Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Характеристика зерна - основного сырья для производства спирта 9
1.2 Современные ферментные препараты для гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья 17
1.3 Сахаристые крахмалопродукты: свойства и применение 29
1.4 Перспективы комплексного использования зернового сырья для получения сахаристых сиропов и спирта 36
Глава 2. Объекты и методы исследований 45
2.1 Объекты исследований 45
2.2 Характеристика используемых ферментных препаратов 45
2.3 Методы определение активности ферментных препаратов... 46
2.4 Определение углеводного состава гидролизатов 50
2.5 Методика хроматографического анализа содержания этилового спирта и примесей в зрелой бражке 52
2.6 Общие биохимические методы исследования 52
2.7 Статистическая обработка экспериментальных данных 53
Глава 3. Подбор ферментных препаратов для интенсификации процесса получения сахаристых крахмалопродуктов 55
3.1 Оптимизация процесса разжижения крахмала 55
3.2 Исследование процесса осахаривания крахмала 66
3.4 Сбраживание гидролизатов крахмала 80
Глава 4. Разработка технологии сиропов из кукурузы с применением ферментных комплексов и их сбраживание 90
4.1 Подбор мультиэнзимного комплекса для деструкции полисахаридов кукурузы 92
4. 2 Оптимизация процесса биоконверсии полисахаридов кукурузы 100
4.3 Разработка технологии получения зерновых сиропов из кукурузы 107
4.4 Изучение влияния мультиэнзимного комплекса на процесс брожения сусла 110
4.4.1 Исследование процесса брожения зернового сусла 110
4.4.2 Исследование процесса брожения зерновых сиропов.. 115
Выводы 124
Список использованных источников 126
Приложения 144
- Современные ферментные препараты для гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья
- Методика хроматографического анализа содержания этилового спирта и примесей в зрелой бражке
- Оптимизация процесса биоконверсии полисахаридов кукурузы
- Изучение влияния мультиэнзимного комплекса на процесс брожения сусла
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время в пищевой промышленности актуально создание высокоэффективных технологий, которые обеспечивают новый уровень производства, характеризующийся глубокой переработкой сырья, что позволяет значительно повысить рентабельность существующих производств, в частности спиртового. Это предопределяет необходимость развития принципиально новых направлений подготовки сырья, создания безотходных экологически безопасных технологий.
Важнейшим направлением развития спиртового производства является увеличение выхода и качества целевой продукции, снижение ее себестоимости. Традиционная технология спирта в России имеет ряд недостатков, обусловленных применением только крахмала.
Одним из путей совершенствования производства может быть использование мальтозных и глюкозных сиропов с заданным углеводным составом, полученных путем ферментативного гидролиза полисахаридов зерна кукурузы с отделением неуглеводных компонентов и использованием последних для производства широкого спектра побочных продуктов. В развитых производствах Франции, Бельгии, США на специализированных заводах уже осуществляется такая целенаправленная комплексная переработка сырья. Подобные отечественные технологии отсутствуют, а патенты на иностранные дорогостоящи.
Применение зерновых сиропов в производстве спирта- в России позволит решить ряд проблем этой отрасли, таких как обеспечение экономической безопасности спиртзаводов, повышение качества получаемого продукта, повышение технико-экономических показателей производства за счет перехода на непрерывные процессы брожения, что способствует конкурентоспособности отечественной продукции на мировом рынке.
Несмотря на значительное количество работ, посвященных разработке технологии сахаристых крахмалопродуктов такими отечественными и зарубежными учеными как Даниляк Н.И., Деулин В.И., Ладур Т.И., Лазарев В.Д., Обуховский Э.A.,Nguyen К., Oksanen I и др., проблема получение сиропов непосредственно из зерна, в частности, кукурузы является актуальной.
Преимущественное использование кукурузы перед другими видами сырья обусловлено ее широким распространением, ценным составом зерна, возможностью получения из него целого ряда продуктов, высокой урожайностью. Кукуруза занимает ведущее место среди других видов сырья перерабатываемого в крахмалопаточной области. В США из нее получают 95 % всех крахмалопродуктов, в России - 70 %.
Актуальность темы определяется также аграрной политикой области, направленной на увеличение производства данной зерновой культуры как наиболее перспективной.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка технологии сиропов из кукурузы с применением мультиэнзимого комплекса и интенсификация получения этанола путем их сбраживания. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: интенсифицировать процесс декстринизации кукурузного крахмала путем подбора оптимальных условий действия термостабильной а- амилазы; провести подбор ферментных препаратов и определить оптимальные режимы осахаривания крахмала для получения сахаристых крахмалопродуктов; научно обосновать и разработать мультиэнзимные комплексы, обеспечивающие эффективную биоконверсию высокомолекулярных полимеров кукурузы; разработать технологию получения сиропов из кукурузы; изучить процесс брожения сиропов из крахмала и зерна кукурузы; разработать проекты технической документации, провести производственные испытания результатов исследований, определить экономическую эффективность предлагаемой технологии.
Научная новизна. Научно обоснован состав композиции ферментных препаратов для осахаривания крахмала, обеспечивающий получение сахаро- содержащих сиропов с целью получения этанола.
Исследована зависимость степени деструкции высокомолекулярных полимеров зернового сырья от длительности гидролиза, дозировки и соотношения амилолитических и цитолитических ферментов.
Показана возможность интенсификации спиртового брожения за счет применения зерновых сиропов.
Практическая значимость работы. Разработана биотехнология получения этанола на основе глюкозных, мальтозных, глюкозо-мальтозных сиропов из кукурузы, полученных с применением, мультиэнзимных комплексов, позволяющая сократить процесс брожения до 36 ч и повысить выход спирта на 3,6 %.
Предлагаемая технология может быть положена в основу комплексной переработки зернового сырья.
Показана экономическая эффективность применения сиропов для получения этанола.
Разработаны проекты» технической документации на получение глюкоз- ного, мальтозного и глюкозо-мальтозного сиропов.
Апробация работы. Работа была поддержана фондом содействия развития малых форм предприятий> в.научно-технической сфере (программа У.М.Н.И.К.). По итогам конкурса министерства образования и науки РФ «За лучшую студенческую работу» по результатам исследований по разработке сиропов была получена медаль. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях
ВГТА (2006 - 2009) - очно; межрегиональных конференциях «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2006, 2007); 10 - 12-х Пущинских школах - конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006 - 2008); V - УН-ой международных научно- теоретических конференциях «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2006-2009); международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской научной молодежной конференции «Основные направления функционального питания и безопасность пищевых продуктов» (Улан-Удэ, 2006); общероссийских конференциях молодых ученых «Пищевые технологии» (Казань, 2006 - 2009); IV -м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007); II Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008) и отмечена дипломом; Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008); научно-практической конференции «Актуальные проблемы развития технологии производства продуктов питания» (Воронеж, 2008) - очно; III Международной научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности», посвященной 80-летию ВГТА (Воронеж, 2009) - очно; VII международной научной конференции «Инновации в науке и образовании» (Калининград, 2009).
Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 28 работ, в том числе 12 статей, из них 5 в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем-работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы, приложений и представлена на 143 страницах, содержит 35 рисунка и 24 таблицы. Библиография включает 141 наименований, в т. ч. 26 иностранных.
Выражаю сердечную благодарность д.т.н., профессору Сергею Всеволодовичу Вострикову за ценные советы, консультации, поддержку и помощь при выполнении данной работы.
Современные ферментные препараты для гидролиза высокомолекулярных полимеров зернового сырья
Как известно, переработка зернового сырья на спирт и сахаристые крахмалопродукты включает стадии разжижения, декстринизации и осаха- ривания крахмала, которые в настоящее время не обходятся без применения ферментных препаратов [7, 28, 32, 35, 43, 66, 69, 75, 98].
В зависимости от целей применения ферментных препаратов к ним предъявляются определенные требования в отношении состава ферментативного комплекса, оптимальных условий их действия (рН и температура), степени очистки и ряда других факторов [19, 102, 103, 116, 117]. Некоторые ферментные препараты для спиртовой промышленности выпускаются в неочищенном виде, как правило, они являются комплексными, т.е. содержат больше одного фермента. Применение таких препаратов для осуществления специфичного процесса, катализируемого одним ферментом, неизбежно сопровождается действием и других сопутствующих ферментов, входящих в этот препарат. Поэтому в зависимости от задач, стоящих на определенной технологической стадии, необходимо индивидуально подходить к оценке каждого ферментного препарата [6, 7, 28, 32].
В спиртовой и крахмалопаточной промышленности, перерабатывающей крахмалистое сырье, широко применяются ферменты гидролитического расщепления крахмала [26, 32, 35, 36, 66-69]. Для этой цели используют как зерновой солод, так и ферментные препараты микробного происхождения. Зерновой солод представляет собой комплекс ферментов и осуществляет гидролиз крахмала до сбраживаемых углеводов, а также гидролизует белки и некрахмалиистые углеводы, служит источником азотистого питания дрожжей [43, 65]. Однако, при применении солода, из-за ограниченной» возможности создания достаточно высокой концентрации ферментов, скорость оса- харивания сырья остается низкой, что затрудняет интенсификацию процесса.
Эффективная замена солода ферментами микробного происхождения является важной задачей. Опытом работы спиртовых заводов, в последние годы показано, что применение ферментных препаратов экологически оправдано: интенсифицируется процесс осахаривания крахмала, повышается степень использования сырья, стабилизируются технологические процессы [55-58,81 -91]. Все ферментные препараты, предназначенные для переработки зернового сырья в спиртовой и крахмалопаточной отраслях, по специфичности их воздействия на различные высокомолекулярные полимеры зернового сырья можно разделить на три основные группы [88, 89, 119].
I. Первая группа - это ферментные препараты амилолитического действия, катализирующие гидролиз крахмала. К ним относятся ферменты разжижающего, декстринирующего и осахаривающего воздействия на крахмал.
1. а -Амилаза (а- 1,4 - глюкан - 4 - глюканогидролаза, 3.2.1.1) является ферментом эндо-типа, гидролизующим а - 1,4 - гликозидные связи в крахмале и гликогене. Роль а-амилаз при гидролизе крахмала исключительно велика. Они атакуют не только клейстеризованный, но и нативный крахмал, разрушая крахмальные зерна. Действуя на целое крахмальное зерно, а - амилаза атакует его, разрыхляя, поверхность и образуя каналы и бороздки, т. е. как бы раскалывает зерно на части. Действие а-амилазы на крахмал характеризуется быстрым снижением вязкости и молекулярной массы олигосаха- ридов. Фермент имеет выраженное сродство к гликозидным связям, удаленным от конца молекулы. Атака субстрата носит случайный характер и может быть как единичной, так и множественной, когда от субстрата последовательно отщепляется несколько фрагментов. Гидролизу подвергаются олиго- сахариды, содержащие не менее 3 глюкозных единиц. При гидролизе амило- пектина наряду с олигосахаридами линейного строения в продуктах гидролиза присутствуют а - декстрины, представляющие собой не затронутые реакцией разветвленные участки молекул амилопектина [19, 27, 28, 35, 123]. а - Амилазы условно делят на две группы: разжижающие и. осахари- вающие. К первым относят ферменты, расщепляющие в растворимом крахмале или амилозе не более 40 % гликозидных связей, ко вторым - расщепляющие до 60 %. Так, установлено, что осахаривающая амилаза термофильного актиномицета гидролизует амилозу с образованием 77 % мальтозы, 17 % мальтотриозы, 2,5 % глюкозы и 3,5 % мальтопентаозы, что соответствует степени расщепления гликозидных связей около 47 % [19, 38]. При действии бактериальных амилаз разжижающего типа на растворимый крахмал предельная степень расщепления гликозидных связей составляет от 16 до 30 %, при этом в качестве основного продукта гидролиза может обнаруживаться мальтогексаоза, мальтопентаоза или мальтоза. Бактериальные амилазы осахаривающего типа гидролизуют крахмал с образованием до 70 % мальтозы и глюкозы. Продуцентами амилаз осахаривающего типа являются микроскопические грибы, при гидролизе крахмала образуется до 87 % мальтозы и глюкозы [15, 38]. а-Амилазы бактерий и плесневых грибов, на первоначальной стадии гидролиза атакуют субстрат произвольно, а затем атака ведется предопреде- ленно, причем на последних стадиях действие ферментов из плесневых грибов отличается от действия а-амилаз из бактерий. Так, во время гидролиза амилозы а-амилазой Вас. зиЫШэ основными продуктами при «ахроическом пределе» являются мальтотриоза и декстрины, цепь которых имеет длину, приблизительно равную Гб. Малые декстрины затем распадаются в основном по схемам: Г6 -»Г1+Г5; Г7- Г1+Г6 или (в меньшей мере) Г2+Г5; Г8- Г2-ЬГ6 или (меньше) Г3+Г5.
Конечными продуктами гидролиза амилозы являются глюкоза и мальтоза в соотношении 1:5,45 для ферментов бактериального происхождения! и 1:3,79 для амилаз плесневых грибов, причем вторая стадия гидролиза до глюкозы и мальтозы требует больше времени и в 20 - 25 раз более высокой концентрации ферментов, чем вначале. Различия в свойствах а-амилаз разного происхождения по оптимуму температуры, рН, по глубине и характеру гидролиза раскрывают возможности целенаправленного их применения на различных стадиях производственного процесса.
В современных отраслях промышленности, направленных на переработку крахмалсодержащего зернового сырья широкий интерес к проблеме получения и применения термостабильных амилаз обусловлен их способностью осуществлять гидролиз при высоких температурах (90 - 105 С). При этом совмещаются два процесса - клейстеризация крахмала и его гидролиз. Значительно снижается стоимость процесса за счет сокращения дозировки фермента и продолжительности процесса гидролиза крахмала. Обеспечивается высокая степень расщепления крахмала, и как следствие этого, увеличивается выход целевого продукта [101].
Этим требованиям удовлетворяют препараты бактериальной термостабильной а-амилазы, применение которых особенно эффективно для использования в технологии механико-ферментативной обработке сырья. Максимальная эффективность их действия находится в интервале температур 85 - 95 С и рН 5,0 - 8,0. Высокая термостабильность этих ферментных, препаратов способствуют снижению расхода препаратов для разжижения крахмала зернового сырья. Немаловажное значение оказывает не только температура, но и рН водно-мучной суспензии, при котором происходит разжижение и клейстеризация крахмала. Обычно он находится в интервале 5,5 - 6,5 и также соответствует оптимальным пределам действия этих ферментов. [26, 28, 43,47, 110].
Установлено,- что применение термостабильной а-амилазы при получении крахмальной патоки позволяет сократить продолжительность, процесса и улучшает качество гидролизатов по прозрачности и цветности. Кроме того, при этом не ухудшаются фильтрационные свойства гидролизата, исключается явление ретроградации крахмала, которое может привести к затруднению фильтрования полученного гидролизата [105].
Методика хроматографического анализа содержания этилового спирта и примесей в зрелой бражке
Объемную долю спирта и примесей определяли в бражном дистилляте, который получали в результате простой перегонки. В бражном дистилляте находили объемную долю спирта и примесей на газо-жидкостном хроматографе ЛХМ-80 с пламенно-ионизационным детектором, методом внутреннего стандарта. Проба, вводимая в испаритель хроматографа, анализировалась при следующих условиях: Объемную долю компонентов рассчитывали по формуле: = й С/Эст, (2.4) где Р; - объемная доля компонентов, % об; - площадь пика компонента, мм2; Бст - площадь пика н-бутанола, мм2; С - содержание внутреннего стандарта, % об. 2.6 Общие методы исследования 1. Величину рН определяли на потенциометре рН - 150 МА. 2. Влажность измельченного зерна и крахмала определяли высушиванием навесок материала до постоянной массы в сушильном шкафу марки СЭШ- 1 при 105 С [12, 80]. 3. Кислотность бражки и сусла определяли титриметрически с применением индикатора метилового красного [12, 80]. 4. Определение редуцирующих веществ проводили микрометодом Сомоджи-Нельсона [79]. 5. Содержание белка в пробах определяли по методу Къельдаля ГОСТ 13496.4-93 [12], 6. Содержание крахмала определяли ферментативно-кислотным методом по Меркеру [12] с применением для осахаривания крахмала промышленных ферментных препаратов а - амилазы и глюкоамилазы. 7. Содержание спирта определяли с помощью интерферометра марки ЛИР - 2 - УХЛ 4.2 по отношению к дистиллированной воде [12]. 8. Суммарное содержание сбраживаемых углеводов определяли колориметрическим антроновым методом (метод ВНИИПрБ) [12. 80]; 9. Для определения количества нерастровенного крахмала в бражке проводили в начале гидролиз крахмала в 0,4%-ном растворе серной кислоты, а затем определяли общие углеводы антроновым методом [80]. 10. Интенсивность выделения диоксида углерода при брожении определяли массовым методом. 2.7
Статистическая обработка экспериментальных данных Все опыты, описанные в работе, проводили в 3-х повторностях, аналитические определения для каждой пробы - в 2-х - 3-х повторностях. В таблицах и на рисунках показаны данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее из трех определений. Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизводимы в каждом опыте. Графические зависимости на рисунках представлены после обработки экспериментальных данных по методу наименьших квадратов. При подборе оптимальных условий биоконверсии крахмала и полисахаридов кукурузы использовали полнофакторный эксперимент с применением центрального композиционного рототабельного униформпланирования [18]. Значения входных параметров процесса и интервалы варьирования выбирались с таким расчетом, чтобы они перекрывали интересующий нас диапазон изменения факторов и располагались бы равномерно внутри этого интервала. При обработке результатов эксперимента были применены следующие статистические критерии [18]: для проверки однородности дисперсий ошибок использовался тест Уайта, значимость коэффициентов уравнения регрессии - критерий Стьюдента, адекватность уравнений регрессии - критерий Фишера. Результаты эксперимента обрабатывали по программам парной и множественной корреляции. Все эксперименты проводили в 3-х кратной повторности, достоверными считали различия с уровнем значимости ц=0,05.
На первом этапе исследований проводили анализ ферментных препаратов отечественного и импортного производства для проведения процесса гидролиза кукурузного крахмала с целью получения гидролизатов различного углеводного состава. Как известно, основным процессом при производстве сахаристых крахмалопродуктов является гидролиз крахмала, который состоит из следующих этапов: клейстеризации (ослабление и разрыв связей между макромолекулами амилозы и амилопектина, нарушение1 структуры крахмальных зерен, образование гомогенной массы высокой вязкости); разжижения (дальнейший разрыв длинных цепочек молекул крахмала, образование продуктов различной молекулярной массы, снижение вязкости клейстера); осахарива- ния (разрыв молекул крахмала до простых Сахаров, накопление редуцирующих веществ). Процесс клейстеризации крахмала всегда совмещен с процессом разжижения, поэтому эти две стадии гидролиза неотделимы друг от друга и в целом рассматриваются как единая технологическая операция [41, 105]. Процесс разжижения - ведущий этап биоконверсии крахмала.
В зависимости от применяемого вида катализатора, используемого технологического оборудования, соблюдения режимов разжижения- определяется ход последующих технологических операций. Качество гидролизатов, полученных на стадии разжижения, влияет на расход ферментных препаратов в процессе оса- харивания, и в целом, на основные параметры готовой продукции: глюкоз- ный эквивалент (ГЭ), цветность, вязкость, зольность продукта и т. д. Преимущества применения ферментативного гидролиза по сравнению с кислотным очевидны. Ферментативное разжижение крахмала способствует повышению выхода готового продукта и улучшению его качественных показателей. С целью подготовки крахмала к действию осахаривающих ферментных препаратов его необходимо перевести в растворимое состояние путем клейстеризации. Температура клейстеризации различных крахмалов колеблется в пределах 54 - 80 С, поэтому в качестве биокатализатора в процессе ферментативного разжижения эффективно применять термостабильные а- амилазы бактериального происхождения [105]. Наиболее распространенный способ ферментативного разжижения, используемый многими исследователями в своих работах, заключается в прямом или ступенчатом нагреве смеси (крахмал - вода - а-амилаза) до оптимальной температуры действия фермента и выдерживания при этой температуре в течение определенного времени до достижения 15-20 % редуцирующих веществ в смеси.
Оптимизация процесса биоконверсии полисахаридов кукурузы
Перспективным направлением в практике ферментативного гидролиза при получении сахаристых крахмалопродуктов является использование фермента альфа-1,6-глюкозидазы - пуллуланазы. Пуллуланаза действует на субстрат с большим числом альфа-1,6-связей [35]. Разрушая альфа-1,6- глюкозидные связи в точке ветвления молекулы крахмала, фермент обеспечивает распад амилопектина на молекулы амилозного типа, которые в дальнейшем легко расщепляются амилазами различных видов. Однако воздействие пуллуланазы на амилопектин несколько затруднено. Атакуемость полимера ферментом возрастает, если субстрат подвергнут частичному расщеплению.
Синергизм действия а-амилазы, глюкоамилзы и пуллуланазы, по литературным данным, позволяет повысить степень гидролиза крахмала. Поскольку в зерне кукурузы содержится фитогликоген (около 10 % а 1- 6 связей), представляло интерес исследовать влияние комплексов, содержащих пуллуланазу с глюкоамилазой пуллуланазу с мальтогеназой на деструкцию крахмала.
В настоящее время на; российском рынке представлены новые комплексные ферментные препараты,, обладающие глюкоамилазной и пуллула- назной активностями. Такими ферментами являются «Dextrozyme» (смесь AMT 300L и Promozyme D2), Dextrozyme Е» (новый вид АМГ и пуллуланазы) производитель - «Novozymes». Препараты рекомендованы для ферментативного осахаривания разжиженного крахмала, как при производстве глюкозы, так и высокофруктозных сиропов. Для увеличения выхода заданных продуктов гидролиза (глюкозы, мальтозы) изучили действие пуллуланазы в композиции с исследуемыми ранее ферментными препаратами. С этой целью в работе исследовали фер ментный препарат пуллуланазы Ргошогуш В2 (ПлС 1380 ед./см , АС 70 ед. /см ).
Препарат пуллуланазы Ргошогуш VI вносили одновременно с глю- коамилазы Сан Экстра Л в различных соотношениях (от 2 до 6 ед. ПлС/г) на стадии осахаривания. Сравнительный анализ совместного действия этих препаратов, представленный на рис. 3.10, показал, что применение пуллуланазы способствует интенсификации гидролиза крахмала.
Данные, представленные на рис. 3.11, коррелируют с данными о накоплении редуцирующих веществ, отраженными на рисунке 3.10 и также показывают, что наибольшее количество сахара образуется в пробах, где вносили 4 и 6 ед. ПлС/г с 6 ед. ГлС/г крахмала. Видно также, что на образование глюкозы из крахмала решающее значение оказывает дозировка глюкоамилазы, поскольку в пробах, где вносили глюкоамилазу и пуллуланазу в суммарном количестве 6 ед/г крахмала, степень гидролиза была ниже, чем при внесении одной глюкоамилазы в дозировке 6 ед. ГлС/г крахмала.
В связи с тем, что глюкоамилаза имеет большее сродство к крупным полимерам крахмала, чем к олигосахаридам [26, 28, 105], а пуллуланаза специфична к а-1,6-связь глюкозидным связям, которые с двух сторон окружены а-1,4-связями [35], изучали влияние последовательности внесения глюкоамилазы и пуллуланазы на степень осахаривания разжиженного крахмала. Для этого в опытные пробы вносили пуллуланазу в различной дозировке и проводили гидролиз в течение 1 ч и 1,5 ч. Затем добавляли глюкоамилазу и осахаривали 2 ч и 1,5 ч соответственно. Результаты экспериментов представлены на рис. 3.12.
Изучение влияния мультиэнзимного комплекса на процесс брожения сусла
Экспериментальные данные показали, что путем регулирования вносимого количества ферментных препаратов глюкоамилазы и мальтогенной а- амилазы можно получать сахаристые крахмалопродукты различного состава в зависимости от требований потребителя.
Для исследования особенностей процесса брожения различных субстратов сбраживанию подвергали гидролизаты, разбавленные дистиллированной водой до содержания сухих веществ 17%. Брожение осуществляли в при температуре 30 С дрожжами ЗассИаготусеБ сегел ае расы XII, концентрацией 160 млн./см (что соответствует 20 г/дм в пересчете на прессован ные дрожжи влажностью 75%). В качестве минерального питания использовали дигидроортофосфат аммония (ЫНД РС ). Пробы ставили на брожение в емкостях с гидрозатворами на 72 ч. Каждые 6 ч сусло перемешивали с целью предотвращения агломерации и оседания дрожжей и отбирали пробы, где определяли содержание этилового спирта.
Экспериментальные данные показывают, что наиболее эффективно брожение протекает в суслах, содержащих наибольшее количество глюкозы (глюкозное и глкозно-мальтозное (75 %)), поскольку выход спирта здесь был наибольший - 64,6 и 64,9 дал/т крахмала. Минимальную крепость бражки наблюдали в мальтозном сусле - 6,4 % об.
В качестве одного из критериев оценки интенсивности сбраживания сусла использовали интенсивность выделения диоксида углерода. В литера туре имеются сведения, что именно количество выделяющегося С02 связано со скоростью обмена веществ, а следовательно, накоплением спирта и образованием побочных продуктов брожения [78]. Накопление этилового спирта коррелирует с количеством выделившегося диоксида углерода за период брожения.
По результатам экспериментов были построены графики скорости выделения диоксида углерода при сбраживании различных субстратов, приведенные на рис. 3.14. Кривые имеют подобный вид с ярко выраженными максимумами, которые, однако, расположены в различных интервалах времени. Из рисунка видно, что главное брожение заканчивается во всех опытах к 15 ч, при сбраживании у мальтозного сусла оно завершается только к 18 ч, после чего начинается процесс дображивания, и скорость выделения диоксида углерода быстро снижается.
Анализируя ход кривых, изображенных на рисунке, можно сказать, что максимальная интенсивность выделения диоксида углерода наблюдается на 5 - 6 ч брожения для сусел, содееджащих глюкозу. При сбраживании мальтозного сусла максимальное выделение углекислого газа наблюдали лишь на 9 - 10 ч брожения, что подтверждает общепринятые представления о периоде главного брожения, где в первые часы брожения утилизируется глюкоза, количество которой в сусле невелико, и далее происходит плавная перестройка ферментативных систем дрожжевой клетки на потребление более сложного субстрата — мальтозы. Максимальная скорость выделения диоксида углерода при сбраживании мальтозного гидролизата в 1,5 раза меньше, чем при сбраживании глю- козного гидролизата. Большую скорость выделения С02 при утилизации глюкозы в сравнении с мальтозой можно объяснить тем, что она является самым легкоусвояемым и энергетически более выгодным источником углеводного питания для дрожжей. Вид кривой скорости выделения ССЬ при сбраживании смеси глюкозы и мальтозы (50 % + 50 %) близок кривым для опыта с глкжозно-мальтозным (75 % + 25 %) и глюкозным суслом, однако абсолютная величина максимума несколько ниже.
Таким образом, можно сделать вывод, что на начальных 12 ч процесса дрожжи усваивают сначала глюкозу (так как значение кривых почти совпа- ли), а затем — мальтозу, что подтверждается литературными данными: дрожжи не сбраживают мальтозу до тех пор, пока концентрация глюкозы в сусле не упадет до известного уровня. Некоторыми авторами он определен как 0,2 - 0,6 %. Принимается, что глюкоза активирует мальтозимазную репрессивную систему, которая ингибирует синтез мальтазы. Наличие легко- сбраживаемых Сахаров в среде тормозит образование ферментов для образования ди- и трисахаридов. Так, Рамо-Жаном исследовано влияние ингиби- рующего эффекта глюкозы на синтез и активность мальтозимазы дрожжей. Почти у всех исследованных штаммов мальтозимазная активность ингиби- руется глюкозой [14].
