Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 6
1.1 Характеристика и метаболизм спиртовых дрожжей 6
1.2 Ферменты дрожжевой клетки и факторы, влияющие на ферментативную активность дрожжей
1.3 Влияние расы дрожжей на качество спирта 23
1.4 Способы интенсификации спиртового брожения 32
1.5 Заключение по обзору литературы 37
2 Методология проведения экспериментальных исследований 38
2.1 Организация проведения эксперимента 38
2.2 Объекты и методы исследований 40
2.2.1 Объекты исследований 40
2.2.2 Методы исследований 40
3 Исследование закономерностей утилизации азотистых веществ спиртовыми дрожжами 41
4 Активизация жизнедеятельности спиртовых дрожжей путем внесения азотсодержащих добавок 56
5 Использование протеолитических ферментных препаратов для оптимизации азотистого состава сусла 69
6 Производственная апробация разработанной технологии активации дрожжей 82
Выводы и основные результаты работы 93
Список использованной литературы 95
Приложения 107
- Ферменты дрожжевой клетки и факторы, влияющие на ферментативную активность дрожжей
- Способы интенсификации спиртового брожения
- Исследование закономерностей утилизации азотистых веществ спиртовыми дрожжами
- Активизация жизнедеятельности спиртовых дрожжей путем внесения азотсодержащих добавок
Введение к работе
Спиртовая промышленность в настоящее время является быстро развивающейся отраслью народного хозяйства.
Спирт-ректификат, производимый отечественными предприятиями, используется в ликероводочнои промышленности, в медицине, производстве пищевых кислот, концентратов для безалкогольных напитков, пищевых добавок и других целей.
Потребность в нем постоянно увеличивается, причем возрастает спрос на спирт более высокой степени очистки, производство которого организуется на передовых предприятиях (спирт люкс, альфа).
Снижение объемов выпуска спирта в 80-е годы отрицательно сказалось и на уровне производства, на состоянии спиртовых предприятий, на уровне технологии. Долгие годы не велось новое строительство, не проводилась разработка и внедрение усовершенствованных технологических схем.
В настоящее время работа отрасли стабилизировалась, ведутся научные исследования в области создания новых технологий с использованием последних достижений биотехнологии и других областей науки /107/.
Перспективным является применение ферментных препаратов взамен солода, причем разрабатываются технологии применения на стадии осахаривания наряду с амилазой и глюкоамилазой протеолитических и цитолитических ферментных препаратов, позволяющих перерабатывать большие объемы ржи, доля которой в последние годы возросла в ассортименте используемых зернопродуктов до 70 % /85,86,107/.
С целью снижения расхода пара, улучшения условий работы, снижения
потерь на предприятиях спиртовой промышленности внедряются новые
способы подготовки сырья к осахариванию: усовершенствованные установки
по развариванию, механико-ферментативный способ тепловой обработки
wv сырья, предусматривающий применение современных высокоактивных
ферментных препаратов /52,72,107/.
4
Внедрение усовершенствованных технологических схем позволит
улучшить технико-экономические показатели производства, получить
продукцию высокого качества.
Ц* Большое значение в спиртовом производстве имеет биохимическая
деятельность дрожжей. Наряду с составом сусла, дрожжам принадлежит существенная роль в проведении процессов брожения и качестве спирта. Их физиологическое состояние влияет на скорость протекания процессов и состав побочных продуктов брожения.
За последние годы произошли значительные изменения в процессах
М производства спирта. Наибольшее распространение получили
технологические способы и приемы, ускоряющие процессы брожения путем увеличения контакта дрожжей со средой, использование физических факторов, активных штаммов дрожжей и т.д. Активные исследования в этом направлении проводятся рядом отечественных исследователей: Поляковым В.А., Римаревой Л.В., Оверченко М.Б. и др.
Применение технологических приемов совершенствования процессов производства спирта особенно актуально и эффективно, так как не требуют значительных капитальных вложений, существенного изменения технологии, однако, позволяют повысить выход спирта, улучшить его качество.
Научная новизна Изучено влияние нормы засева дрожжей и
концентрации аминного азота на процесс их размножения. Получена
«^ математическая зависимость удельной скорости роста и кратности прироста
дрожжей от нормы их внесения и содержания усвояемых азотистых веществ
в среде культивирования.
Показана возможность активации дрожжей фильтратом барды на
стадии дрожжегенерирования. Изучен состав побочных продуктов
спиртового сусла, полученного при использовании активированных
,_ дрожжей.
Проведена сравнительная оценка эффективности применения протеазы GC-106 на стадии размножения производственных дрожжей и при брожении.
5 Исследовано изменение протеолитическои активности в сусле в процессе брожения.
Практическая ценность и реализация результатов работы
Разработана технологическая схема и «Технологическая инструкция по приготовлению производственных дрожжей с использованием протеолитических ферментных препаратов применительно к условиям ООО ЛВЗ «Оша» спиртового производства».
Проведены производственные испытания по применению протеазы GC-106 на стадии дрожжегенерации. Показана возможность получения спирта высокого качества без ухудшения технологических показателей процесса брожения при внесении протеазы на стадии приготовления производственных дрожжей вместо стадии брожения.
Рассчитан экономический эффект от внедрения разработанной технологии, который составил 476-596 руб. на 1000 дал спирта.
Апробация работы Основные положения работы докладывались на международных и всероссийских конференциях:
Всероссийской научно-практической конференции «Достижения науки и практики в деятельности образовательных учреждений», г. Кемерово, 2003
г.;
Международной научно-практической конференции
«Совершенствование технологии и оборудования производства алкогольной, слабоалкогольной и безалкогольной продукции и методов анализа их качества», г. Минск, 2004 г.;
Пятой Международной научно-практической конференции «О состоянии и направлениях развития производства спирта этилового из пищевого сырья и ликероводочной продукции», г. Москва, 2005 г.
6 1. Обзор литературы
Ферменты дрожжевой клетки и факторы, влияющие на 13 ферментативную активность дрожжей
Среди биологически активных веществ, участвующих в различных биохимических процессах живой клетки, чрезвычайно важную роль играют биокатализаторы /40,46,104/.
Дрожжевая клетка, попадая в питательную среду, должна обеспечить себя механизмами, посредством которых она могла бы непрерывно воссоздавать внутриклеточные соединения из простейших молекул.
Биохимические реакции, протекающие в дрожжевой клетке, катализируются многочисленными ферментами - оксидоредуктазами, трансферазами, гидролазами, лиазами и изомеразами.
Ферменты дрожжей подразделяются на внутриклеточные (мальтаза, ферменты спиртового брожения, дыхания и др.) и внеклеточные. В среду клетка выделяет ферменты, предназначенные для начальных этапов использования каких-либо субстратов, и поэтому внеклеточные ферменты чаще всего относятся к классу гидролаз. Некоторые ферменты дрожжей (например, инвертаза, пептидазы, протеиназы) локализуются внутри клетки, но могут выделяться в окружающую среду.
Процесс спиртового брожения катализируется двенадцатью у ферментами, объединенных одним названием - «зимаза». Кроме них три фермента мальтаза, инвертаза и мальтотриаза участвуют в подготовительной стадии брожения, а именно в образовании моносахаридов из дисахаридов (сахарозы, мальтозы) и из трисахаридов (мальтотриозы) сусла, непосредственно не сбраживаемых дрожжами /55,46/.
Расщепление сахарозы на глюкозу и фруктозу происходит под действием Р-фруктофуранозидазы (сахаразы, инвертазы). Этот фермент всегда присутствует в клетке независимо от наличия сахарозы в сусле. Инвертаза сосредоточена, главным образом, с внешней стороны мембраны клетки. Благодаря этому гидролиз сахарозы происходит прежде, чем она проникает в клетку. Активность фермента проявляется с первых часов брожения, достигая максимума на вторые, третьи сутки. - v Мальтаза локализуется в цитоплазме. Дрожжевая клетка, используя этот фермент, гидролизует мальтозу в глюкозу. Мальтазная активность дрожжей изменяется в процессе брожения. В первые дни брожения содержание мальтазы резко уменьшается, что связано с использованием в этот период сахарозы и гексоз. Далее происходит увеличение активности фермента, после чего она постепенно, но непрерывно снижается /46,54,55/. Ферменты дрожжей, ответственные за сбраживание глюкозы и фруктозы всегда находятся в клетках и не зависят от присутствия в среде их субстрата.
Содержание таких важных ферментов как мальтаза, а также гексокиназа и енолаза, значительно выше у спиртовых дрожжей. Активность других ферментов брожения - триозофосфатдегидрогеназы, фосфоглицеромутазы, пируватдекарбоксилазы - выше у пивных дрожжей.
В целом, чем выше зимазная и мальтазная активность засевных дрожжей, тем более активно идет процесс брожения и лучше технологические показатели бражки /23/. Активность ферментов в большей мере определяется содержанием в сусле углеводов, аминокислот, минеральных веществ и витаминов, а также у соотношением сбраживаемых углеводов и растворимого азота сусла /42,46,55/. Способность к сбраживанию у дрожжей увеличивается с повышением температуры, однако, при этом усиливается активность не всех ферментов, участвующих в сбраживании углеводов. Так, с повышением температуры активность таких ферментов как мальтаза, мальтотриаза, фосфофруктокиназа, пируваткиназа, пируватдекарбоксилаза, алкогольдегидрогеназа - растет, а гексокиназа, глицерокиназа -уменьшается /4,20,34,42,46/. С увеличением содержания кислорода в сусле активность ряда ферментов (например, фосфофруктокиназы и фосфоглицерокиназы) повышается, в то время как активность других ферментов А (алкогольдегидрогеназы) снижается /46,55,68,104/. Мальтазная и мальтотриазная активность зависит и от количества вводимых в сусло дрожжей. С увеличением нормы дрожжей активность этих ферментов снижается. По-видимому, синтез мальтазы связан с клеточным делением и подавляется в системах брожения, в которых размножение клеток ограничено /12,26,54/.
Небольшие изменения в содержании кислорода в сусле существенно влияют на активность ферментов дыхания пивных дрожжей. Образование побочных продуктов брожения также связано с активностью различных ферментных систем. В этих процессах участвуют ферменты спиртового брожения и ряд специфических ферментов /32,42, 46, 55,104/.
Побочные и вторичные продукты метаболизма дрожжей оказывают существенное влияние на качество продуктов брожения. Основные из них: высшие спирты, альдегиду, кислоты, эфиры, дикетоны, сернистые соединения, образуются как в результате диссимиляции углеводов, так и вследствие обмена аминокислот. Механизм их образования и превращения очень сложен, их накопление зависит от ряда факторов среды, вида и "у активности дрожжей. Их изучением занимались отечественные и зарубежные ученые/4,5,7,8,12,20,25,32-36,42,46,53,54,55,92/.
Способы интенсификации спиртового брожения
Для повышения активности дрожжей и улучшения их качества широко используются различные технологические и физические методы воздействия. Установлено стимулирующее влияние на активность дрожжей-сахаромицетов отрицательно заряженных ионизированных частиц -аэроионов и гидроионов при использовании сильных электрических полей и генерируемых ими заряженных частиц, возникающих в области коронного заряда. Электронно-ионная обработка позволяет интенсифицировать производственный процесс без изменения действующих технологических режимов и введения каких-либо добавок химической природы, что важно для получения продукта высокого качества.
Экспериментально доказано наличие связи между режимами электронно-ионной обработки дрожжей и поверхностным потенциалом их клеток. Установлено, что увеличение поверхностного потенциала клеток сопровождается повышением бродильной активности дрожжей. На основании проведенных исследований предложен экспресс-метод определения эффективности воздействия электронно-ионной обработки на дрожжи/71/.
Также разработан способ активации пивных дрожжей путем обработки посевного материала гидроионами положительной полярности. Гидроионы MgS04 и ZnS04 позволяет повысить бродильную активность дрожжей в 1,5 и 1,4 раза соответственно. При этом выход биомассы увеличивается на 18-30 % относительно контроля и улучшается флокуляционная способность дрожжей.
Обработку дрожжей гидроионами ZnS04 следует проводить при силе ионного тока 150 мкА в течение 120 сек. Бродильная активность дрожжей при данных условиях повышается на 29 % относительно контроля, а обработка посевного материала отрицательными аэроионами в условиях разрежения увеличивает бродильную активность дрожжей на 38 % /56/.
Установлено стимулирующее действие разрежения на бродильную активность дрожжей без изменения их способности к синтезу биомассы. Вибротурбулизация культуральных сред при производстве хлебопекарных дрожжей резко повышает концентрацию в них растворенного кислорода, что, в свою очередь, приводит к интенсификации роста культуры. Кроме того, происходит частичное окисление и минерализация продуктов жизнедеятельности со снижением БПК и ХПК бражки наряду с повышением ее зольности /56/.
Механические виды воздействия применяются в спиртовой промышленности для активации ферментов солода. Способ обработки солодового молока механическими импульсами высокой частоты (75 тыс. в минуту) с большим перепадом давления позволяет увеличить активность амилолитических ферментов /45/.
Имеются работы по использованию ультразвука для активизации дрожжей. Показана эффективность комбинированной обработки дрожжей ультразвуковыми волнами (частота 19-21 кГц) и ультрафиолетовыми лучами. Установлено, что такая обработка позволяет значительно интенсифицировать процесс брожения и обогатить продукт витамином Дг /45/. Небольшие дозы ультразвука (0,72 кДж/см) не влияют на рост культуры или незначительно его стимулируют. Повышение дозы до 2,16-3,6 кДж/см оказывает ингибирующее действие на биосинтез. Наблюдаются нарушения согласованности процессов синтеза белка. При исследовании влияния на активность дрожжей высокочастотной и ультрафиолетовой обработки установлено, что высокочастотная обработка способствует в большей степени повышению активности дрожжей, чем ультрафиолетовое облучение /41/.
В настоящее время разработан и внедрен способ подготовки питательной среды для спиртовых дрожжей с использованием электроактивирования. Сущность способа заключается в обработке сусла в анодной зоне диафрагменного электроактиватора. Такая обработка питательной среды позволила увеличить осахаривающую активность сусла, снизить рН до 3,2-3,6, провести обеззараживающее действие. Накопление дрожжей в таком сусле увеличилось в 1,8-2,3 раза. Дрожжегенерирование заканчивалось за 14-16 часов. Применение электроактивирования для питательных сред позволило исключить расход пара и кислоты, значительно ускорить процесс приготовления сусла /44/.
Одним из наиболее доступных способов регуляции метаболизма дрожжей является повышение температуры на стадии главного брожения. Однако поддержание повышенной температуры в ходе всей этой стадии приводит, наряду с интенсификацией брожения, к усиленному образованию побочных метаболитов. Поэтому исследована возможность стимулирования жизнедеятельности пивных дрожжей путем повышения температуры только в начальной стадии культивирования /30,54/.
Обработка семенных дрожжей при брожении под давлением и без избыточного давления приводит к заметному ускорению брожения /59/. Изучение влияния излучений видимой области спектра в интервале длин волн 410-610 нм на дрожжи показало, что наибольший стимулирующий эффект на метаболизм клеток оказывает свет с длиной волны 410 нм интенсивностью 0,12-0,20 Вт/м при двухчасовой экспозиции. При этом существенно интенсифицируется процесс потребления дрожжами из среды аминного азота и углеводов. Фотоактивация значительно улучшает технологические свойства пивных дрожжей: на 20-40% сокращается время генерации клеток, на 20-25% увеличивается их бродильная активность, в 1,3-1,4 раза повышается скорость сбраживания сусла /54,104/.
Для снижения потребности дрожжей в кислороде предложен способ, основанный на аэрации суспензии семенных дрожжей в молодом пиве (1:2), которое содержит продукты деградации Сахаров, являющиеся эффективными источниками углерода для стеринообразования у дрожжей. С целью предотвращения «дыхательной адаптации» клеток продолжительность аэрации сокращена до минимума (20-30 мин.) и после нее проводится 2-4 ч инкубация дрожжей без доступа воздуха. Предложенный способ позволяет увеличить содержание стеринов в семенных дрожжах в 6-7 раз и повысить в их составе (на 12-15 %) долю эргостерина - конечного продукта стеринообразования у дрожжей. Бродильная активность дрожжей по окончании обработки превышает таковую у исходных клеток на 20-25% /67,68/.
Исследование закономерностей утилизации азотистых веществ спиртовыми дрожжами
Полноценное азотистое питание является важным фактором регулирования процессов размножения дрожжей и их физиологической активности. Как известно из литературных данных, более предпочтительным источником азотистого питания являются аминокислоты, которые потребляются дрожжами из среды путем прямой ассимиляции /46,69/.
В среде, содержащей недостаточное количество аминокислот, процесс размножения дрожжей замедляется, накапливаются повышенные концентрации высших спиртов.
В настоящее время нет однозначных данных о количественной потребности дрожжей в азотистых веществах.
Задачей данного этапа исследования является определение основных закономерностей влияния азотистого питания спиртовых дрожжей на их жизнедеятельность, в частности, оценка влияния концентрации аминного азота на процесс накопления дрожжевых клеток.
Для исследования использованы дрожжи расы 985 Т, выращенные на зерновом сусле по технологии, принятой на заводе.
Концентрацию аминного азота корректировали путем внесения в сусло аминокислоты глицин до содержания аминного азота 35, 40, 45 мг/100 см3 и различное количество засевных дрожжей: 10, 15, 20 % к объему. Процесс размножения вели в течение 12 часов, контролируя концентрацию дрожжей.
Как видно из рисунков, при внесении дополнительного азотистого питания скорость размножения дрожжей возрастает, к концу процесса культивирования во всех опытных образцах концентрация клеток была выше.
При начальном засеве 10 млн. клеток/см среды к концу размножения общая концентрация клеток при разном уровне аминного азота была примерно одинакова, с увеличением засева конечный прирост дрожжей меньше в контроле по сравнению с опытными образцами. Очевидно, для активного размножения дрожжей с увеличением начальной концентрации клеток ощущается недостаток азотистого питания, необходимого для почкования. Как следует из приведенного уравнения, увеличение концентрации аминного азота в среде способствует размножению клеток дрожжей.
Потребность дрожжей в азотистом питании связана, главным образом, с синтезом белка в процессе их размножения и с синтезом ферментных систем, поддерживающих необходимый уровень энергетического метаболизма при утилизации некоторых видов углеводного компонентов. В сусле, осахаренном микробными ферментными препаратами в относительно небольших концентрациях присутствуют ди- и трисахариды. Это позволит снизить потребность дрожжевых клеток в ассимилируемом азоте, так как нет необходимости синтезировать транспортные системы для утилизации мальтозы и мальтотриозы. Кроме того, потребность в азотистом питании для синтеза биомассы зависит от интенсивности размножения дрожжей, которая снижается при увеличении засева клеток.
Как следует из приведенных результатов, с увеличением засева дрожжей возрастает кратность прироста, однако, не пропорционально количеству введенных клеток. Во всех образцах с внесением глицина кратность прироста выше, чем в контроле, хотя также не пропорционально количеству внесенного азотистого питания. Наибольшее влияние увеличение концентрации аминного азота на размножение клеток оказывает при начальном засеве 10 млн. кл./см3.
Из представленных данных видно, что с увеличением концентрации усвояемого азота при равном засеве дрожжевых клеток прирост биомассы увеличивается, однако, не линейно. В то же время, при увеличении засева и одинаковой концентрации аминного азота прирост уменьшается. Это связано, в первую очередь, с тем, что при большом засеве дрожжей тормозится их размножение и соответственно уменьшается их потребность в азотистых веществах.
Активизация жизнедеятельности спиртовых дрожжей путем внесения азотсодержащих добавок
Исследование влияния азотистого питания на размножение дрожжей показало необходимость обогащения дрожжевого сусла аминокислотами, благодаря чему происходит ускорение размножения дрожжей, улучшение их физиологического состояния, увеличение прироста дрожжевых клеток в процессе дрожжегенерирования.
Дополнительное обогащение дрожжевого сусла целесообразно проводить добавками, содержащими смесь аминокислот, так как дрожжи в процессе размножения потребляют различные аминокислоты с разной скоростью и нуждаются в определенном наборе аминокислот для поддержания аминокислотного пула.
Влияние тепловой активации в различных средах на содержание клеток с гликогеном в дрожжах Как показали приведенные данные, активация в фильтрате барды положительно сказывается на состоянии дрожжей. Сыворотка как среда активации менее предпочтительна, так как увеличивается содержание мертвых клеток, уменьшается число почкующихся клеток и клеток с гликогеном даже по сравнению с обработкой водой. Вероятно, это связано с тем, что в сыворотке присутствуют коллоидные соединения, в частности белки, молочный жир, которые ухудшают контакт клетки со средой. Кроме того, технические возможности использования сыворотки на спиртовом заводе ограничены, тогда как фильтрат барды является естественным отходом производства.
Для оценки бродильной активности могут служить зимазная и мальтазная активность дрожжевых клеток. Как видно из рисунка, активация дрожжей с добавлением барды позволяет улучшить и ферментативную активность дрожжей. Увеличение зимазной активности составляет 2,8 раза, мальтазная активность возросла в 3,1 раза.
Это свидетельствует о благоприятном влиянии обработки на дрожжи, так как увеличивается их активность и улучшается физиологическое состояние культуры.
Предположительным механизмом воздействия фильтрата барды на дрожжи может быть влияние минеральных веществ, витаминов и аминокислот на ферменты зимазного комплекса дрожжей. Известно, что большинство ферментов цикла брожения содержат металлы, витамины и витаминоподобные вещества в качестве простетических групп.
. Изменение мальтазной активности дрожжей при обработке в различных средах С помощью дрожжей, активированных выдержкой в фильтрате барды при температуре 35 С 20 минут при соотношении дрожжи:барда 10:1, провели сбраживание осахаренного сусла при засеве 10 % от объема среды. Контроль 1 - дрожжи исходные, в качестве контроля 2 использовали дрожжи, выдержанные при тех же параметрах, но в воде, чтобы исключить влияние теплового воздействия.
Можно предположить, что обработка бардой повышает устойчивость клеток дрожжей к ингибирующему действию продуктов обмена дрожжей за счет ассимиляции ими азотистых, ростовых веществ, а также частично липидных компонентов из автолизованных дрожжей, содержащихся в барде. Из литературы известно, что цитиплазматическая мембрана дрожжевых клеток состоит, главным образом, из липидов. Дополнительное поглощение липидных компонентов из барды позволяет укрепить липидную мембрану клеток.
Положительно также сказывается тепловой прогрев дрожжевой суспензии на процесс брожения и размножения дрожжей. Эффект тепловой активации сказывается, в первую очередь, на ферментных системах дрожжевых клеток, что показано работами Лисюк Г.М. для пивных дрожжей /54/.
Таким образом, активация дрожжей фильтратом барды позволяет увеличить их бродильную активность, активности ферментных систем дрожжей, стимулирует размножение дрожжевых клеток в процессе брожения в пределах допустимого уровня и ускорить процесс сбраживания сусла на 8-12 часов.
В производственных условиях внесение фильтрата барды можно предусмотреть в дрожжанке после перекачивания производственных дрожжей в бродильный чан. Количество дрожжей составляет 500 дм , количество фильтрата барды 50 дм3. Для обработки необходимо использовать свободную дрожжанку. При отсутствии свободной емкости можно барду вносить в дрожжевое сусло одновременно с осахаривающим - ферментом дистиллаза для дополнительной стерилизации.
Для оценки влияния активации дрожжей в фильтрате барды на характеристику зрелой бражки и состав побочных продуктов брожения проведены исследования технологических показателей бражки и хроматографический анализ дистиллята бражки.
Сумма побочныхи вторичныхпродуктов 4806,3 4474,0 3894,5 Общее количество побочных продуктов в опытном образце ниже, чем в контрольных. Несколько выше в опытном варианте содержание ацетальдегида и этилацетата по сравнению с контрольными образцами. Однако накопление этих продуктов брожения зависит от активности дрожжей, уровня аэрации, при повышенной скорости брожения и других факторов, на их уровень не влияет состав среды. Тогда как содержание высших спиртов: пропанола, изобутанола, амиловых спиртов, в первую очередь определяется уровнем обменных процессов, связанных с размножением дрожжей. Поэтому, пониженное их содержание является следствием более низкого уровня азотистого обмена клетки со средой. Поэтому можно сделать вывод о том, что активирование дрожжей фильтратом барды позволит сократить их потребность в азоте на стадии брожения и уменьшить образование соответствующих метаболитов.
