Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Общая характеристика фенольных растительных соединений 7
1.2. Свойства флавоноидов 15
1.3. Хмель как источник биологически активных веществ 23
1.4. Стабилизация качества пива с использованием антиоксидантов 30
1.4.1. Химический состав пива 30
1.4.2. Окислительные процессы в пиве и факторы, влияющие на их интенсивность 39
1.4.3. Система коллоидной защиты пива 46
1.4.4. Перспектива использования хмелевых экстрактов 49
2. Экспериментальная часть 52
2.1. Материалы и методы исследования 52
2.2. Результаты и их обсуждения 60
2.2.1. Характеристика хмелевого сырья 60
2.2.2. Разработка способа экстракции фенольных соединений хмеля 71
2.2.2.1. Влияние физических и химических параметров экстракции хмеля на выход и качественный состав фенольных соединений 71
2.2.2.2. Влияние величины гидромодуля на экстракцию фенольных соединений хмеля 90
2.2.2.3. Разработка технологической схемы получения экстракта хмеля 94
2.2.3. Исследование антиоксидантной активности экстрактов хмеля 99
2.2.3 1. Исследование антиоксидантной активности препаратов флавонолов 99
2.2.3.2. Исследование антиоксидантной активности экстрактов различных сортов хмеля 108
2.2.4. Исследование влияния экстрактов хмеля на качество пива 123
2.2.4.1. Выбор показателей, характеризующих стабильность пива 123
2.2.4.2. Исследование влияние хмелевых экстрактов на физиологическую активность дрожжей 126
2.2.4.3. Исследование влияния экстракта хмеля на стабильность пива при хранении 137
Выводы 141
Список литературы
- Хмель как источник биологически активных веществ
- Окислительные процессы в пиве и факторы, влияющие на их интенсивность
- Разработка способа экстракции фенольных соединений хмеля
- Исследование антиоксидантной активности препаратов флавонолов
Введение к работе
Актуальность работы
'і В современных пищевых технологиях широко используются
антиоксиданты, которые позволяют значительно продлить сроки хранения продуктов и повысить их биологическую ценность. Хмель является богатейшим источником биологически активных веществ, в том числе антиоксидантного
^ действия. <
Использование антиоксидантов в пивоварении позволяет увеличить сроки хранения пива за счет снижения скорости окислительных процессов. Для замедления окисления в пиво вводят разрешенные антиоксиданты, однако эти «чужеродные» для пива вещества могут отрицательно влиять на органолептические показатели. Поэтому именно для пивоварения хмель может
і быть перспективным источником антиоксидантов. Однако технология
хмелевых продуктов с высокой антиоксидантной активностью до настоящего времени не разработана.
Разработка технологии получения хмелевых экстрактов, позволяющей сохранить антиоксиданты в активной форме, является актуальной, поскольку она расширит возможности использования хмелевого сырья, в том числе хмелевых отходов. Такие хмелевые продукты могут быть использованы как
v антиоксидантные и биологические добавки в пивоварении для увеличения
сроков хранения пива и повышения его биологической ценности.
Цель и задачи исследования
ш Основной целью диссертационной работы являлась разработка способа
получения экстракта хмеля, обладающего антиоксидантной активностью и
. изучение его влияния на стабильность пива при хранении. Для достижения
поставленной цели необходимо решение следующих задач:
^ 1) разработка технологии экстракта хмеля с высокой антиоксидантнои
активностью;
2) изучение антиоксидантнои активности экстрактов хмеля и чистых
препаратов флавонолов по отношению к различным активным формам
^ кислорода в модельных системах;
3) получение хмелевого экстракта с высокой антиоксидантнои
активностью и изучение его состава и свойств;
4) исследование влияния чистых препаратов флавонолов хмеля и
полученного хмелевого экстракта на стабильность пива при хранении.
л і
і Научная новизна
Впервые изучена ант иоксидантная активность компонентов хмеля по отношению к различным активным формам кислорода.
Впервые установлен диапазон интенсивности у-излучения, в котором
соединения экстракта хмеля проявляют свою антиоксидантную активность и
идентифицированы продукты радиолиза хмелевого экстракта обращенно-
фазовым методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Показано
образование под действием у-излучения новых устойчивых форм фенольных
соединений хмелевого экстракта.
Установлены параметры экстракции хмеля, позволяющие повысить
содержание в экстракте флавоноидов, обладающих антиоксидантнои
ш активностью.
6 Определены условия подавления образования альдегидов «старения»
пива чистым препаратом кверцетина и экстрактом хмеля. Показана большая
эффективность экстракта хмеля, в сравнении с препаратом кверцетина.
Практическая значимость работы
Разработана технология экстракта хмеля с повышенным содержанием флавонолов, обладающего антиоксидантной активностью.
Впервые разработан способ стабилизации сенсорно-активных компонентов пива с использованием экстракта хмеля.
Установлены дозировки и разработаны способы внесения экстракта хмеля. Экономическая эффективность от использования хмелевого экстракта заключается в повышении конкурентоспособности пива на 20 % за счет увеличения сроков хранения без увеличения себестоимости.
Хмель как источник биологически активных веществ
Хмель является незаменимым сырьем в пивоварении, благодаря содержанию в нем уникального комплекса горьких веществ, эфирного масла и фенольных соединений. Многие из этих соединений обладают антиоксидантной активностью (АОА). Три группы соединений взаимосвязаны друг с другом и влияют на биохимические реакции, протекающие при хранении и переработке хмеля. Присутствие антиоксидантов (АО) замедляет окислительный распад горьких веществ хмеля и позволяет, таким образом, продлить его сроки хранения [93, 94]. В пиве АО позволяют повысить вкусовую стабильность и улучшить коллоидные свойства.
Растение хмеля обыкновенного (Humulus Lupulus L.) выращивается во многих странах мира. На сегодняшний день ведущими производящими хмель стали три страны - США, Германия и Китай [65]. Традиционно хмель используется как сырье в пивоварении. Однако в течение последних 5 лет в центре внимания исследователей оказался «целебный» хмель, поскольку помимо хмелевых смол и эфирных масел, столь значимых для пивоварения, в хмеле содержится большое количество биологически активных веществ.
Первостепенное значение среди них имеют фенольные соединения (флавоноиды, халконы, фенолкарбоновые кислоты), обладающие полифункциональной активностью. В пивоварении большая часть этих соединений хмеля разрушается в ходе технологического процесса и не влияет на его биологическую активность и на вкусовую и коллоидную стабильность пива [47,96,144].
Биохимический состав шишек зависит от селекционного сорта и почвенно-климатических условий вегетации (типа почв, интенсивности солнечной инсоляции, соотношения тепла и влаги). В среднем, химический состав высушенных шишек характеризуется содержанием влаги от 8 до 13 %, клетчатки 12 - 16 %, минеральных веществ в-9%, азотистых веществ 13 — 18 %, крахмала 2 - 5 %, углеводов 2-4 %, аминокислот 0,1 - 0,2 %, пектиновых веществ 5 - 15 %, эфирных масел 0,2 - 2,7 %, полифенольных соединений 2-7 %, горьких веществ 10-22 % [44, 89, 134, 136,143].
Горькие вещества шишек хмеля уникальны по своему химическому строению, физико-химическим и органолептическим свойствам. Подобные соединения до настоящего времени не обнаружены в других растениях. В их состав входят хмелевые смолы и горькие хмелевые кислоты. Классификация горьких веществ осуществляется с учетом их отношения к разным растворителям и влияния на качество охмеления сусла. Горькие вещества — это безазотистые соединения, основными компонентами которых являются а-кислоты (гумулоны) и р-кислоты (лупулоны), мягкие а- и р-смолы, твердые смолы (у- и 5- смолы). Состав горьких веществ хмеля является сортовым признаком. Для пивоварения наиболее важны а-кислоты (1-16 %). В процессе варки сусла с хмелем из них образуются изо-а-кислоты, аллоизо-а-кислоты, псевдоизо-а-кислоты. Изо-а-кислоты являются основными носителями горечи.
Растворимость изогумулона зависит от рН сусла и пива. С уменьшением рН растворимость и изомеризация а-кислот замедляется. Так, при рН 6 растворимость а-кислоты 500 мг/дм3, а при рН 5,2 только 85 мг/дм3, при рН 4,95 - 56 мг/дм3. В щелочном метиловом спирте а-кислоты имеют два максимума поглощения в УФ свете при 324 и 360 нм. р-кислоты (3 - 6 %) менее устойчивы к окислению и менее растворимы при кипячении, чем а-кислоты. Максимум поглощения в щелочном растворе метилового спирта находится при длине волны 355 нм. В процессе окисления Р-кислот образуются гулупоны и другие соединения, которые принимают участие в формировании специфического аромата и горечи пива. а-Кислоты и Р-кислоты обладают выраженным антисептическим действием [84, 132]. Установлено, что наибольшая антимикробная активность горьких веществ хмеля наблюдается при рН 4,3 - 4,4 и по мере снижения кислотности среды ослабевает [84].
Мягкие а- и Р-смолы при хранении хмеля окисляются и превращаются в твердые смолы. Это не растворимые соединения, не имеющие горького вкуса, и практической ценности для пивоварения. Их содержание повышено в старом и неправильно хранившемся хмеле.
Таким образом, компоненты горьких веществ - соединения лабильные, легко окисляемые кислородом. Особенно этот процесс усиливается при повышенной температуре и под воздействием света.
Окислительные процессы в пиве и факторы, влияющие на их интенсивность
Для потребителя наиболее очевидным признаком качества является прозрачность и блеск пива, нарушение этих признаков заметно даже в закрытой таре. Установлено, что старение пива вызывается окислительными процессами, приводящими к образованию не только помутнений, но и новых сенсорно активных продуктов, ухудшающих его вкус и аромат. Поэтому, сохранению прозрачности пива придается большое значение.
Интенсивность процессов окисления возрастает на свету и при повышении температуры. В окислении принимает участие кислород, находящийся в газовой фазе и растворяющийся в кислой среде пива сразу после розлива. На свету молекулярный кислород активизируется ионами металлов (Fe2+, Cu2+) и пигментами-сенсибилизаторами (рибофлавин и др.), и переходит в свободные радикалы и в активные формы кислорода (АФК). АФК являются инициаторами различных цепных реакций радикального характера, приводящих к изменению состава и органолептических свойств пива [39, 80, 91,96,102].
Щавелом [93, 94] показано, что практически все соединения пива могут вступать в реакцию со свободными радикалами, образуя в присутствии кислорода активные пероксидные радикалы Ri02 и неактивные соединения перекисного типа.
Пиво представляет собой водно-спиртовую коллоидную систему. На модели мицеллярной системы методом радиолиза было показано, что в ядре полярной части мицеллы образуются сободно-радикальные частицы: супероксидный анион радикал (02 ), гидроксипероксильный радикал (НО 2), пероксидный радикал (R02 ), гидроксиэтильный радикал (R ), гидротированный электрон (е"гидр.), гидроксильный радикал (ОН), атом водорода (Н ), молекулярный водород (Н2); нейтральные молекулы - перекись водорода (Н202), синглентный кислород (Ог1).
При радиолизе воды образуются следующие продукты, выход радиационно-химического распада (G) которых указаны в скобках: Н20 = егидрат(2,7) + Н (0,56) + ОН (2,7) +Н2(0,45) + Н202 (0,71) + НэО+ (2,7) Радиолиз спирта в присутствии кислорода: ROH=v 02 + НО + R02 .
Для этилового спирта R = СН3С НОН; СН3СН2СО В присутствии молекулярного кислорода воздуха при облучении воды образуется супероксидный анион радикал (02 ): 02+ ё - 02"(к =1,9x1010моль хл хс 1). 02 генерируется в буферном растворе, насыщенном воздухом е гидРЭТ +02 - 02" к = 1,9 хЮ10 (моль/дм3)"1 1, Н + 02 -» Н02 к = 2 х 1010 (моль/дм3)"1 1, Н02- 02 + ЕҐрК = 4,69 02" не обладает сильными окислительными свойствами, но представляет большую опасность, поскольку является источником образования более активных АФК. Возникает в ферментативных реакциях одноэлектронного переноса, при автоокислении ФС [70, 143, 146, 147]. Токсичность 02 может увеличиваться за счет вторичных реакций, ведущих к образованию его протонированной формы гидроксильных радикалов (ОН ) и синглетного кислорода (!02): 02 + Н - НО 2
При взаимодействии 02 с Н2О2 образуется гидроксильный радикал (ОН ), который является наиболее реакционно способной формой АФК (время жизни 10 9с) [49, 158]. Он разрушает практически любую встречающуюся молекулу. Действуя на SH-группы, аминокислотные остатки белков, вызывают их денатурацию и инактивируют ферменты. Источником возникновения ОН могут служить реакции одноэлектронного окисления Нг02, катализируемые ионами Fe2+, Cu2+ (реакция Фентона и Хамера-Вайса): о2 +Н202 + -»02 +н2о +ОН Fe2+ + Н202 -» Fe3+ + ОН + ОН" Fe3+ + Н202 -» Fe2+ + 02 + 2НҐ Fe2+ 2Н202 ОН + ОН" + 02" + 2Н+ реакция Хамера-Вайса: Си + 02 —» Си + 02 Си+ + Н202 - Си2+ + ОН + ОН" Итого: 02" + Н202 - 02 + ОН + ОН"
Образующиеся в этих реакциях радикалы очень активны и могут вызвать цепные реакции окисления. Аналогично под действием ионов Fe и Си могут распадаться молекулы пероксидов жирных ненасыщенных кислот. Для предотвращения цепных реакций пиво должно содержать Fe не более 1-2 мг/дм3; Си2+ не более 0,2 мг/дм3 [66].
Образовавшиеся ОН в водных растворах присутствуют в низких концентрациях и являются самыми сильными окислителями, вызывающим повреждения многих типов биополимеров.
Н202 - наиболее стабильный из промежуточных продуктов восстановления кислорода и наименее способный к реакции. Н2О2 вызывает окисление SH- групп белков, перекисное окисление жирных ненасыщенных кислот. Перекись водорода не опасна в прямом взаимодействии с компонентами, но реагируя с 02 или ионами Fe2+, может образовывать гидроксильные радикалы [101,158]. - одна из наиболее реакционных форм кислорода, которая окисляет органические молекулы, включая липиды, белки, аминокислоты, ФС и образует гидроперекиси. Возникновение !02 происходит в основном в фотоиндуцированных реакциях и в темноте.
Разработка способа экстракции фенольных соединений хмеля
Существующие в настоящее время технологии хмелевых экстрактов направлены на увеличение выхода горьких и ароматических веществ, необходимых в пивоварении. Извлечению и сохранению ФС хмеля не уделяется должного внимания, хотя от их состава и степени окисленности во многом зависит протекание технологических процессов. Неокисленные ФС, попадая в сусло и в пиво выполняют роль АО, замедляя окислительные процессы. Окисленные ФС обладают низкой АОА, являются источником дубильных веществ и способствуют с одной стороны - осветлению сусла, с другой - ускоряют потерю органолептических свойств пива при хранении.
Ценными, с точки зрения пивоварения, свойствами обладают в основном ФС свежего не окисленного хмеля. Поскольку при хранении, как было показано в предыдущих экспериментах, общее количество ФС и их свойства могут изменяться, то для стабилизации пива можно использовать специально полученные экстракты, содержащие ФС с определенной АО активностью. Для получения таких экстрактов может быть использован свежий хмель и хмелевая дробина предприятий производящих С02 экстракты. Задача данного этапа работы - разработать способ получения экстракта хмеля с высокой концентрацией флавоноидов, обладающих высокой АО и радиопротекторной активностями.
В промышленности сырьем для приготовления экстрактов хмеля являются шишки, прошедшие основные технологические операции — сушку и сульфитацию. В процессе экстрагирования частицы шишек хмеля ведут себя как типичное сушенное растительное сырье. Экстрагирование высушенного и измельченного сырья, имеющего клеточную структуру, является сложным физико-химическим процессом. За счет смачивания и капиллярных сил экстрагент через микропоры проникает в растительные ткани, вытесняет воздух и заполняет клеточные пространства. При этом происходит десорбция и растворение различных веществ, набухание частиц хмеля за счет осмоса - проникновения растворителя в клетку, связанного с разностью концентраций СВ снаружи и внутри клеток. Через микропоры оболочек клеток идет диализ низкомолекулярных веществ, через макропоры оболочек — диффузия. Вследствие этого решающими факторами являются: внутренняя структура твердого тела, свойства экстрагента, концентрация экстрагируемого вещества, температура и продолжительность процесса [52].
Важным фактором в процессе экстрагирования является температура экстрагента, так как под ее влиянием усиливается процесс диффузии, сырье быстрее набухает, гибнет микрофлора, инактивируются ферменты. Количество продиффундировавшего вещества прямо пропорционально времени процесса. Большую роль при экстракции играет природа экстрагента. Экстрагент должен обладать избирательным действием — максимально извлекать действующие вещества и минимально - балластные; хорошо смачивать растительный материал, чтобы проникать через стенки клеток; быть дешевым, доступным и удовлетворять производство с экономической точки зрения.
Известно, что активная кислотность экстрагента влияет на выход соединений хмеля в экстракт. Обычно для извлечения горьких веществ хмеля используют экстрагенты с рН выше 5,0, так как при более низких значениях рН альфа-кислоты не растворяются [39]. ФС также являются чувствительными к активной кислотности экстрагента, поскольку под действием кислой среды происходит частичный гидролиз флавонол-гликозидов с образованием свободных агликонов, подавляется диссоциация фенольных оксигрупп и меняется полярность гидроксильных групп, связанных с ароматическим кольцом.
Разность концентраций веществ между сырьем и экстрагентом является основной движущей силой диффузионного процесса. Процесс идет до установления динамичного равновесия в системе твердое тело - жидкость.
Одним из наиболее влияющих на процесс диффузии факторов является температура. Исследование влияния температуры на выход фенольных соединений проводили в диапазоне от 20 до 90 С. Для экстракции использовали 50 % этанол, поскольку именно этот экстрагент рекомендован большинством авторов для извлечения ФС [44]. Для того чтобы исключить ограничивающее влияние насыщения на процесс, экстракцию вели при соотношении хмеля и этанола 1 : 50. Экстракцию измельченной средней пробы хмеля проводили на установке с обратным холодильником, чтобы сохранить в постоянном соотношении твердую и жидкую фазы. При каждом значении температуры экстракцию проводили в течение часа.
Исследование антиоксидантной активности препаратов флавонолов
С помощью ОФ-ВЭЖХ (сорбент Hypersil ODS) проведена идентификация продуктов радиолиза экстракта, полученного при рН 1,0. Хроматограмма исследуемого экстракта хмеля и продуктов его радиационного окисления представлена на рис. 2.27. Так как соединения выбранного экстракта трансформировались в окисленные формы без разрушения основных молекулярных структур, то они оказались устойчивыми к действию АФК. Продукты окисления и исходного экстракта были охарактеризованы с использованием времен удерживания. В табл. 2.21 представлены хроматографические параметры экстракта и продуктов его окисления, полученные при А, = 334 нм.
В экстракте были зарегистрированы пики, имеющие время удерживания 2,144 - 7,185 мин. В облученном экстракте (20,0 кГр) подобные пики не обнаружены. Это позволяет предположить взаимодействие соединений экстракта с АФК и образование нового продукта экстракта с временем удерживания 4,138 минут. Известно, что ФС в результате взаимодействия с активными радикалами образуют устойчивые радикалы — семихиноны, которые впоследствии в зависимости от рН среды и присутствия других восстановителей могут либо конденсироваться в высокомолекулярные соединения, не обладающие АО А, либо трансформироваться в исходные соединения или соединения с большей АО А, такие как антоцианидины.
Для оценки процессов конденсации и окислительной деструкции все детектируемые соединения экстракта были разделены на три группы: первая - соединения с малым временем удерживания 0 - 9,99 минут, в которую входят катехин, резорцин и гидрохинон; вторая - соединения со среднем временем удерживания 10,0 - 15,99 минут, в которую входят Qr; третья группа соединения с высоким временем удерживания от 16,0 - 30,0 минут, в которую входят более высокомолекулярные ФС.
Количественное соотношение отдельных групп соединений оценивали по площади пиков на хроматограмме. Анализировали процессы в экстракте непосредственно после облучения и через 1 сут хранения облученного экстракта. Данные на рис. 2.27 и табл. 2.22 показывают, что общее количество ФС детектируемых при А, = 280 нм сразу после облучения снижается. Через сутки хранения облученного экстракта наблюдается дальнейшее снижение площадей пиков соединений, что говорит об их разрушении.
Хроматографическая детекция соединений, дающих поглощение в области А, = 334 нм показала, что радиолиз вызвал снижение площади пиков низко- и средне- молекулярных фракций, и полное исчезновение высокомолекулярной фракции. В пострадиационный период отмечается устойчивость всех образовавшихся фракций.
Данные хроматографического анализа соединений, дающих поглощение в зоне X = 513 нм, показывают образование окрашенных продуктов под действием АФК. Отмечается увеличение общей площади пиков в результате радиолиза за счет средне - молекулярной фракции.
Таким образом, было показано, что экстракты хмеля, полученные при рН экстрагента 1,0 и 4,0, обладали более высокой АОА, чем чистые вещества Qr и Ru. Это можно объяснить не только высокой концентрацией АО, но и присутствием набора соединений, имеющего более высокую АОА, чем выбранные для сравнения ФС - Qr и Ru.
Скорость старения пива зависит от концентрации АФК и от действия АО системы пива, связывающей радикалы и не дающей развиваться автокаталитическим процессам. Именно поэтому усилия многих ученых мира направлены на поиск и изучение свойств отдельных соединений пива, и факторов позволяющих регулировать окислительные процессы. С точки зрения участия в формировании АО системы пива фенольные соединения могут быть отнесены к наиболее ценным компонентам. При этом следует отметить, что в процессе приготовления пива в качестве АО выступают в основном флавоноиды хмеля, так как находятся в мономерной, неокисленной форме. По мнению многих специалистов, полифенольный комплекс хмеля играет положительную роль в производстве пива, так как легче окисляется, обладает большей восстановительной способностью, легко осаждается в сусле и играет положительную роль при его осветлении и формировании вкуса пива (Покровская Н.В., 1978).
ФС солода присутствуют в виде окисленных ди- и тримеров, которые менее активны по отношению к АФК и активным радикалам. Типичные представители этих соединений продельфинидин В3 (конденсированная молекула катехина и галлокатехина) и процианидин В3 (конденсированная молекула, состоящая из двух молекул катехина). Вышеперечисленные соединения более устойчивы к окислению, поэтому они сохраняются в процессе варки сусла и брожения, и практически в неизменном виде попадают в готовый продукт. Окисление этих соединений происходит в ходе хранения пива, и привод к образованию коллоидного помутнения.
Для изучения влияния хмелевых АО на стойкость пива был проведен выбор показателей, отражающих протекание окислительных процессов. Интенсивность окисления и увеличение молекулярной массы ФС является одним из критериев протекания окислительных процессов. Вторым критерием контроля окислительных процессов в пиве были выбраны наиболее реакционно-способные соединения - альдегиды.
На рис. 2.29 показана схема образования альдегидов и коллоидного помутнения при хранении пива. АФК реагируют с компонентами пива с образованием возбужденных промежуточных продуктов, которые в последующих реакциях превращаются в стабильные карбонильные соединения и фенольные комплексы. Поэтому в условиях ускоренного старения пива первостепенное значение имеет определение содержание альдегидов и восстанавливающей способности.
