффекта цитокинииов и других биорегуляторов в изолированных листьях 103
2.7. Анализ распределения |4С-ассимилятов в растениях и радиометрическое определение интенсивности фотосинтеза 106
2.8. Изучение поглощения ,4С-БАП растительными тканями 107
2.9. Идентификация и количественное определение эндогенных цитокинииов 108
2.10. Электронная и световая микроскопия 109
2.11. Просветление листьев 110
2.12. Изучение энергозависимости разгрузки ассимилятов в изолированных листьях при действии БАП Ill
2.13. Анализ структуры мезофилла 112
2.14. Изучение действия БАП на динамику роста растительных тканей 114
2.15. Анализ параметров СОг-газообмена листа 114
2.16. Анализ включения ,4С в продукты фотосинтеза 115
2.17. Фракционирование и количественное определение углеводов 116
2.18. Определение аминного азота 117
2.19. Количественное определение белков 118
2.20. Определение осмотического потенциала клеточного сока 119
2.21. Анализ поглощения экзогенной иС-сахарозы тканями листа 120
2.22. Определение рН апопласта 121
2.23. Изучение растяжимости клеточных стенок 121
2.24. Измерение биоэлектрического тканевого потенциала (БЭП) 122
2.25. Измерение рН среды инкубации растительных тканей 123
3. Донор но - акцепторные отношения и их регуляция цитокининами в системе целого растения
3.1. Экспериментальная часть 125
3.1.1. Картофель 125
3.1.2. Чистяк весенний 149
3.1.3. Лютик едкий 166
3.2. Обсуждение результатов 177
4. Структурные и функциональные изменения в изолированных листьях при действии цитокининов
4.1. Экспериментальная часть
4.1.1. Изучение экспериментальной модели 191:
4.1.2. Феноменология аттрагирующего эффекта цитокининов в изолированных листьях 199
4.1.3. Изучение механизма аттрагирующего эффекта цитокининов в изолированных листьях на уровне структуры флоэмы 216
4.1.4. Изучение причины аттрагирующего эффекта цитокининов в изолированных листьях на уровне трансмембранного переноса веществ в системе клеток мезофилл - флоэма 228
4.1.5. Действие цитокининов на мезофилл 230
4.1.6. Изучение механизма цитокинин-зависимого роста растяжением 417
4.2. Обсуждение результатов 270
5. Регуляция цитокининами акцепторных свойств запасающих органов в системе целого растения
5.1. Экспериментальная часть 297
5.2. Обсуждение результатов 318
6. Возможность использования цитокининов для повышения урожайности сельскохозяйственных культур 329
7. Механизмы регуляции и интеграции отношений между производящими и потребляющими ассимиляты органами в системе целого растения 357
заключение 366
выводы 371
Список литературы 374
- Аттрагирующая активность акцепторных органов в системе целого растения
- Смена функционального состояния и формирование мезофилла и терминальной флоэмы в онтогенезе листа
- Изучение феноменологии аттрагирующего эффекта цитокинииов и других биорегуляторов в изолированных листьях
- Изучение механизма аттрагирующего эффекта цитокининов в изолированных листьях на уровне структуры флоэмы
Введение к работе
Рост численности населения нашей планеты на фоне ограниченности размеров пригодных для земледелия территорий вызывает необходимость эффективного управления формированием урожая. В связи с этим важно оптимизировать процессы роста; синтеза, транспорта и отложения органических веществ в запас.
Органы, производящие и потребляющие ассимиляты, образуют в растении единую, хорошо сбалансированную донорно-акцепторную систему (Курсанов, 1961, 1976,. 1984; Мокроносов, 1981, 1983; Мокроносов, Гавриленко, 1992). Донорами обычно являются фотосинтезирующие органы - взрослые зеленые листья, снабжающие ассимилятами все другие органы и ткани; гетеротрофные части растения, как правило, выступают в роли акцепторов. Эти пространственно разделенные элементы донорно-акцепторной системы связаны между собой с помощью флоэмы, по которой фотоассимиляты и некоторые другие метаболиты транспортируются от производящих к потребляющим и запасающим частям растений. Именно флоэмный транспорт является: одним; из важнейших. факторов интеграции физиологических процессов > в растениях на всех уровнях организации (Курсанов, 1976; Туркина, Павлинова, 1981);
В онтогенезе между донорными и акцепторными органами устанавливается сложная взаимосвязь, благодаря которой фотосинтез поддерживается на уровне, необходимом для обеспечения потребностей растения. Однако механизм формирования такой взаимосвязи не ясен. Пока отсутствует даже единое мнение по вопросу-о том, какому типу органов - донорам или акцепторам - принадлежит главенствующая роль в функционировании растения как донорно-акцепторной системы. Согласно одной из существующих точек зрения, определяющую роль играют акцепторы, посылающие сигнал неизвестной природы в сторону доноров и таким образом регулирующие их
7 метаболизм (Мокроносов, 1981, 1983; Dinar, Rudish, 1985; Чиков, 1987; Мокроносов,
Гавриленко, 1992). Вторая сторона функциональной активности акцепторов,заключается в их аттрагирующей способности, т.е. в ориентации транспортных потоков ассимилятов в растениях в сторону потребляющих и запасающих органов и тканей (Кур-санов, 1976; Мокроносов, 1981, 1983; Delrot, Bonnemain, 1985; Соколова, 1986; Бор-зенкова и др., 1988; Но, 1988 и др.). В то же время, существуют данные, показывающие, что изменение донорной функции листьев влияет на аттрагирующую активность акцепторов (Wyse, Saftner, 1982), а транспорт и распределение ассимилятов в растениях могут, контролироваться донорными органами (Penot,. 1963; Курсанов; Павлино-ва; 1967;Rovira; Boven, 1973). Поэтому не случайно некоторые исследователи основную роль в функционировании донорно-акцепторной системы отводят донорам (зонам загрузки, где формируется транспортный- пул ассимилятов) (Turgeon, 1987; Patrick, Offler, 1996; Patrick, 1997; Komor, 2000): Ряд авторов склоняется^ модели с двумя активными центрами;управления транспортом и распределением ассимилятов в растениях (Schulz, 1993; 1997; Oparka, Turgeon, 1999);
Воззрения последней! группы, авторов в= наибольшей степени согласуются с представлениями о регуляторных механизмах флоэмного транспорта'ассимилятов в растениях, основанными на закономерностях, вскрытых^ Мюнхом (Munch, 1930). Движущей силой транспорта ассимилятов; он считал градиент давления в проводящих путях, возникающий в результате; формирования градиента осмотического потенциала (Дуя) вдоль флоэмы. Данные ряда авторов, указывают также на то, что транспорт ассимилятов в:растениях контролируется, в основном, на;уровне загрузки; веществ в листе - доноре и их разгрузки в акцепторных органах и тканях, т.е. в начале и конце транспортного пути (Eshricfa, 1970; Geiger, 1975; Курсанов, 1976; Гамалей, 1990; 1994, 2002; Oparka, Turgeon, 1999; Oparka, Santa Cruz, 2000; Вилленбрик, 2002 и
8 др.). На промежуточных этапах флоэмный транспорт, очевидно, поддерживается дополнительными двигателями, основанными на латеральном перераспределении метаболитов между ситовидными элементами и паренхимными; клетками флоэмы ю контрактильных изменениях белков актин-миозинового комплекса (Туркина, Соколова, 1972; Соколова, 1972; Курсанов, 1976; Туркина, Куликова, 1982; Kursanov et al.,1983). Однако в целом механизмы, контролирующие транспорт и распределение ассимилятов в растениях, не ясны.
Литературные данные указывают на то, что метаболизм и транспорт ассимилятов в растениях находятся под гормональным контролем. Причем по характеру и интенсивности оказываемых эффектов среди растительных гормонов:на первом месте находятся цитокинины. Они способны влиять на все стороны донорно-акцепторных отношений: формирование и функционирование фотосинтетического аппарата; транспорт и распределение ассимилятов в растениях, рост, развитие хозяйственно ценных: органови отложение в них запасных питательных веществ (Кулаева; 1973; Соколова, 1986; Муромцев и др.,1987; Борзенкова и др., 1988; Чернядьев, 1993,2001).
Одним из наиболее важных физиологических эффектов этих фитогормонов является аттрагирующая способность, которая проявляется в ориентации транспортных потоков ассимилятов в сторону обогащенных, цитокининами органов и тканей, (Mothes et al,, 1959; Курсанов;. 1976; Леопольд, 1968; Кулаева, 1973; Соколова, 1986; Борзенкова и др., 1988; Но, 1988 и др.). Феноменологически аттрагирую ще е действие цитокининов неоднократно; наблюдали многие авторы на модельных системах различной степени сложности и целых растениях, но его механизм пока неизвестен.
Возможно, аттрагирующий эффект связан со способностью цитокининов активировать метаболизм растительных тканей, стимулировать ростовые и биосинтетические процессы в них (Кулаева, 1973, 1982; Дефлинг, 1985; Муромцев и,др;, 1987 и
9 др.). Метаболизация притекающих соединений должна интенсифицировать разгрузку ассимилятов из окончаний ситовидных элементов и увеличивать концентрационный градиент вдоль флоэмы (Wardlaw, 1968М 999), усиливая передвижение веществ к акцепторам по Д^ под влиянием разности: давления в проводящих: путях, что следует из современных воззрений: о движущих силах флоэмного транспорта, основанных на: осмотической гипотезе массового тока ассимилятов Мгонха (Munch, 1930),
Однако не исключено, что цитокинины влияют непосредственно на транспортные процессы. Тогда активация метаболизма растительных тканей может быть вызвана; усиленным і притоком; к акцепторам питательных веществ; являющихся субстрата-ми; для биосинтетических реакций:
Предпринятые к настоящему времени ; попытки разделить,транспортные и метаболические ответы на фитогормоны не позволили однозначно решить эту дилемму. Оказалось, что возможна активация цитокининами метаболических процессов без дополнительного притока веществ (Osborne, 1962; Кулаева, Воробьева, 1962; 1964), что позднее было подтверждено во многих экспериментах in vivo и in vitro. В то же время, обнаружено изменение транспортных процессов, происходившее вне зависимости от метаболических ответов растительных тканей на цитокинины;(Turveу, Patrick, 1979).
Таким образом, существующие в литературе сведения о механизме регуляции транспорта и распределения ассимилятов в растениях, в том чи еле,, с участием цитокининов, неоднозначны. Слабая изученность вопроса, очевидно; связана с исключительной сложностью растения как донорно-акцепторной системы и интегральным характером процессов транспорта и распределения веществ: Поэтому начинать изучение механизма действия цитокининов на транспортные процессы целесообразно не на целом, растении, состоящемиз большого числа доноров и конкурирующих за ассими-ляты акцепторов, а на более простых модельных системах;
10 Удачной моделью является изолированный лист, преимущество которого по сравнению с листом на растении состоит в том, что он освобожден от множественного контроля со стороны целого растения (Мокроносов,1981, 1983). Кроме того, отделенные листья лишены притока цитокининов из корней (Кулаева, 1962, 1964) и потому более чувствительны к экзогенному; цитокинину. Донором ассимилятов в изолированных листьях является мезофилл, акцепторами - средняя жилка черешок, в которых: депонируются оттекающие из мезофилла продукты фотосинтеза (Leonard, 1939; Gunning, Barkley, 1963; Hartt, 1963; МШІег, Leopold, 1966; Leonard, King, 1968 и др.).
Именно на этой модельной системе была обнаружена аттрагирующая способность цитокининов. К. Мотес, Л. Энгельбрехт и О.Н., Кулаева (Mothes etal., 1959) впервые наблюдали, что кинетин, нанесенный на одну половинку взрослого изолированного листа (Тормозит: отток подвижных метаболитов: из листовой, пластинки^ в, среднюю жилку и черешок и индуцирует их приток из необработанного участка листа в обработанный. Таким образом, было показано, что под влиянием цитокинина в листе формируется новый:акцептор, функционирующий параллельно с естественными акцепторами - черешком и средней жилкой.
Феноменологически аттрагирующий эффект цитокининов в изолированных листьях описан достаточно подробно, однако представления о его механизме носят разрозненный и противоречивый характер (Mothes et al., 1959; Mothes, I960; 1964; Mothes, Engelbrecht, 1961; Mttller, Leopold, 1966; Nakata, Leopold; 1967; GersanU Kende, 1982; Kuraishi, Ishikawa, 1977; Penot etal., 1981; Соколова, Балакшина, 1992; Соколова и др., 2002; Парамонова и др., 2002). Хотя многие авторы считают, что из донорнои в акцепторную половинку листа вещества притекают по флоэме, в месте нанесения фитогормона разгружаясь в мезофилл (Mtlller, Leopold, 1966; Penot, 1978; Gersani, Kende, 1982), транспортные пути ассимилятов при этом эффекте изучены не- достаточно. Еще менее выяснены конкретные механизмы формирования акцепторной способности тканей зрелого отделенного листа под действием цитокинина.
В целом, оставались неясными и требовали дальнейшего изучения механизмы интеграции функционально различных органов и тканей растения в единую донорно-акцепторнуго систему и факторы, контролирующие флоэмный транспорт и распределение ассимилятов. Не была определена и роль цитокининов в регуляции: этих процессов как в модельных донорн о-акцепторных системах (в том числе, изолированном листе), так и в целых растениях.,Выяснение этих вопросов важно с теоретической; точки зрения и; кроме того, имеет большое значение для прикладных разработок в области растениеводства и биотехнологии для эффективного управления количеством и качеством урожая.
При исследовании этой проблемы мы сосредоточили внимание на: изучении* растений с симпластной разгрузкой ассимилятов в акцепторах. Апопластную разгрузку ассимилятов, осуществляющуюся на границе между двумя организмами (растением-хозяином и паразитом, двумя поколениями в семенах), по-видимому, следует рассматривать как перегрузку ассимилятов из транспортной системы одного организма в другой (Гамалей, 2002). Ее регуляция, вероятно, осуществляется на уровне транспортных процессов на мембранах.
Целью работы явилось изучение механизмов, контролирующих транспорт и распределение ассимилятов в растениях и интегрирующих фотосинтезирующие; проводящие и потребляющие ткани и органы в единую донорно-акцепторную систему и выяснение роли цитокининов в регуляции этих процессов..
В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи::
1. Проанализировать донорно-акцепторные отношения и возможные механизмы их регуляции в норме и при изменении донорно-акцепторного баланса у растений
12 с морфологически различными типами акцепторов.
Проследить влияние цитокининов на транспорт и распределение ассимилятов в системе целого растения и модельной донорно-акцепторной системе — изолированном листе.
Выявить специфику действия цитокининов на функционирование донорных и акцепторных органов; определить роль этих двух типов органов в регуляции транспорта и распределения ассимилятов в системе целого растения в связи с регулятор-ным действием цитокининов.
Выяснить механизм аттрагирующего эффекта цитокининов в модельной системе - изолированном листе, изучив следующие возможные причины этого явления:
Индукция цитокининами структурных перестроек клеток флоэмы, приводящих к изменению направления транспорта веществ между мезофиллом и флоэмой за счет торможения загрузки ассимилятов во флоэму и индукции их разгрузки в мезофилл;
Влияние цитокининов на работу активной транспортной системы, осуществляющей перенос Сахаров через клеточные мембраны в системе мезофилл - флоэма;
Активация цитокининами структурных и функциональных изменений клеток мезофилла, приводящих к формированию Ац/р между донорной и акцепторной частями листа,
5. Изучить механизм аттрагирующего эффекта цитокининов в системе це лого растения, опираясь на данные, полученные на модельной донорно-акцепторной системе - изолированных листьях.
Проследить на примере цитокининов взаимосвязь между сигналами гормональной, осмотической и метаболитной природы при регуляции функционирования растения как донорно-акцепторной системы.
Разработать технологию повышения продуктивности сельскохозяйственных растений (на примере картофеля и томатов) с помощью БАП
Основные положения, выносимые на защиту:
Интенсивность, направленность транспорта ассимилятов и их распределение в растении контролируются функциональной активностью как донорных, так и акцепторных органов, причем наиболее эффективно - при одновременном участии этих двух элементов донорно-акцепторной системы,
Фактором интеграции различных частей растения в единую донорно-акцепторную- систему и движущей силой флоэмного транспорта веществ является градиент давления вдоль транспортного пути, формирующийся вследствие существования Ау/р между производящими и потребляющими ассимиляты органами.
Величина /S.y/P вдоль транспортного пути, определяющая интенсивность и направленность транспортных потоков фотоассимилятов в растениях, контролируется цитокининами на внутриклеточном уровне путем регуляции ростовых и метаболических процессов в донорных и акцепторных органах.
4.. Специфика ответных реакций органов и тканей растения на цитокинин определяется их онтогенетическими особенностями. В производящих ассимиляты органах цитокинин стимулирует процессы, определяющие их донорную, а в органах, потребляющих ассимиляты, - акцепторную функцию.
5. Донорная способность органов и величина осмотического потенциала (tf/p) в начале транспортного пути определяется размером транспортного пула ассимилятов, формирование которого зависит от соотношения процессов, протекающих в
14 клетках мезофилла: углеводной или неуглеводной направленности метаболизма, использования углерода на эпигенетические процессы, отложения і в виде запасных соединений или включения в транспортные формы ассимилятов.
Акцепторные свойства! органов и тканей определяются процессами, повышающими ц/р в конце транспортного пути: ростом растяжением и накоплением запасных, в первую очередь, полимерных и/или гидрофобных соединений, которые выходят из транспортного пула клеток.
Функционирование акцепторов, утилизирующих притекающие соединения, обеспечивает возможность постоянного притока ассимилятов из донорных в акцепторные органы в онтогенезе.
Работа выполнена: на кафедре агрономии Калининградского государственного технического университета. В ней представлены результаты 18-летних (1987-2004 г.г.) исследований.
За постоянное внимание к работе и ценные советы искренне благодарю: научного консультанта, действительного члена РАН, доктора биологических наук, профессора А.Т. Мокроносова (ИФР РАН). От души благодарю В.П. Холодову, СВ. Соколову; О.Н Кулаеву, Вл.В; Кузнецова,1 В.А. Хохлову (ИФР РАН), Ю.В: Гамалея, М;В. Пахомову, H.G. Мамушину, Н.С. Филиппову (БИН РАН), Е.В; Белынскую,.В.В. Кондратьеву (ГБС РАН), В.В. Полевого, Е.И; Шарову (БИНИИ С.-ПбГУ), а также других моих коллег за ценные теоретические и методические рекомендации, данные при і выполнении и обсуждении отдельных этапов работы. Я благодарна также О. Н; Семихатовой (БИН РАН); Е.Б. Кириченко (ГБС РАН), В.П. Холодовой, О.Н. Кулае-вой; Ю.Г. Молотковскому (ИФР РАН), В.В; Полевому (БИНИИ С.-ПбГУ) за любезно предоставленную возможность использовать экспериментальную базу возглавляемых; ими лабораторий для проведения отдельных этапов исследований.
Аттрагирующая активность акцепторных органов в системе целого растения
Учитывая важную роль акцепторов в функционировании растения как донорно-акцепторной системы, необходимо выяснить, каким образом контролируется активность акцепторов ассимилятов и регулируется приток ассимилятов к ним: Единая количественная характеристика, позволяющая сравнивать аттрагирую-щую активность акцепторов, отсутствует. Обычно ее выражают либо в количестве притекающих соединений (обычно меченых) в тот или иной орган в единицу времени, либо практически ставят, знак равенства между аттрагирующей способностью и размерами, скоростью роста органа или накоплением в нем сухого вещества. Между, тем, прямая взаимосвязь между этими параметрами не доказана. Кроме того, соотношение между накоплением ассимилятов и их использованием в дыхании может быть, различным. Я. Хо (Но, 1989), подчеркивая, что аттрагирующая способность генетически детерминирована и является производной от размера: и активности акцептора, предлагает использовать следующие показатели акцепторной способности органов:: Sink strength (аттрагирующая активность акцептора) — способность органа импортировать ассимиляты; Apparent sink strength (видимая активность акцептора) - аттрагирующая активность акцептора, измеренная по абсолютной скорости роста или скорости накопления сухого вещества. Actual sink strength (действительная активность акцептора) - скорость импорта ассимилятов, измеренная как разность между поглощением углерода и его использованием в дыхании акцептора. Potential sink strength (потенциальная активность акцептора) - генетически детерминированная способность притягивать ассимиляты, посылая запрос на них в соответствии с факторами среды для оптимального функционирования акцептора. Однако эта классификация пока не используется, в русскоязычной терминологии для обозначения величины и функциональной активности акцепторов используют практически равнозначные понятия «аттрагирующая; способность», «аттраги- рующая активность», «аттрагирующая сила», «акцепторная способность» и пр; Несомненно, акцепторы являются функционально активными тканями-и органами; Существует три основных проявления их функциональной активности: 1). Регуляция- интенсивности- и качественной- направленности фотосинтеза. 2). Аттраги-рующее действие,-т.е. ориентация транспорта: фото ассимилятов, в растении: в: свою; сторону. 3).
Возможно,-акцепторы посылают к; донору сигналы пока неизвестной природы с информацией о «запросе» на ассимиляты, которые, по-видимому, и составляют основу обратной связи в эндогенной регуляции фотосинтеза. Если:регуляторные механизмы первого эффекта изучены и описаны настолько подробно, что это позволило разработать целую схему эндогенной регуляции фотосинтеза в системе целого растения (Мокроносов, Гавриленко, 1992); то в отношении: двух других.явлений пока много неясного; Именно эти вопросы, в настоящий момент требуют самого серьезного изучения. Более того, формирование акцепторами:«запроса» на ассимиляты и их аттрагирующая активность, на наш взгляд, настолько взаимосвязанные явления, что изучать и рассматривать их надо только совместно;. Весьма; вероятно, что их механизмы могут оказаться сходными или общими. Чем: определяются акцепторные свойства: потребляющих и? запасающих: зон растения- пока неизвестно; В течение длительного времени исследования многих авторов 5были направленььна: поиск:материальных носителей: «запроса», посылаемого, как предполагали, акцепторными тканямив сторону донора и регулирующего егоме-таболизми транспорт ассимилятов в растении в целом (Курсанов, 1976; Мокроносов, 1981). Властности, считали, что носителем запроса может быть сигнал биоэлектрической природы; который генерируется;.в-меристеме или тканях запасающих органов. Полагали, что, поступая; в лист, такой-сигнал индуцирует транспорт ассимилятов и усиливает фотосинтез. Хотя довольно часто удается регистрировать распространяющиеся: по: флоэме потенциалы действия; которые, ПО: мнению ряда авторов; могут иметь, информационное значение (Синюхин; 1972; Мамулашвили и др., 1973; Опри-тов, Мичурин, 1973; Курсанов, 1976), все же оказалось, что лишь некоторые, реакции растительного организма;регулируются с помощью электрофизиологических сигналов. К таким;реакциям;относятся, например, сейсмонастические движения у Mimosa: pudica или тигмонастии! у ряда, насекомоядных растений (Гунар, Синюхин, 19 62)., Не: исключено, что с. передачей электрического импульса связаны- некоторые эффекты ауксина (Полевой; 1986). Однакопока нет оснований для распространения: этого механизма на регуляцию донорно-акцепторных связей в растениях. Некоторые авторы.; отмечают взаимосвязь между притоком і ассимилятов; к акцепторам и интенсивностью роста последних.
Обзор этих сведений приведен,.в частности, Ф.М. Куперман; (1984). Действительно, все активно растущие органыи ткани являются активными акцепторами. Поскольку рост клеток включает: две фазы, деление и; растяжение, роль каждого из этих процессов в создании аттрагирующей способности акцепторных зон растения в обсуждается в литературе достаточно активно.
Смена функционального состояния и формирование мезофилла и терминальной флоэмы в онтогенезе листа
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют об «омолаживающем действии» цитокишшов на срезанные листья, выражающемся в задержке их старение и восстановлении изменений в обмене веществ и структуре клеток листа, уже произошедших в ходе старения (Курсанов и др., 1964; Кулаева, 1973, 1982; Муромцев и др., .1987 и др.). Аналогичное явление проявляется и на уровне транспортных процессов, поскольку именно снижение аттрагирующей способности клеток является одним из характерных признаков старения листьев (Mothes, 1961а, о). Обработка ци-токинином усиливает акцепторные свойства зрелого и даже стареющего листа, и, более того, изменяет его функциональное состояние. Участок листа, уже закончившего рост и являющегося донором веществ, под влиянием цитокинина вновь становится акцептором, а направление флоэмного транспорта веществ в нем меняется. на противоположное, т.е. лист возвращается в состояние, характерное для молодых импортирующих ассимиляты листьев. С чем связана такая смена импортно-экспортных функций листа под действием фитогормона, пока не известно. Но поскольку цито-кинин вызывает в листе функциональные изменения, противоположные происходящим в онтогенезе, возможно, он влияет на какие-то процессы, ответственные за переход листа от импорта чужих к экспорту собственных ассимилятов.
Смена функционального состояния листа и становление транспортных коммуникаций в развивающемся листе хорошо изучены. Показано, что существует пространственное и временное разделение транспортных процессов. Молодые листья являются акцепторами ассимилятов (Fellows, Geiger, 1974; Dickson, Larson, 1975; Кур-санов, 1976; Isebrands et al., 1976; Мокроносов, 1981; Schmalstig, Geiger, 1985, 1987; Ding et al., 1988; Turgeon, 1989; Гамалей, 1990 и др.). Притекающие в них из нижележащих листьев ассимиляты разгружаются в мезофилл симпластически через ситовидные элементы еще незрелых жилок 3-4 порядков, в ходе развития - листа превращающихся в сравнительно крупные жилки (Turgeon, 1986, 1989, Ding et al., 1988). Во время роста листа фронт разгрузки- движется вместе с процессом- дифференциации вновь образующихся ситовидных элементов:вдоль прокамбиального тяжа от основания к верхушке (Гамалей, 1990). Большинство авторов считает, что разгрузка ассимилятов из флоэмы в мезофилл в ювенильном листе целиком идет по симпласту по градиенту концентрации, создаваемому за счет потребления.веществ растущими клетками мезофилла, и не требует энергетических затрат (Fellows, Geiger, 1974; Schmalstig, Geiger, 1985, 1987; Ding et al., 1988; Turgeon, 1989; Гамалей, 1990).
При достижении І листом Уз-У окончательного размера приток веществ в него прекращается; и лист переходит к экспорту собственных продуктов фотосинтеза (Jones et al., 1959; Shiroya et al., 1961; Jones, Eagles, 1962; Hopkinson, 1964; Thrower, 1964; Stella, 1967; Suzuki, Mortimer, 1973; Turgeon, Webb, 1973; Fellows, Geiger, 1974; Hoddinott, Swanson, 1975; Курсанов, 1976 б; Мокроносов, 1981, 1983 а, Гамалей, 1990). Причина этого явления пока не ясна, поскольку в одно и то же время в развивающемся листе происходит целый ряд структурных и функциональных перестроек. Во-первых, в листе заканчивается формирование фотосинтетического аппарата: Вследствие усиления фотосинтетической функции листа на фоне уменьшения потребления углерода на ростовые процессы в клетках мезофилла устанавливается положительный баланс углерода. Именно этот фактор некоторые исследователи считают решающим для перехода листа от импорта чужих к экспорту собственных ассимилятов (Turgeon, Webb, 1976; Ho, 1988).
Одновременно с этим изменяется направленность фотосинтетического метаболизма в сторону синтеза транспортных форм углерода, что может быть еще одной: возможной причиной формирования донорной функции листа (Курсанов. 1976; Turgeon, Webb, 1976; Мокроносов, 1981).
Однако листья бесхлорофилльного мутанта табака прекращали импортировать ассимиляты одновременно с листьями нормального зеленого растения, хотя были неспособны к фотосинтезу. На основании этого было выдвинуто предположение, что причиной смены функционального состояния листа являются необратимые онтогенетические структурные и функциональные изменения транспортного пути, одни из которых тормозят разгрузку ассимилятов из флоэмы в мезофилл, а другие способствуют загрузке флоэмы (Turgeon, 1984,1986).
Поскольку одновременно со сменой импортной функции листа на экспортную клетки мезофилла переходят от деления к росту растяжением, что сопровождается формированием и развитием системы межклетников, по мнению Р. Тужона (Turgeon, 1984, 1986), разгрузка флоэмы (и, следовательно, импорт ассимилятов) прекращается в результате нарушения симпластических связей между мезофиллом и флоэмой в ходе естественного роста листа и формирования межклетников.
Начинающийся экспорт ассимилятов из листа (этот процесс развивается в направлении от верхушки к основанию листовой пластинки) связывают с образованием свободных терминалей и дифференциацией «загрузочных узлов» в виде комплексов клетка-спутница - ситовидный элемент, формирующихся в терминальной флоэме (жилках 2 последних, чаще 5-6, порядков ветвления) (Гамалей, 1990). Ю.В. Гамалей (1994) отмечает, что под влиянием импортного потока ассимилятов при инициации меристематическои активности и распускании листьев развивается эн до плазматическая сеть (Э С) в акропетальном направлении. В этом же направлении ветвятся и разделяются плазмодесмы. Первоначально идущий в делящиеся клетки листа приток ассимилятов останавливается, когда в мезофилле нарастает число хло-ропластов и их фотосинтетическая продуктивность, что приводит к исчезновению: градиента концентрации ассимилятов. В клетках мезофилла за счет ЭС появляются полостные элементы, которые постепенно преобразуются в. центральную вакуоль. Давление вакуоли некоторое время .уравновешивается растяжением оболочки клеток. Кода сопротивление оболочки становится выше сопротивления плазмодесм; начинается экспорт ассимилятов из клеток мезофилла по ЭС. Развитие экспорта проявляется в движении и ветвлении ЭС и плазмодесм в базипетальном направлении. Благодаря работам Ю.В. Гамалея (Гамалей, 1986, 1990, 19.94; Гамалей, Пахомо-ва, 1989 и др.) выяснено, что в растительном мире существуют два принципиально различных пути, по которым происходит развитие и созревание клеток-спутниц фло-эмных термин алей (жилок), приводящих к формированию мелких жилок двух типов.
Изучение феноменологии аттрагирующего эффекта цитокинииов и других биорегуляторов в изолированных листьях
Пигменты экстрагировали их свежего растительного материала 80 или 100% ацетоном с добавлением MgCOj. Содержание хлорофилла определяли по Вернону при длинах волн 665 и 649 нм или Веттштейну при длинах волн 662 и 644 (Гавриленко и др., 1975). Оптическую плотность вытяжки (Z ) измеряли на спектрофотометрах СФ-25А, СФ-46 (Россия) или «Specol-11» (Carl Zeiss, Германия). Концентрацию суммы хлорофиллов а и b (СЫа+ь) рассчитывали по формулам: Постановка опытов для изучения транспорта и распределения веществ в изолирован- ных листьях соответствовала схеме, разработанной К. Мотесом и др. (Mothes et al;, 1959) (рис. 1). Правую половинку листа обрабатывали раствором одного из фиторегу-ляторов (БАП, зеатина, ИПА или их рибозидов, фузикокцина, АБК),. левую - водой. Концентрацию биорегуляторов и время предобработки участка листа ими для максимального развития эффекта подбирали предварительно. Во всех случаях она составляла 48, для фузикокцина — 72 ч. Через определенное время (обычно 48 ч) после нанесения регулятора на участок листа диаметром 1 см наносили 20 мкл 50 MM[U14C]-сахарозы (удельная активность 30 кБк/мл) для регистрации транспортных процессов. Время:распределения 14С-сахарозы обычно составляло 24 ч. При изучении торможения оттока веществ С наносили на обработанную фиторегулятором половинку листа, для анализа индукции притока — на обработанную водой. Для облегчения проникновения сахарозы предварительно удаляли верхний эпидермис, локально обрабатывая, поверхность листа в месте нанесения сахарозы наждачной бумагой № 0. Эти исследования были проведены на зрелых листьях, у которых аттрагирующий эффект цитоки-нина проявлялся наиболее четко. Изучали также действие БАП на транспорт и.распределение эндогенных: С-фотоассимилятов. Для этого изолированный лист, правая половинка которого была обработана 10"4 М раствором БАП в течение 1-48 ч, после предварительного 5 мин освещения и адаптации выдерживали 2 мин в экспозиционной камере в атмосфере с 14СОг (концентрация С02 0.5%, удельная активность, 14СОг 9.78 ГБк/моль, интенсивность света 120 Вт/м2 ФАР (лампа ДРФ-1000 с водным экраном), температура 22-24СС). Время распределения 14С составляло от 3 до 48 ч. В этих опытах распределение радиоактивности в листе определялось суммой обоих эффектов цитокинина — торможения оттока и индукции притока.
В конце эксперимента лист расчленяли на левую, правую половинки и черешок. со средней жилкой. Каждую часть фиксировали в смеси равных объемов концентрированных растворов хлорной кислоты и перекиси водорода (Daie et al., 1986) и растворяли в этой смеси в течение 24 ч при 55 С (Giaquinta et al., 1983; Daie et al., 1986). Из каждой части брали аликвоту, просчитывали ее радиоактивность по черенковско-му излучению (сцинтиллятор Брея на основе 1.4-диокеана, жидкостно-сцинтилляци-онный -спектрометр 1219 RackBeta Spectral («LKB-WaUac», Финляндия) и рассчитывали радиоактивность левой, правой половинки листа и черешка со средней жилкой. Для количественной оценки транспорта и распределения веществ суммарную радиоактивность всего листа принимали за 100%,.и радиоактивность каждой части: выражали в процентах от этой величины. Уменьшение (увеличение) процента радиоактивности рассматривали как свидетельство оттока (притока) веществ. Повторность опытов была трех-пятикратной, воспроизведение - пятикратным. Анализ распределения 14С-ассимилятов по растению и радиометрическое измерение интенсивности фотосинтеза проводили с помощью 14С (Заленский и др., 1955); Для введения 14С растение помещали под стеклянный колпак и через 10 мин, после выхода фотосинтеза на стационарный уровень, экспонировали в атмосфере с СОг-Условия экспозиции растений были следующими: при определении; истинного фотосинтеза концентрация СОг составляла 0.035%, удельная активность 4 МБк/моль СОг, время экспозиции - 30 сек, при определении потенциального фотосинтеза концентрация С02 - 1.0%, экспозиция 10 мин, удельная активность 8 МБк/моль СОг; при оценке распределения С по растению концентрация СОг - 0.5%, удельная активность 4 МБк/моль СОг, экспозиция 20 мин. Температура воздуха была равна 18-22С в зависимости от изучаемого объекта; интенсивность света - 600-1000 Вт/м2 ФАР (лампа ДРФ-1000 с водным экраном либо естественное освещение). После, экспозиции в 14СОг растительные ткани фиксировали: при определении фотосинтеза - подкисленным этанолом (100 мл 96% этанола с добавлением 1 мл 10% уксусной кислоты), при изучении распределения 14С - при 105С и высушивали при 50-60С. Для оценки оттока ассимилятов и для того, чтобы не принимать во внимание потери 14С на дыхание, радиоактивность каждого органа растения выражали в процентах от суммарной радиоактивности всех органов, которую принимали за 100%. Уменьшение (увеличение) процента радиоактивности в органе по сравнению с исходной пробой рассматривали как свидетельство оттока (притока) ассимилятов. Радиоактивность просчитывали путем жидкостно-сцинтилляционной спектрометрии как описано в п. 2.6 или на торцовом счетчике аппарата «Волна» («Изотоп», Россия) с учетом коэффициента самопоглощения. Воспроизведение и биологическая повторность опытов были трехкратными.
Изучение механизма аттрагирующего эффекта цитокининов в изолированных листьях на уровне структуры флоэмы
Поскольку не исключено было участие флоэмы в реализации аттрагирующего эффекта цитокинина в изолированных листьях (Miiller, Leopold 1966 a; Nakata, Leopold, 1967; Leonard, King, 1968; Penot et al., 1981; Gersani, Kende, 1982), мы изучили действие БАП на структурную организацию этой ткани у листьев тыквы и бобов, имевших открытую и закрытую терминальную флоэму соответственно. Систему жилкования изучали у листьев интактных растений тыквы и бобов, а также у половинок изолированного листа, одна из которых была опрыснута водой, а другая БАП на тех фазах развития листа, на которых проявлялся аттрагирующий эффект цитокининов, т.е. на достигших 50, 100 % Smax и стареющих листьях. У обоих растений жилкование было перистым (разновидность сетчатого, с одной главной жилкой). Мелкими жилками (к которым принято относить жилки двух последних порядков ветвления) у них были жилки 5-6 порядков. У тыквы ареолы были небольшими, средняя площадь одной ареолы в растущих листьях была равна 0.03 мм2, в зрелых и стареющих — 0.10. Свободные окончания внутри ареол практически отсутствовали. Лишь 13-15% ареол у растущих и около 25% у зрелых и стареющих листьев содержали по одному неветвящемуся окончанию (табл. 27). Мелкие жилки в листьях бобов образовывали более сложную анастамозную сеть со свободными простыми или разветвленными окончаниями внутри ареол. В листьях этого растения ареолы были достаточно крупными.
Средняя площадь одной ареолы составляла в растущих листьях около 0.35 мм2, в зрелых и стареющих - около 0.40. Чуть менее половины ареол не содержали свободных окончаний, большая часть (около 40%) ареол І имела по одному неразветвл енному окончанию, около 10% - по два простых неразветвленных окончания, около 4% — по одному разветвленному окончанию и в 0.1-0.2% случаев в ареоле содержалось либо по 3 простых, либо по 2 разветвленных окончания проводящей системы (табл. 28). Результаты количественной оценки жилкования в опытном и контрольных ва риантах показали, что обработка половинки листа БАП (опыт), как и просто его срезание (контроль) ни у тыквы, ни у бобов не изменяли жилкования.
На всех изученных стадиях развития листа оставались постоянными число порядков ветвления, число свободных окончаний в ареоле,площадь одной ареолы и общее число ареол в одной половинке листа (табл. 27, 28). Хотя клеточный состав мелких жилок и ультраструктурная организация их отдельных элементов в норме у листьев тыквы и бобов были изучены ранее другими авторами (Ziegler, 1965; Turgeon et al„ 1975; Гамалей, 1990 и др.), было необходимо провести их предварительное изучение как контрольного варианта. В состав мелких жилок листа тыквы и бобов входило несколько типов клеток: трахеальные (а у тыквы и паренхимные) элементы ксилемы, ситовидные и паренхим-ные элементы флоэмы. Последние подразделялись на две разновидности: собственно клетки флоэмной паренхимы и клетки-спутницы, участвующие в загрузке ассимиля-тов из мезофилла во флоэму и встречающиеся только в мелких жилках (рис. 38). На поперечных срезах листья тыквы имели симметричные биколлатеральные мелкие жилки с двумя флоэмными полюсами (рис. 38 а). Однако, как известно (Schmitz et al., 1987; Гамалей, 1990), в жилках подобного типа адаксиальный полюс изолирован от мезофилла и потому не принимает участия в загрузке флоэмы. Загрузка идет на противоположном - абаксиальном - полюсе благодаря наличию в нем специализированных «загрузочных узлов» - симпластически связанных с мезофиллом комплексов клетка-спутница - ситовидный элемент. Поэтому именно этот участок терминальной флоэмы и подвергали электронно-микроскопическому контролю. Проводящие пучки на поперечных срезах листьев бобов были коллатеральными (то есть имели лишь один флоэмиый полюс) и симметричными. Флоэма состояла из двух блоков. В состав каждого из них входили один - два ситовидных элемента и две спутницы. Блоки располагались друг над другом в направлении от палисадного к губчатому мезофиллу и были разделены паренхимными клетками флоэмы (рис. 38 б).
